陸地棉GhLEA3基因的克隆及其響應低溫脅迫表達分析

王俊娟，陸許可，陰祖軍，王德龍，王帥，穆敏，陳修貴，郭麗雪，樊偉麗，陳超，葉武威

（中國農業(yè)科學院棉花研究所/ 棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

干旱、低溫和高鹽分等非生物脅迫嚴重影響作物生長發(fā)育，是造成世界范圍內作物減產的主要因素[1]。這些非生物脅迫也是制約棉花生產的主要逆境因子。植物在長期的進化過程中，形成了各種不同的適應性生理生化機制，在遭遇逆境脅迫時細胞內會發(fā)生一系的生理、生化以及基因表達的變化[2]，會產生一系列具有保護功能的蛋白來維持其正常代謝活動。挖掘與棉花非生物逆境脅迫相關的功能基因，對開展棉花抗逆分子育種具有重要意義。

胚胎發(fā)育后期豐富蛋白（Late embryogenesis abundant proteins，LEA 蛋白） 是1 類重要的植物細胞脫水保護蛋白[3-4]，是1 種水溶性蛋白，最早在棉花中被發(fā)現(xiàn)[5-6]，1986年首次被Galau 等[7]命名。根據(jù)LEA 蛋白保守結構域可以將其分為不同的家族，其中第3 組LEA 蛋白家族（LEA3）具有多拷貝11 個氨基酸（TAQAAKEKAGE）重復基元序列特征[8]。LEA3 蛋白通過這11 個氨基酸殘基序列形成的兩性α- 螺旋與其他蛋白質或細胞膜結合，從而保護蛋白或細胞膜的活性，減緩逆境脅迫對細胞的傷害[9]；還可以作為分子伴侶阻止因水分脅迫導致的蛋白間的變性聚集[10]。同時，低溫、干旱和高鹽分等非生物脅迫均可以顯著誘導LEA3 蛋白的積累。近年來，對LEA3 在多種植物中的功能已有大量報道：在干旱脅迫條件下，LEA3 可以保護乳酸脫氫酶的活性[11]；在缺少LEA3 蛋白的情況下，小麥根系受到干旱脅迫傷害后無法恢復正常[12]；在耐鹽性較強的印度水稻中LEA3 蛋白的積累量顯著高于鹽敏感型植株[13]；小麥與黑麥中葉綠體中LEA3 蛋白的積累可以明顯提高植株抗冷性[14]。轉基因研究表明，在水稻中過量表達大麥的LEA3 蛋白（HVA1）可以顯著提高其耐鹽性和抗旱性[15]；在酵母中過量表達小麥TaLEA3 等基因可提高酵母耐高滲透脅迫、耐鹽和抗凍能力[16]；等等。但有關LEA3 在棉花抗冷中的作用報道相對較少。因此，本研究擬克隆棉花GhLEA3 基因，并分析其編碼蛋白的結構特性，對其進行系統(tǒng)進化分析；檢測其在受低溫脅迫前后葉片中的表達量；構建植物表達載體，進行亞細胞定位，并對轉GhLEA3 基因擬南芥后代的抗冷性進行研究，預測其在抗冷性中的可能功能。

1 材料與方法

1.1 陸地棉試驗材料及其培養(yǎng)和逆境處理

本試驗所用棉花材料為陸地棉遺傳標準系TM-1，由中國農業(yè)科學院棉花研究所抗逆鑒定課題提供。2017年5 月在中國農業(yè)科學院棉花研究所抗逆鑒定實驗室恒溫光照生長箱中進行育苗，采用沙培法育苗（28 ℃，光照14 h、黑暗10 h），正常水分條件（沙土相對含水量約為23.00%）下進行棉花的培養(yǎng)。

1.2 擬南芥試驗材料

本試驗所用擬南芥野生型（Col-0 生態(tài)型）由中國農業(yè)科學院棉花研究所棉花抗逆鑒定課題保存。

1.3 棉花RNA的提取和GhLEA3基因克隆

利用北京艾德萊生物科技有限公司生產的EASYspinPlus 植物RNA 快速提取試劑盒對以上所取材料進行RNA 提取，利用Nanodrop2000 核酸分析儀測定總RNA 的濃度和純度，同時用10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。利用PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa，China）將RNA反轉錄合成第1 鏈cDNA，以反轉錄獲得的棉花cDNA 為模板，利用Primer Premier5.0 軟件設計特異引物，上游引物為GhLEA3-F：5′-ATGGCGACAAGGCAAGAGAA-3′，下游引物為GhLEA3-R：5′-TCACAGATTGGTTTTGTCCGA-3′，擴增GhLEA3 全長cDNA 序列。將目的基因與載體連接、 轉化培養(yǎng)以及進行聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction,PCR），并且測序驗證。所用的PCR 程序、 擴增產物檢測和純化均參考王俊娟等[17]的方法。測序由蘇州金唯智科技有限公司北京分公司完成，其他試驗均在棉花生物學國家重點實驗室完成。

