L-苯丙氨酸制備的研究進展

韓建福，富敏霞，祝鈴鈺，贠軍賢

(浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州310032)

苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)，也稱作2-氨基-3-苯基丙酸，它是一種手性分子，有L-苯丙氨酸(L-Phe)和D-苯丙氨酸2種存在的手性形式，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。苯丙氨酸的分子式為C9H11NO2，分子量為165.19，外觀為無色至白色片狀晶體或結(jié)晶性粉末，苦杏仁味；室溫下不溶于乙醚，微溶于乙醇，溶于水；在空氣中受熱、光照穩(wěn)定。其中，具有生物活性的光學(xué)異構(gòu)體為L-苯丙氨酸，比旋度為-35.1°，等電點pI=5.48，熔點為283 ℃。L-Phe是一種重要的氨基酸，為人體必需的8種氨基酸之一，人和動物自身無法合成，必須從外界攝取[1]。

圖1 苯丙氨酸的2種對映異構(gòu)體Fig.1 Two enantiomers of phenylalanine

近年來，新型甜味劑阿斯巴甜的市場需求量日益增大，L-Phe作為生產(chǎn)阿斯巴甜的主要原料，其需求迅速增大[2-3]。同時，L-Phe也廣泛用于藥物活性化合物，如抗炎藥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)肽、HIV蛋白酶抑制劑和維生素B6等，在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到重視[4-5]。目前國內(nèi)生產(chǎn)的L-Phe已不能滿足需求，進口份額越來越大[6-7]。良好的市場需求前景，使國內(nèi)外越來越多地關(guān)注光學(xué)純L-Phe生產(chǎn)技術(shù)的研究。因此，本文中，筆者對化學(xué)合成法、酶促合成法和微生物發(fā)酵法獲得光學(xué)純L-Phe 的研究情況進行綜述。

1 化學(xué)合成法

Phe的化學(xué)合成法大體可以分為以下幾種：氰氨法、酰氨基丙二酸乙酯法、苯甲醛的縮合反應(yīng)法和α-取代基脂肪酸氨化法等[8-11]。這幾種方法最終得到的是苯丙氨酸的D型和L型手性混合體，要得到光學(xué)純L-苯丙氨酸，則需要對這些產(chǎn)物進行拆分。根據(jù)D/L-Phe拆分的手段和原理不同，常用的拆分方法主要包括萃取拆分法[12]、膜拆分法[13]、分子印跡技術(shù)[14-15]和酶拆分法[16-17]等。這幾年，很多學(xué)者重點研究了通過化學(xué)合成法直接得到手性L-Phe。吳建一等[18]以甘氨酸為起始原料，在保護氨基和羧基條件下合成苯亞甲氨基乙酸乙酯，然后經(jīng)鹵代烴在手性轉(zhuǎn)移催化劑的催化下反應(yīng)生成烴化產(chǎn)物，經(jīng)酸性水解得到L-Phe，產(chǎn)率40.1%。

化學(xué)合成法制備L-Phe生產(chǎn)路線長，使用有毒化學(xué)試劑原料，副產(chǎn)物多，環(huán)境污染大，且產(chǎn)物為光學(xué)消旋體，需進行光學(xué)拆分，成本高，因而逐漸被淘汰。而酶促合成法和微生物發(fā)酵法制備Phe往往能得到高光學(xué)純度的D-或L-Phe，過程更加環(huán)保，并利用葡萄糖、蔗糖、玉米漿和甘油等可再生資源[4,19-20]。近幾年，國內(nèi)外學(xué)者對Phe的研究已轉(zhuǎn)向酶促合成法和微生物合成轉(zhuǎn)化方法。

2 酶促合成法

酶促法合成L-Phe是利用微生物中的酶系高效專一地催化底物來合成L-Phe。酶法生產(chǎn)L-Phe主要有兩種方法：一是以苯丙酮酸為底物，利用苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶生成L-Phe；二是以肉桂酸為底物，利用苯丙氨酸解氨酶(PAL)生成L-Phe，此法不需要昂貴的輔酶系統(tǒng)或者再輔酶生系統(tǒng)[21]，因而應(yīng)用較為廣泛。

