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    分枝桿菌LY-1轉(zhuǎn)化植物甾醇產(chǎn)9α羥基雄烯二酮的發(fā)酵工藝優(yōu)化

    2019-04-09 11:50:54王向棟陳志蔚蔡兆培史勁松許正宏
    生物加工過程 2019年2期
    關(guān)鍵詞:甾醇氮源菌體

    王向棟,李 會(huì),陳志蔚,蔡兆培,史勁松,許正宏

    (1. 江南大學(xué)藥學(xué)院,江蘇無錫214122;2. 大豐市佳豐油脂有限責(zé)任公司,江蘇鹽城224100; 3.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫214122)

    甾體藥物是世界上僅次于抗生素的第二大類藥物[1-2],對機(jī)體的生命活動(dòng)起著非常重要的調(diào)節(jié)作用,例如糖皮質(zhì)激素是臨床應(yīng)用最為廣泛的抗炎藥物[3]。9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一類重要的甾體藥物中間體,因其獨(dú)特的9位羥基,可利用化學(xué)方法引入一個(gè)鹵族原子,同時(shí)在C11β-位上形成重要的功能羥基,由此衍生的鹵代類甾體藥物的抗炎、抗敏效果更加明顯,藥效時(shí)間也更為持久[4]。依靠微生物強(qiáng)大及復(fù)雜的酶催化體系特異制備甾體藥物中間體,可有效簡化工藝路線、提高催化選擇性和整體的收率[5-6]。因此,9α-OH-AD的微生物合成越來越受到關(guān)注[7-8]。

    在甾體的微生物轉(zhuǎn)化過程中,培養(yǎng)基中的各種組分以及培養(yǎng)條件對菌株的生長以及胞內(nèi)酶系的表達(dá)都具有很大的影響[9-10],因此,發(fā)酵工藝優(yōu)化是有效提高9α-OH-AD產(chǎn)量的途徑之一[11]。通過單因素實(shí)驗(yàn)考察培養(yǎng)基各組分對菌體轉(zhuǎn)化的影響,是目前常用的培養(yǎng)基組分優(yōu)化方式[12]。然而單因素實(shí)驗(yàn)往往無法綜合考慮各因素之間的相互作用,因此嘗試通過正交試驗(yàn)快速有效地確定各組分的最優(yōu)條件。正交試驗(yàn)是研究多因素多水平的一種方法,近年來采用正交試驗(yàn)對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化已取得了較好的結(jié)果[13-14]。

    課題組在前期獲得1株分枝桿菌(Mycobacteriumsp.)LY-1,能轉(zhuǎn)化植物甾醇制備9α-OH-AD,具有較強(qiáng)的羥化能力。在前期研究中,改進(jìn)了底物投料方式,目的產(chǎn)物9α-OH-AD的產(chǎn)量有明顯提升[15]。然而9α-OH-AD的產(chǎn)物得率仍存在一定的不足,本研究中,筆者以分枝桿菌LY-1作為出發(fā)菌株,通過單因素實(shí)驗(yàn)確定最適培養(yǎng)基的各個(gè)成分,并在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化,進(jìn)一步提高目的產(chǎn)物9α-OH-AD的得率,為后續(xù)的分子改造奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    分枝桿菌LY-1保存在江南大學(xué)微生物制藥與系統(tǒng)發(fā)酵研究室。植物甾醇(β-谷甾醇47.0%,菜油甾醇24.6%,豆甾醇15.5%,菜籽甾醇3.4%),湖北巨勝科技有限公司;9α-OH-AD(純度大于98.0%),上海瀚香生物科技有限公司;金龍魚牌大豆油、玉米漿,安徽華恒生物科技股份公司;酵母粉,美國Oxoid公司;其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 培養(yǎng)基

    PDA固體培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯 200、葡萄糖 20、瓊脂 20。

    種子培養(yǎng)基(g/L):NaNO35.4、酵母粉 15、甘油 2.0、(NH4)2HPO40.6。

    斜面培養(yǎng)基(g/L):NaNO35.4、酵母粉 15、甘油 2.0、(NH4)2HPO40.6、瓊脂 2.0。

    發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):NaNO35.4、玉米漿20、(NH4)2HPO40.6、植物甾醇15;pH 8.0。