1.4 棉花GhLEA3基因的生物信息學分析

1.4.1棉花GhLEA3 蛋白質的等電點、相對分子質量、磷酸化位點分析和功能結構域的預測。利用在線蛋白質結構域數(shù)據(jù)庫SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）、InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）對GhLEA3 蛋白質結構域進行預測；利用Protparam（http://web.expasy.org/protparam/） 分析蛋白質的相對分子質量和等電點；利用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）預測親疏水性，利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）分析蛋白的二級結構，利用NetPhos2.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/） 程序預測磷酸化位點。

1.4.2棉花GhLEA3 與其他幾個物種LEA3 的進化樹分析。在NCBI 上查找胡蘿卜（Daucus carota，P20075.1，DcLEA3），野生大豆（Glycine soja，A0A0B2SLH4，GsLEA3），葡萄 （Vitis vinifera，XP_002284002.1，VvLEA3），小麥（Triticum aestivum，AAA34267.1，TaLEA3），歐洲白樺（Betula pendula，CAA79329.1，BpLEA3），腎豆（Phaseolus vulgaris，ABA26579.1，PvLEA3），擬南芥（Arabidopsis thaliana，AAD20140.1，AtLEA3），大豆（Glycine max，AAD01431.1，GmLEA3），毛檉柳（Tamarix hispida，AHJ78644.1，ThLEA3），可可（Theobroma cacao，EOY08068.1，TcLEA3）10 個物種的LEA3 蛋白序列，括號里依次為物種的拉丁文、該物種LEA3 蛋白的GenBank 登錄號以及本研究對各物種LEA3 的統(tǒng)一命名。其中AtLEA3 是擬南芥中具有LEA3 典型結構，且在抗逆中起作用的1 個成員。

利用軟件MEGA6.06 對棉花GhLEA3 和前述10 個物種的LEA3 蛋白質序列進行聚類分析，使用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建、繪制系統(tǒng)進化樹。

1.5 GhLEA3亞細胞定位分析

利用網(wǎng)站（http://bioinfo.clontech.com/infusion）在線設計In-Fusion 引物（上游引物為InGh-LEA3-F：5'-CACGGGGGACTCTAGAATGGCGACAAGGCAAGAGAA-3'，下游引物為InGhLEA3-R：5'-AGGGACTGACCACCCGGGTCACAGATTGGTTTTGTCCGA-3'，下劃線標識酶切位點），以pBI121-GhLEA3 質粒為模板進行擴增。選擇限制性內切酶XbaⅠ和SmaⅠ對植物表達載體pBI121-GFP 進行雙酶切，采用In-Fusion 連接技術構建融合蛋白瞬時表達載體35S ∷Gh-LEA3-GFP，轉化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆進行測序，同時選用限制性內切酶BglⅡ和EcoRⅠ驗證插入位點后提取質粒。選用這2 個酶是因為BglⅡ酶切位點在目標基因Gh-LEA3 上沒有，而在表達載體上有，而EcoRⅠ酶切位點在表達載體上沒有，而在目標基因上有。亞細胞定位分析參考趙小潔等[18]的方法。

1.6 三葉期棉花幼苗低溫脅迫后GhLEA3的實時熒光定量分析

在三葉期對棉苗進行4 ℃處理（24 h），以仍在28 ℃條件下正常培育為對照（CK）。取倒一葉（3 個生物學重復），剪碎，放入液氮中速凍，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用Primer Premier5.0 設計GhLEA3 的熒光定量聚合酶鏈式反應 （Real time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）引物（上游引物GhLEA3-F：5'-TGGAATTGGGTTTGGAGCCG-3'，下游引物GhLEA3-R：5'-TCGCATGGTAATCGCCTCAC-3'），以Gossypium hirsutum Histone3（Accession No.：AF024716） 作為內參基因進行qPCR。PCR 程序：94 ℃30 s；94 ℃5 s，55 ℃34 s，72 ℃34 s，共40 個循環(huán)。所用儀器為ABI 7500 Real Time PCR System（ABI，美國）。qPCR 結果分析參考Afrin 等[19]報道的2－ΔΔCt方法。每個處理設3 個生物學重復、3 個技術重復。