Anzawa等[22]利用弗氏檸檬酸桿菌的轉(zhuǎn)氨酶催化苯丙酮酸生成L-苯丙氨酸，目前已培養(yǎng)出能夠產(chǎn)生大量PAL的重組菌株。當(dāng)以L-谷氨酸為氨基供體時，在優(yōu)化的條件下肉桂酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%以上。而在生物轉(zhuǎn)化期間，細(xì)胞中的重組PAL活性迅速下降。因此，提高重組PAL的穩(wěn)定性對提高L-Phe產(chǎn)量是必需的。Zhang等[23]應(yīng)用中心復(fù)合設(shè)計優(yōu)化重組PAL穩(wěn)定性關(guān)鍵因素的綜合效應(yīng)，改善大腸桿菌中重組PAL的穩(wěn)定性，測試變量的最佳值為13.04 mmol甘油、1.87 mmol/L蔗糖、4.09 mmol/L二硫蘇糖醇和69 mmol/L Mg2+，在3次連續(xù)的生物轉(zhuǎn)化循環(huán)后，PAL最大活性保持為67.73 U/g；與最初的PAL活性相比，PAL活性的損失僅為22%；與對照實驗相比，PAL活性增強約23%(不含任何穩(wěn)定劑或添加劑)。在連續(xù)的生物轉(zhuǎn)化期間，PAL穩(wěn)定性顯著改善，可有助于工業(yè)規(guī)模的L-Phe生產(chǎn)。此外，Yue等[24]研究發(fā)現(xiàn)一定量的β-環(huán)糊精有利于提高PAL的活性，進而提高L-Phe的生產(chǎn)率。

酶促合成法生產(chǎn)工藝簡單、產(chǎn)品光學(xué)純度高、純化步驟簡便且生產(chǎn)能力較強，是目前工業(yè)化生產(chǎn)L-Phe的主要方法之一。然而，近年來，由于底物和酶等主要原料成本高、來源有限以及反應(yīng)過程中酶穩(wěn)定性差等缺點，酶促合成法生產(chǎn)L-Phe的規(guī)模也受到了很大制約。

3 微生物發(fā)酵法

微生物具有生長繁殖迅速可控、原料廉價易得、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小及生產(chǎn)周期短等優(yōu)點，成為L-Phe合成的研究熱點。微生物利用碳源和氮源進行發(fā)酵，可以大量生產(chǎn)L-Phe。用于合成苯丙氨酸的微生物菌株有：枯草芽孢桿菌、粘紅酵母菌、短桿菌、假單胞菌、大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌以及一些工程菌等[25-30]，目前工業(yè)上發(fā)酵生產(chǎn)L-苯丙氨酸的菌株主要為大腸桿菌。

3.1 發(fā)酵法合成機制

微生物中，L-Phe的合成代謝途徑是從葡萄糖開始，包括以下3個途徑[28,30-32]：中心碳源代謝途徑、莽草酸途徑和分支酸途徑。葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和四磷酸赤糖(E4P)2個前體物質(zhì)，它們首先在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶(DAHPS)催化下縮合成3-脫氧-D阿拉伯庚酮酸糖-7磷酸(DAHP)進入莽草酸途徑，在經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)到達(dá)L-Phe合成途徑的分支點——分支酸。一方面分支酸在鄰氨基苯甲酸合酶作用下進入L-色氨酸(L-Trp)合成途徑。另一方面分支酸經(jīng)分支酸變位酶(CM)生成預(yù)苯酸，預(yù)苯酸經(jīng)預(yù)苯酸脫水酶(PDT)作用生成L-苯丙酮酸，再經(jīng)氨基轉(zhuǎn)移酶(AT)作用生成L-Phe；或預(yù)苯酸經(jīng)預(yù)苯酸脫氫酶和氨基轉(zhuǎn)移酶進入L-酪氨酸(L-Tyr)合成途徑。谷氨酸棒桿菌中DAHPS調(diào)控機制要比大腸桿菌復(fù)雜得多，DAHPS分別由aroF和aroG這2個基因編碼，其中，aroF基因編碼的AroF酶主要受到L-Tyr反饋抑制，aroG基因編碼AroG酶會受到L-Phe的反饋抑制，同時在CM酶的存在下，受到預(yù)苯酸和分支酸的協(xié)同反饋抑制[33-34]。在谷氨酸棒桿菌中，由csm和pheA2個基因編碼CM、PDT的2個酶分別催化分支酸生成預(yù)苯酸，進而生成苯丙酮酸[35]，PDT酶受到產(chǎn)物L(fēng)-Phe的反饋抑制[36-37]。大腸桿菌L-Phe的合成途徑如圖2所示。

圖2 大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中L-Phe合成代謝途徑Fig.2 L-phenylalanine biosynthesis pathway in E.coli (a) and C. glutamicum (b)