    1.3 方法

    1.3.1 分枝桿菌LY-1的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化

    挑取單菌落接種于50 mL種子培養(yǎng)基中(250 mL搖瓶)。在往復(fù)式恒溫?fù)u床(30 ℃、120 r/min)中培養(yǎng)2~3 d,轉(zhuǎn)接至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(500 mL搖瓶)中,接種量為1%(體積分?jǐn)?shù)),置于搖床上,發(fā)酵周期為7 d,培養(yǎng)條件為30 ℃、120 r/min。

    1.3.2 分枝桿菌LY-1培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

    1)碳源優(yōu)化。分別選取可能有利于目的產(chǎn)物積累的糖類物質(zhì),包括糖蜜、麥芽糖、可溶性淀粉、果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和甘油,代替原發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源,以玉米漿作對照,同時(shí)保持培養(yǎng)基中的含碳水平不變(含碳水平為2%的玉米漿),按照1.3.1節(jié)中的方法進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化結(jié)束后用高效液相色譜(HPLC)測定產(chǎn)量。

    2)氮源優(yōu)化。分別用不同的氮源((NH4)2SO4、KNO3、NH4Cl、牛肉膏)代替原發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源,以NaNO3作對照,保持發(fā)酵培養(yǎng)基中含氮水平不變(含氮水平為0.54%的NaNO3)。

    3)磷酸鹽優(yōu)化。分別用不同的磷酸鹽(NH4H2PO4、KH2PO4、K2HPO4和NaH2PO4)代替原發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸鹽,以(NH4)2HPO4作對照,保持發(fā)酵培養(yǎng)基中的含氮量不變(含氮水平為0.06%的(NH4)2HPO4)。

    4)金屬離子優(yōu)化。分別選用ZnSO4、MgSO4、FeSO4、FeCl3、NiCl2、CuSO4、CaCl2和MnCl2等金屬鹽化合物,考察其對菌體轉(zhuǎn)化的影響。

    1.3.3 培養(yǎng)基組成的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    通過上述發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別選取最佳組分為考察對象,設(shè)計(jì)5因素4水平的正交試驗(yàn),以此來確定最佳培養(yǎng)基組成。

    1.3.4 培養(yǎng)基條件的優(yōu)化

    1)pH優(yōu)化。已知pH在7.5~8.5,更適合分枝桿菌轉(zhuǎn)化植物甾醇積累9α-OH-AD,因此選取了pH為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0這6個(gè)點(diǎn)進(jìn)行pH優(yōu)化。

    2)接種量優(yōu)化。原接種量為1%,因此選取了接種量為0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%和8.0%這6個(gè)點(diǎn)進(jìn)行接種量優(yōu)化。

    3)溫度優(yōu)化。已知溫度在28~30 ℃,更適合分枝桿菌轉(zhuǎn)化植物甾醇積累9α-OH-AD,因此選取24、26、28、30和32 ℃這5個(gè)溫度點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化。

    1.3.5 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分析方法

    1)分枝桿菌LY-1生物量的測定。在發(fā)酵過程中,取1 mL發(fā)酵液于無菌的2 mL EP管,在4 ℃、12 000 r/min條件下離心10 min,棄上清。分別加入1 mL乙酸乙酯,1 000 r/min充分振蕩15~30 min,在4 ℃下12 000 r/min離心10~15 min,棄上清。用乙酸乙酯洗2次,收集菌體,烘干至恒質(zhì)量,稱量。

    2)產(chǎn)物萃取。在發(fā)酵過程中,每12 h取500 μL發(fā)酵液于無菌的EP管,加入500 μL乙酸乙酯,1 000 r/min充分振蕩20~30 min。振蕩結(jié)束后,靜置分層,吸取上層乙酸乙酯于5 mL無菌EP管中。重復(fù)5次,將乙酸乙酯合并。室溫下用氮吹儀將其濃縮,若產(chǎn)物濃度較大則出現(xiàn)白色結(jié)晶。在裝有烘干產(chǎn)物的5 mL無菌EP管中,加入4 mL乙腈復(fù)溶后,HPLC檢測。

    3)利用HPLC法檢測產(chǎn)物。以外標(biāo)法進(jìn)行產(chǎn)物定量,色譜柱規(guī)格為Agilent TC-C18、4.6 mm×250 mm、5 μm,流動(dòng)相為乙腈和水(兩者體積比為7∶ 3),柱溫為30 ℃,紫外檢測波長為254 nm,流速為0.5 mL/min,進(jìn)樣量為10 μL。

    產(chǎn)物濃度的計(jì)算見式(1),產(chǎn)物得率的計(jì)算見式(2)。

    ρ1=A1ρ0D/A0

    (1)