1.7 轉GhLEA3基因擬南芥的遺傳轉化、檢測和抗逆性分析

遺傳轉化及后代檢測：采用農桿菌介導的花序浸染法[20]，用外源基因表達載體35S∷GhLEA3-GFP 轉化擬南芥野生型，利用含有卡那霉素的1/2 MS 培養(yǎng)基種植篩選轉基因種子；按張?zhí)毂猍21]方法進行培養(yǎng)和繁殖，對獲得的T3擬南芥種子按單株收獲，種植，采用CTAB 法[22]提取轉基因擬南芥和野生型擬南芥葉片的DNA。

利用Primer Premier5.0 軟件，在35S 啟動子序列設計上游引物（35S-F：5'-CCGGAAACCTCCTCGGATTC-3'），利用GhLEA3 基因設計下游引物（GhLEA3-R：5'-TGGTTTTGTCCGATCGATCA-3'），以野生型擬南芥（WT）作為陰性對照，含有GhLEA3 基因片段的質粒作為陽性對照，同時利用擬南基因Atactin2 為內標基因（上游引物Atactin2-F：5'-TTCCTCATGCCATCCTCCGTCTT-3'，下游引物Atactin2-R：5'-CAGCGATACCTGAGAACATAGTGG-3'） 對轉GhLEA3 基因擬南芥T3和野生型擬南芥葉片所提取的DNA 進行PCR 擴增。所用程序為94 ℃，5 min；94 ℃45 s，58℃45 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)；72 ℃10 min。利用10 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶并照相。

低溫萌發(fā)試驗：將轉GhLEA3 基因擬南芥T3種子和野生型（WT）在25 ℃（CK）常溫條件下和4 ℃低溫條件下分別進行萌發(fā)試驗。參考張?zhí)毂猍21]方法進行，將T3種子和WT 種子分別均勻點播于同一培養(yǎng)皿上，每板各播50 粒T3種子和WT 種子，共播6 板，其中3 板放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作為對照處理，另外3 板放入4 ℃冰箱中作為低溫處理，20 d 后調查萌發(fā)數(shù)，以擬南芥種子發(fā)白為萌發(fā)標準，計算萌發(fā)率。

轉基因擬南芥苗期葉片細胞膜透性測定：擬南芥苗移栽后在20 ℃條件下正常培養(yǎng)14 d，此時尚未抽薹。對其進行低溫處理：4 ℃處理24 h，并以處理0 h （仍為20 ℃條件培養(yǎng)） 為對照（CK），取全部葉片，剪碎，每重復稱2 g 左右，3個重復，放到5 mL 離心管中，加入2 mL 去離子水，混勻，測其電導率，具體測定方法參考王俊娟等[23]的方法。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用MS Excel 2003 進行數(shù)據(jù)處理和作圖；利用Stata 11.0 軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 GhLEA3 基因克隆

在前期的陸地棉低溫轉錄組試驗中，發(fā)現(xiàn)1個功能注釋為LEA3 蛋白的基因受4 ℃低溫脅迫后在棉花葉片中上調表達，推測其與棉花的抗冷性有一定的相關性。依據(jù)文獻報道[24-25]，在NCBI中搜索已知的擬南芥 （AAD20140.1）、 胡蘿卜（P20075.1）的LEA3 蛋白質序列，在棉花基因組計劃（Cotton Genome Project，CGP）網(wǎng)站（http://cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp） 進行blastp 比對，搜索到相似的蛋白序列，同時查找其對應的編碼序列，設計引物，以棉花TM-1 葉片的cDNA 為模板，擴增出完整的編碼序列（圖1），得到的閱讀框長度為1 218 bp，測序結果正確。

圖1 GhLEA3在陸地棉中的PCR擴增產物Fig.1 Products of PCR amplification of GhLEA3 gene from Gossypium hirsutum L.