由圖2可知：L-Phe合成途徑內(nèi)存在3個節(jié)點[38-39]：①2個前體物質(zhì)合成DAHP節(jié)點，在大腸桿菌調(diào)控機制中，DAHP由中心碳源途徑過渡到莽草酸途徑，它的量決定了所有下游代謝產(chǎn)物的流量；②分支酸向L-Trp合成節(jié)點，在此節(jié)點抑制分支酸向L-Trp方向流動，即可促進分支酸向L-Tyr和L-Phe方向流動；③預(yù)苯酸向L-Tyr和L-Phe分支節(jié)點，在此節(jié)點通過抑制預(yù)苯酸向L-Tyr方向移動，即可促進L-Phe合成。作用于這幾個節(jié)點的酶和基因(表1)，便是整個芳香族氨基酸合成途徑中的重要調(diào)控位點。DAHPS由3個同工酶AroH、AroF和AroG構(gòu)成，分別由aroH、aroF和aroG3個基因編碼，這3個基因決定了其活性，并受L-Trp、L-Tyr和L-Phe的反饋抑制[30,40]。大腸桿菌中另外2個節(jié)點受到由pheA基因編碼的雙功能酶分支酸變位酶——預(yù)苯酸脫水酶(CM-PDT)影響，并受到產(chǎn)物L(fēng)-Phe反饋抑制[41]。

3.2 發(fā)酵法合成應(yīng)用

L-Phe的合成代謝途徑比較復(fù)雜，涉及的酶類較多(表1)，可對途徑內(nèi)的幾個分支點進行代謝流的優(yōu)化和調(diào)控，加強重要前體物質(zhì)DAHP的合成，同時也可對途徑間的競爭抑制進行消除，或消除途徑內(nèi)的反饋抑制，是目前獲得高產(chǎn)量L-Phe的研究熱點。近幾年，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-Phe的主要關(guān)注點包括：通過基因工程技術(shù)構(gòu)建重組菌體提高或抑制關(guān)鍵酶表達(dá)，優(yōu)化發(fā)酵過程[26,42-44]，尋找新的工程菌株等。

表1 大腸桿菌中L-Phe合成代謝關(guān)鍵酶及控制基因[40]

3.2.1 構(gòu)建重組菌株

在正常條件下，在野生型菌株中只有少量的中心代謝物轉(zhuǎn)化為L-Phe。由L-Phe合成代謝機制可知，促進微生物合成L-Phe的方法有：促進前體物質(zhì)DAHP的合成，抑制L-Trp、L-Tyr與L-Phe合成途徑間的競爭，解除合成途徑內(nèi)的反饋抑制。由于編碼L-Phe生物合成的基因在大腸桿菌和其他微生物中有很好的表達(dá)，因此理論上可通過關(guān)鍵酶基因的克隆和過量表達(dá)以增加關(guān)鍵酶合成，進而提高微生物中L-Phe的生產(chǎn)能力。目前，關(guān)鍵酶的篩選及其在L-Phe發(fā)酵法生產(chǎn)中得到了深入研究和廣泛應(yīng)用，極大地促進了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-Phe的工業(yè)化進程。Ding等[45]通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法和體外酶滴定實驗確定參與莽草酸途徑的6種酶(AroK、AroL、AroA、AroC、PheA和TyrB)的絕對濃度，實現(xiàn)了這6種酶的體外反應(yīng)體系的重建，并測試了它們對L-Phe生產(chǎn)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)莽草酸激酶和5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶濃度增加2.5倍時，L-Phe的產(chǎn)量分別增加3.0倍和2.1倍。

在大腸桿菌中，目前主要通過基因工程促進PEP、E4P的合成和DAHPS酶的過表達(dá)提高DAHP的流量，進而提高L-Phe產(chǎn)量。在大腸桿菌中，PpsA通過轉(zhuǎn)磷酸化反應(yīng)催化丙酮酸合成PEP，而TktA催化合成E4P[46]。PpsA和PckA分別由ppsA和pckA基因編碼。因此可通過過度表達(dá)ppsA和pckA基因來提高DAHP合成基質(zhì)PEP和E4P的產(chǎn)量。目前已經(jīng)成功構(gòu)建了一系列具有不同變體的重組大腸桿菌菌株用于L-Phe的高水平生產(chǎn)。研究表明ppsA基因在大腸桿菌中的過度表達(dá)將DAHP水平提高了1.9倍[47]。在大腸桿菌細(xì)胞中，PckA過表達(dá)將L-Phe產(chǎn)生的摩爾轉(zhuǎn)化產(chǎn)率增加了20%[48]。