    Y1=ρ1M2/ρ2M1×100%

    (2)

    式中:ρ1為產(chǎn)物質(zhì)量濃度(g/L),ρ0為標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度(g/L),ρ2為底物質(zhì)量濃度(g/L),A0為標(biāo)樣HPLC檢測譜峰面積,A1為產(chǎn)物HPLC檢測譜峰面積,Y1為產(chǎn)物摩爾得率,D為樣品的稀釋倍數(shù),M1為產(chǎn)物摩爾質(zhì)量,M2為底物摩爾質(zhì)量。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組成優(yōu)化結(jié)果

    分枝桿菌LY-1發(fā)酵培養(yǎng)基中僅含有玉米漿、NaNO3和(NH4)2HPO4,與已報(bào)道的培養(yǎng)基相比[16-17],除碳源成分不明確外,還缺少金屬離子等微量元素,因此嘗試通過單因素優(yōu)化確定最適組分。

    2.1.1 碳源優(yōu)化結(jié)果

    碳源是微生物生長所需的一類營養(yǎng)物質(zhì),以玉米漿作為氮源,但同樣含有少量成分可用作碳源[18]。而姜博等[19]發(fā)現(xiàn)玉米漿在培養(yǎng)基中作為碳源要優(yōu)于葡萄糖。因此碳源優(yōu)化時(shí),對2種情況進(jìn)行優(yōu)化和比較,結(jié)果見圖1。

    由圖1(a)可以看出:在不同碳源條件下,菌體的生物量都有不同程度提高,但目的產(chǎn)物9α-OH-AD的得率明顯降低。當(dāng)糖蜜替代玉米漿后,9α-OH-AD的得率僅達(dá)到24.2%,而其他碳源的產(chǎn)物得率基本都小于10%。可能的原因是糖蜜和玉米漿一樣屬于成分復(fù)雜的物質(zhì),其中還含有氨基酸、生物素等,因此當(dāng)玉米漿被糖蜜替代后,對菌體轉(zhuǎn)化的影響較少。而其他糖類替代后,由于培養(yǎng)基中成分單一,且沒有其他一些營養(yǎng)成分,導(dǎo)致菌體轉(zhuǎn)化能力下降。

    圖1 碳源對菌體轉(zhuǎn)化和生長的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on trans- formation and growth of strain LY-1

    由圖1(b)可知:在玉米漿存在的情況下,添加其他碳源物質(zhì)時(shí),產(chǎn)物得率基本都有所下降,而生物量則有明顯提高。如,添加葡萄糖后,產(chǎn)物得率最低,僅為18.5%,但生物量明顯提高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)副產(chǎn)物的積累增多,表明葡萄糖的添加雖然能提高菌體還原力[20],但葡萄糖并不利于9α-OH-AD的積累。同時(shí)比較發(fā)現(xiàn),添加可溶性淀粉后,產(chǎn)物得率有微弱提高,但考慮成本因素,1%的添加量相對于提高的程度,并不符合后期的應(yīng)用;而添加麥芽糖和糖蜜后,兩者的產(chǎn)物得率都明顯降低。因此,選擇最佳碳源為玉米漿。

    2.1.2 氮源優(yōu)化結(jié)果

    氮源是構(gòu)成微生物細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)的重要元素,主要分為無機(jī)氮源和有機(jī)氮源。分枝桿菌LY-1以NaNO3作為初始氮源,優(yōu)化研究選用常見的幾種氮源替代NaNO3,考察菌體轉(zhuǎn)化的影響,結(jié)果如圖2所示。

    圖2 氮源對菌體轉(zhuǎn)化和生長的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources for transformation and growth of strain LY-1

    從圖2可以看出:不同氮源替換后,菌體生物量與對照相比無顯著性差異。以KNO3作為氮源時(shí),9α-OH-AD的得率最高,達(dá)到39.5%,表明微生物能夠較快利用無機(jī)氮源;而蛋白胨和牛肉膏作氮源時(shí),菌體轉(zhuǎn)化效率較差,表明遲效性氮源不利于菌體利用,反而影響菌體的轉(zhuǎn)化能力;以NH4Cl作為氮源時(shí),產(chǎn)物得率最低,因?yàn)镹H4Cl是生理酸性物質(zhì),當(dāng)NH4+進(jìn)入代謝后,不利于菌體轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。因此,選擇KNO3作為最適氮源用于后續(xù)研究。