2.2 棉花GhLEA3蛋白質的等電點、相對分子質量及二級結構域的預測和功能結構域分析

GhLEA3 蛋白質包含405 個氨基酸，預測相對分子質量為44.5 kDa，等電點5.88。對其序列進行分析，發(fā)現(xiàn)GhLEA3 蛋白中富含丙氨酸（15.8%）、賴氨酸（13.8%）和谷氨酸（12.1%），含少量色氨酸和異亮氨酸（0.5%），不含半胱氨酸、吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸（圖2A）；蛋白呈酸性，帶負帶荷，帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp＋Glu）為84個，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg＋Lys）為79 個；預測半衰期約為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為29.37，為穩(wěn)定蛋白。蛋白的親疏水性分析發(fā)現(xiàn)，蛋白中親水性氨基酸明顯多于疏水性氨基酸（圖2B），親水性平均系數(shù)為－1.302，屬親水性蛋白。SOPMA 分析結果（圖2C）表明：GhLEA3 蛋白的二級結構α螺旋 （Alpha helix） 包含286 個氨基酸殘基，占70.62%，組成該蛋白的主體結構；無規(guī)則卷曲（Random coil） 的氨基酸殘基有86 個，占21.23%；延伸鏈（Extended strand）包含17 個氨基酸殘基，占4.27%；β- 轉角（Beta turn）包含16 個氨基酸殘基，占3.95%。推測該蛋白的功能結構域主要由α 螺旋構成。

圖2 GhLEA3蛋白結構分析Fig.2 Protein structure analysis of GhLEA3 protein

SMART 和InterPro 分析表明，該氨基酸序列含有5 個功能結構域PF02987（LEA_4），分別位于第111 ～152、143 ～184、165 ～201、198 ～241、271～314 個氨基酸，表明該蛋白擁有LEA家族中第3 組成員的典型結構[26-27]，屬于LEA3類蛋白，命名為GhLEA3。

2.3 棉花GhLEA3蛋白的磷酸化位點預測

GhLEA3 基因所編碼蛋白共含有83 個磷酸化位點，其中含有36 個絲氨酸（Serine）磷酸化位點、31 個蘇氨酸 （Threonine） 磷酸化位點、16個酪氨酸（Tyrosine）磷酸化位點（圖3）。由此推測，GhGLEA3 蛋白的活性與其磷酸化調控關系密切。

圖3 棉花GhLEA3蛋白的磷酸化位點預測Fig.3 Protein phosphorylation sites prediction of GhLEA3 protein

2.4 棉花GhLEA3蛋白與其他植物LEA3蛋白的進化關系分析

對棉花GhLEA3 基因編碼的蛋白序列與其他物種LEA3 蛋白序列的進化樹分析結果（圖4）表明，11 個LEA3 蛋白質被分為2 類，小麥和腎豆LEA3 蛋白單獨聚為一類，其余9 個物種聚為第二類。第二類又可分為2 個亞類：棉花與擬南芥LEA 遺傳距離最近，同時與大豆、可可、歐洲白樺、胡蘿卜、葡萄LEA3 遺傳距離亦較近，為一個亞類；野生大豆、毛檉柳與棉花LEA3 遺傳距離比較遠，聚為另一個亞類。進一步分析表明，GhLEA3 與AtLEA3 的氨基酸序列相似性為52.6%，一致性為41.6%。

2.5 35S∷GhLEA3-GFP熒光表達載體的酶切驗證和亞細胞定位分析

挑選陽性克隆進行測序，目標序列比對結果正確。表達載體酶切驗證結果（圖5）表明，表達載體構建成功，將其命名為35S∷GhLEA3-GFP。

圖4 棉花GhLEA3蛋白與10個植物LEA3蛋白的進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of GhLEA3 protein and 10 LEA3 proteins of other plants

圖5 35S∷GhLEA3-GFP表達載體酶切驗證Fig.5 Enzyme digestion of expression vector 35S∷GhLEA3-GFP

通過瞬時表達系統(tǒng)對GhLEA3 蛋白的亞細胞定位顯示，對照pBI121-GFP 的綠色熒光分布在整個細胞中 （圖6A ～C），而35S ∷Gh-LEA3-GFP 融合蛋白的綠色熒光信號大多分布在液泡和小泡里（圖6D～F），推測GhLEA3 蛋白可能在液泡和小泡里發(fā)揮作用。這也說明該基因能夠正常表達，為下一步使用基因槍活體轉化擬南芥和棉花材料提供了理論依據(jù)。

2.6 低溫脅迫條件下GhLEA3基因在三葉期棉苗葉片中的表達

qPCR 分析結果（圖7）表明，與CK（28 ℃培養(yǎng)）相比，4 ℃低溫脅迫處理24 h 后，GhLEA3 基因在三葉期棉苗葉片中的表達水平提高近10倍，說明GhLEA3 基因在棉苗葉片響應低溫脅迫過程中起正調控作用。