    2.1.3 磷酸鹽優(yōu)化結(jié)果

    磷作為生物大分子的主要成分之一,對于菌體能荷狀態(tài)的改變具有重要作用。培養(yǎng)基中的磷酸鹽雖然含量較少,但微生物對不同的磷酸鹽利用效果不盡相同,此外磷酸鹽還會(huì)影響發(fā)酵轉(zhuǎn)化過程中pH的調(diào)節(jié),因此有必要對其進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果見圖3。

    圖3 磷酸鹽對菌體轉(zhuǎn)化和生長的影響Fig.3 Effects of different phosphates for transformation and growth of strain LY-1

    由圖3可看出:添加NaH2PO4后菌體的轉(zhuǎn)化效果最好,9α-OH-AD的產(chǎn)物得率為42.1%;而添加K2HPO4后,產(chǎn)物得率與對照相比無顯著性差異。與氮源優(yōu)化相似,K+的添加都有利于產(chǎn)物的積累,但添加KH2PO4和NH4H2PO4后,菌體的轉(zhuǎn)化效率反而降低。因此,選擇NaH2PO4作為最適磷酸鹽。

    2.1.4 金屬離子優(yōu)化結(jié)果

    部分微量元素作為酶的輔基和激活劑,低濃度時(shí)對菌體生長和產(chǎn)物合成有促進(jìn)作用,高濃度時(shí)反而出現(xiàn)抑制作用??疾焯砑硬煌饘匐x子對菌體生長和轉(zhuǎn)化的影響,結(jié)果見圖4。

    由圖4可知:當(dāng)添加FeSO4、CaCl2和FeCl3時(shí),與對照相比,產(chǎn)物得率都有一定程度提高。其中Fe2+具有電子傳遞的作用,因此添加到培養(yǎng)基中對菌體轉(zhuǎn)化均有促進(jìn)作用,Ca2+有利于提高側(cè)鏈降解相關(guān)酶的活性。相反,添加Ni2+和Cu2+后,產(chǎn)物得率不足8%,表明其對菌體轉(zhuǎn)化有明顯的抑制作用。因此,選擇CaCl2和FeSO4作為無機(jī)離子的添加,進(jìn)行后續(xù)研究。

    2.2 正交試驗(yàn)確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基

    通過單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取玉米漿、KNO3、NaH2PO4、FeSO4和CaCl2為考察對象,設(shè)計(jì)5因素4水平的正交試驗(yàn),以確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成,正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1,正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表2。

    圖4 金屬離子對菌體轉(zhuǎn)化和生長的影響Fig.4 Effects of different metal ion for transformation and growth of strain LY-1

    表1 L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

    表2 L16(45) 正交試驗(yàn)分析表

    由表2可知:5種因素對產(chǎn)物得率的影響程度從大到小依次為CaCl2、NaH2PO4、KNO3、玉米粉、FeSO4,最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成為A2B1C4D3E1,即玉米漿30 g/L、KNO34.0 g/L、NaH2PO41.2 g/L、FeSO40.075 g/L及CaCl20.1 g/L。在此最適培養(yǎng)基條件下,植物甾醇投料質(zhì)量濃度為15 g/L,搖瓶轉(zhuǎn)化168 h,驗(yàn)證并重復(fù)3次,產(chǎn)物得率達(dá)到43.9%~44.9%。

    2.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

    2.3.1 接種量優(yōu)化結(jié)果

    在發(fā)酵過程中,接種量的多少會(huì)直接影響到菌體在培養(yǎng)基中生長繁殖的速度,因此,適當(dāng)?shù)慕臃N量是菌體發(fā)酵過程中的關(guān)鍵因素。當(dāng)接種量過小時(shí),菌體初始濃度過低,導(dǎo)致菌體生長緩慢,發(fā)酵周期增長,在相同的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)產(chǎn)率較低;而當(dāng)接種量過大時(shí),會(huì)導(dǎo)致菌體過快生長,發(fā)酵液中的營養(yǎng)消耗過快和溶氧不足,菌體容易衰老和自溶,影響菌體的轉(zhuǎn)化效率。考察接種量對發(fā)酵過程的影響,結(jié)果見圖5。

    圖5 接種量對菌體轉(zhuǎn)化的影響Fig.5 Effect of inoculum concentration on transformation of strain LY-1