2.7 轉GhLEA3基因擬南芥的抗卡那霉素篩選與分子檢測結果

圖6 棉花GhLEA3蛋白的亞細胞定位Fig.6 Sub-cellular localization of GhLEA3 protein

圖7 低溫脅迫條件下GhLEA3基因在三葉期棉苗葉片中實時熒光定量分析Fig.7 Expression of GhLEA3 gene in cotton leaf at the three-leaves stage under low temperature stress treatment by qPCR method

對收獲的20 個轉GhLEA3 基因擬南芥T1陽性植株后代分別進行抗卡那霉素篩選，至T2時黃化苗（野生型）已占很小比例，到T3時已無黃化苗，表明得到了純合的T3陽性植株（圖8），可以利用它們進行下一步的分子檢測和抗逆性試驗。

對轉GhLEA3 基因的擬南芥T3植株、 野生型擬南芥、pBI121-GhLEA3 質粒等進行擴增并檢測，發(fā)現(xiàn)轉基因植株T3-1、T3-2、T3-3、T3-9 和T3-11有明顯的大約1 218 bp 的特異條帶，在單株T3-7中該條帶稍弱，但也顯示正常，與陽性對照質粒中擴增出的目標條帶大小一致，在陰性對照野生型擬南芥植株中則無條帶（圖9），表明獲得了穩(wěn)定的轉GhLEA3 基因的陽性擬南芥植株。該結果證明抗卡那霉素篩選結果是可靠的。

2.8 轉GhLEA3基因擬南芥T3種子在低溫條件下的萌發(fā)試驗結果

在正常溫度（25 ℃）下，轉GhLEA3 基因擬南芥T3與野生型（WT）種子發(fā)芽率均達100%，沒有差異。4 ℃處理20 d 后轉GhLEA3 基因擬南芥T3種子的發(fā)芽率為95.92%，顯著高于野生型的（78.31%），說明轉GhLEA3 基因提高了擬南芥種子在低溫條件下的萌發(fā)能力。

圖8 卡那霉素對轉GhLEA3基因擬南芥的有效篩選Fig.8 Effective screening of transgenic Arabidopsis thaliana by GhLEA3 gene in kanamycin culture medium

圖9 轉GhLEA3基因擬南芥T3植株的PCR檢測Fig.9 PCR production detection of transgenic Arabidopsis T3 plants with GhLEA3 gene

2.9 轉GhLEA3基因擬南芥T3苗期葉片細胞膜透性

電導率測定結果（圖10）表明，野生型擬南芥（WT）葉片受低溫脅迫后，電導率比CK（20 ℃培養(yǎng)）極顯著上升，說明其葉片受低溫脅迫后細胞膜破裂，電解質大量滲漏；而轉GhLEA3 基因擬南芥T3葉片電導率與CK 差異不顯著，說明其細胞膜在低溫脅迫時受到了保護。由此推測，Gh-LEA3 蛋白在低溫脅迫條件下可能對葉片細胞膜起保護作用。

圖10 轉GhLEA3基因擬南芥T3和野生型葉片的電導率對比Fig.10 The conductivity rate of leaves from transgenic Arabidopsis thaliana T3 plants with GhLEA3 gene and its wild type

3 討論

GhLEA3 蛋白中富含丙氨酸、賴氨酸和谷氨酸（12.1%），色氨酸和異亮氨酸含量較少（0.5%），不含半胱氨酸，這與LEA3 蛋白由高度親水性氨基酸組成、富含賴氨酸和甘氨酸，缺乏半胱氨酸和酪氨酸的特征相似[28]，這種親水性使LEA3 蛋白可能保持細胞水分和防止其他蛋白凝聚或脫水[29]。但GhLEA3 蛋白中甘氨酸含量較少，很可能是物種間差異造成的。也可能正是LEA3 基因家族編碼產物結構的多樣性，造成了LEA3 基因家族功能的多樣性。二級結構預測顯示，GhLEA3蛋白的二級結構主要由α- 螺旋組成，高比例的α- 螺旋二級結構保障蛋白具有高度的柔性和流動性，可以在逆境條件下進行結構變異[9]，從而保護細胞結構，特別是嚴重脫水或冰凍時使膜系統(tǒng)免遭傷害，推測正是GhLEA3 蛋白的這些結構特點為其在低溫條件下提高轉基因擬南芥的萌發(fā)能力和葉片抗冷性奠定了結構基礎。