    由圖5可以看出:當(dāng)接種量較低時(shí),菌體的轉(zhuǎn)化效率較低;隨著接種量的增加,產(chǎn)物得率也隨之增加;當(dāng)接種量為2%時(shí),產(chǎn)物9α-OH-AD得率達(dá)到46.2%,相對于初始的接種量1%,有一定程度地提高;而接種量超過2%時(shí),產(chǎn)物得率也隨之降低,表明高的接種量并不利于目的產(chǎn)物的積累。由于目的產(chǎn)物的積累與菌體生長相耦聯(lián),因此,過高的接種量縮短了對數(shù)期,一定程度上也減少了菌體適應(yīng)和轉(zhuǎn)化的時(shí)間。

    2.3.2 pH優(yōu)化結(jié)果

    在自然界中,微生物都有其最適的pH范圍。通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH,檢測發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中9α-OH-AD的含量,結(jié)果如圖6所示。

    圖6 pH對菌體轉(zhuǎn)化和生長的影響Fig.6 Effects of pH on transformation and growth of strain LY-1

    由圖6可知:分枝桿菌的初始pH為7.5~8.5時(shí),菌體的轉(zhuǎn)化效果較好,這與文獻(xiàn)[11,21]報(bào)道一致。同時(shí),生物量變化趨勢與產(chǎn)物積累相同,表明產(chǎn)物積累的差異是因?yàn)閜H直接影響菌體的生長,從而間接影響產(chǎn)物得率。當(dāng)初始pH為8.0時(shí),菌體的產(chǎn)物得率最高。因此,確定最適起始pH為8.0。

    2.3.3 溫度優(yōu)化結(jié)果

    溫度是影響菌體生長的重要因素,溫度對培養(yǎng)基中的溶氧量、發(fā)酵過程中各個(gè)酶系的反應(yīng)速率和目的產(chǎn)物的生成速率等有著重要的影響,還通過改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)來影響菌體生長和產(chǎn)物的合成。因此,研究溫度對菌體轉(zhuǎn)化過程的影響非常重要??疾鞙囟葘w轉(zhuǎn)化的影響,結(jié)果見圖7。

    圖7 溫度對菌體轉(zhuǎn)化的影響Fig.7 Effect of temperature on transformation of strain LY-1

    由圖7可以看出:隨著溫度的增加,轉(zhuǎn)化效率也隨之增加,當(dāng)溫度為30 ℃時(shí),9α-OH-AD的得率最高,而溫度超過30 ℃時(shí),目的產(chǎn)物的得率迅速下降,因此確定30 ℃為最適轉(zhuǎn)化溫度。

    綜上,最終確定適宜的發(fā)酵條件為pH 8.0,接種量2%,溫度30 ℃。在此條件下,產(chǎn)物得率達(dá)到46.2%~47.0%,比優(yōu)化前的結(jié)果提高了約22.1%,9α-OH-AD的產(chǎn)量最高達(dá)到5.21 g/L,與初始轉(zhuǎn)化工藝相比提高了22.1%,與目前國內(nèi)外微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇生成9α-OH-AD的研究相比[7,9],仍然處于較高水平。

    近年來,國內(nèi)外研究者通過解析3-甾酮-9α-羥基化酶[22-23],采用分子改造手段提高9α-OH-AD產(chǎn)量,其中袁家代等[24]在分枝桿菌中異源表達(dá)3-甾酮-9α-羥基化酶基因,構(gòu)建了產(chǎn)9α-OH-AD的菌株,但9α-OH-AD的含量僅為0.453 mg/L。王貴娥等[25]在分枝桿菌中強(qiáng)化表達(dá)了3-甾酮-9α-羥基化酶,9α-OH-AD的含量達(dá)到1.443 g/L,較出發(fā)菌提高了50.78%。

    對該菌株產(chǎn)9α-OH-AD的機(jī)制研究正在進(jìn)行之中,通過代謝工程等手段進(jìn)一步提高菌株LY-1生產(chǎn)9α-OH-AD的能力是后續(xù)工作的研究方向。

    3 結(jié)論

    對培養(yǎng)基各成分進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化,最終確定分枝桿菌LY-1轉(zhuǎn)化植物甾醇生成9α-OH-AD的最適培養(yǎng)基各組分。在此基礎(chǔ)上,對選擇的各組分進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化,最終確定最適培養(yǎng)基為玉米漿30 g/L、KNO34.0 g/L、NaH2PO41.2 g/L、FeSO40.075 g/L及CaCl20.10 g/L;而后,再次通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)條件,最終確定適宜的培養(yǎng)條件為pH 8.0,接種量為2%,溫度為30 ℃,在此條件下,9α-OH-AD的得率可達(dá)46.2%~47.0%。

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