不同植物中LEA3 蛋白的亞細胞定位不同，如小麥中LEA3 定位于細胞質或細胞核[16]；擬南芥中的LEA3 蛋白COR15A 被定位于葉片的葉綠體基質中[30]；禾本科作物如黑麥、小麥、大麥中的類似LEA3 蛋白含有分類信號，使其易于定位葉綠體或線粒體中[14]；桑樹的LEA3 蛋白WAP27位于內質網(wǎng)中[31]，玉米的ZmLEA3 蛋白在細胞質和細胞核中發(fā)揮作用[32]；胡蘿卜中LEA3 蛋白DC8位于成熟種子的內膜系統(tǒng)、 細胞壁和液泡中[25]。LEA3 不同的亞細胞定位為LEA3 蛋白功能的多樣性提供了有力的證據(jù)。在本試驗中，亞細胞定位結果表明，GhLEA3 蛋白定位于液泡和小泡中，這與大麥的LEA3（HVA1）[33]、胡蘿卜LEA3蛋白DC8 定位相似[25]。Marttila 等[33]研究表明HVA1 定位在細胞質和液泡中，且HVA1 蛋白不能被糖基化，所以有可能利用1 種可變的、非內質網(wǎng)依賴的液泡途徑，促使液泡中的離子重新分配以阻止蛋白在脅迫條件下沉降；同時，冷處理或干旱脅迫能顯著增加發(fā)芽的大麥種子中HVA1 基因的表達。由此推測GhLEA3 蛋白在液泡中積累也有類似的功能，需要進一步挖掘驗證。雖然胡蘿卜中LEA3 蛋白DC8 的N 段沒有明顯的疏水結構，但試驗證明DC8 蛋白通過內質網(wǎng)- 高爾基體途徑運輸，隨后沉積在液泡或細胞壁中[25]。推測GhLEA3 蛋白有可能與大麥的HVA1 和胡蘿卜的DC8 有相似的功能，本試驗已初步驗證了GhLEA3 在抗冷方面的功能，其在抗旱中的作用還需進一步驗證。

聚類分析表明，GhLEA3 與擬南芥LEA3 蛋白AtECP63[24]親緣關系最近，同時與大豆、可可、歐洲白樺、胡蘿卜、葡萄的LEA3 蛋白親緣關系亦較近，推測它們可能有相似的功能。研究表明，AtECP63 參與擬南芥種子成熟和種子脫水脅迫過程[24]；而擬南芥中另一個LEA3 基因COR15A屬于冷誘導基因[4]，其在低溫條件下表達量與擬南芥品種的抗凍性呈正相關[34]，具有保護細胞膜的功能[35]，與棉花的LEA3 基因功能相似；另據(jù)Hsing 等[36]報道，大豆葉片組織中LEA3 的RNA水平在干旱或低溫脅迫條件下明顯提高，其功能也與棉花的LEA3 基因有部分相似之處；Goupil等[37]研究表明，胡蘿卜的LEA3 基因DC8 受脫落酸誘導。GhLEA3 是否具有其他功能還需進一步深入研究。

轉LEA3 基因可以顯著提高植物的耐低溫能力[16,32]。受低溫脅迫后，GhLEA3 基因在棉花葉片中上調表達，且轉GhLEA3 基因擬南芥葉片電導率比野生型極顯著降低。這些研究結果暗示GhLEA3 可能在響應低溫脅迫過程中保護葉片的細胞膜，這與玉米ZmLEA3 的功能有相似的地方。Liu 等[32]研究表明，過表達ZmLEA3 可以提高轉基因煙草和酵母的耐低溫能力，通過保護功能蛋白質結構以及與重金屬離子結合來保護植株。由此推測GhLEA3 基因所表達的蛋白在低溫條件下也有穩(wěn)定和保護細胞結構的功能。GhLEA3基因的抗冷功能還需在轉基因棉花上進行進一步的驗證。

4 結論

陸地棉GhLEA3 屬于典型的LEA3 家族成員，其編碼的蛋白質具有親水性；與擬南芥親緣關系最近，響應低溫脅迫，屬于冷誘導型基因。轉基因試驗證明GhLEA3 可以提高擬南芥在低溫條件的萌發(fā)能力及葉片的抗冷能力，推測Gh-LEA3 基因的表達對細胞膜起保護作用，是棉花適應低溫環(huán)境的重要調控因子。