AroG和AroF同工酶都被約0.1 mmol/L的相應(yīng)氨基酸完全抑制，但AroH僅被L-Trp部分抑制，增強DAHPS活性是過量生產(chǎn)L-Phe及其前體莽草酸的重要方法。消除L-Phe對關(guān)鍵酶的反饋抑制和tyrA基因的缺失可以提高L-Phe生物合成的產(chǎn)量。此外在L-Phe生產(chǎn)過程中，通常使用L-Tyr營養(yǎng)缺陷型生產(chǎn)菌株來避免不需要的碳流入L-Tyr合成途徑。

2017年，Liu等[49]開發(fā)了一種轉(zhuǎn)錄因子(TF)驅(qū)動的能特異性地感知細(xì)胞內(nèi)L-Phe，并將該信號轉(zhuǎn)化為可觀察的類型。通過這種策略，建立了高靈敏度和寬動態(tài)范圍的HTS平臺，以促進高L-Phe產(chǎn)量的新型生產(chǎn)商的表征、鑒定和分離。這種方法使研究者能夠在短時間內(nèi)從突變文庫中獲得大量新的感興趣的表型，并提供對大腸桿菌中L-Phe生物合成途徑復(fù)雜調(diào)控的深入了解?；赥F的生物傳感器的超敏性和特異性，各種基因設(shè)備已被用于優(yōu)化合成途徑并預(yù)測目標(biāo)代謝產(chǎn)物的潛在瓶頸[50-52]。此外，通過從隨機誘變文庫中篩選L-Phe高產(chǎn)表型來研究該生物傳感器的適用性，結(jié)果表明，這種新型L-Phe反應(yīng)裝置可用作改善大腸桿菌中L-Phe產(chǎn)生的有效篩選工具。部分大腸桿菌中L-Phe合成代謝特征及文獻總結(jié)見表2。

表2 大腸桿菌中L-Phe的合成代謝

3.2.2 優(yōu)化發(fā)酵過程

為了制備經(jīng)濟上可行的產(chǎn)品，在實驗室規(guī)模開發(fā)和測試的過程必須適應(yīng)工業(yè)上更大的生產(chǎn)量，但通常由于放大效應(yīng)而導(dǎo)致生產(chǎn)性能顯著下降[53]。因此，為防止大腸桿菌放大過程中由發(fā)酵參數(shù)異質(zhì)性引起的生理變化，優(yōu)化發(fā)酵過程就很有必要。各種發(fā)酵方法和技術(shù)已被開發(fā)用于改進L-Phe的生產(chǎn)[54]，例如培養(yǎng)基優(yōu)化、底物進料速率控制、O2供應(yīng)速率控制和過程設(shè)計等。

在過去幾年中，甘油已成為高效生產(chǎn)L-Phe的主要碳源。與葡萄糖相比，低成本及更高碳轉(zhuǎn)化率的甘油能夠有效降低工業(yè)生產(chǎn)成本。在大腸桿菌中，甘油通過擴散穿過細(xì)胞質(zhì)膜，隨后通過甘油激酶(GlpK)將細(xì)胞內(nèi)甘油轉(zhuǎn)化為甘油3-磷酸(G3P)，然后細(xì)胞內(nèi)G3P通過G3P脫氫酶的作用氧化形成磷酸二羥丙酮(DHAP)，后者又異構(gòu)化成甘油醛-3-磷酸(GA3P)。DHAP和GA3P在糖酵解途徑、戊糖磷酸途徑和芳香族氨基酸生物合成途徑中進一步代謝。由于L-苯丙氨酸脫氫酶活性參與了大腸桿菌L-Phe合成的最后一步，Thongchuang等[55]將來自耐熱芽孢桿菌遲緩芽孢桿菌的苯丙氨酸脫氫酶基因(phedh)、編碼芳香族氨基酸出口的yddG基因和編碼甘油轉(zhuǎn)運促進子的glpF基因克隆到質(zhì)粒中并在大腸桿菌中共表達(dá)。在甘油培養(yǎng)基中，克隆pPY(phedh和yddG)和pPYF(phedh、yddG和glpF基因)的工程菌，L-Phe最大產(chǎn)率分別比pPheDH克隆的高1.4倍和1.8倍。

補料分批培養(yǎng)是工業(yè)生產(chǎn)L-Phe的常用方法，因為它能增加細(xì)胞密度，嚴(yán)格控制底物濃度和溶氧以防止發(fā)酵途徑的激活[56]。Weiner等[57]以甘油為碳源，在分批補料條件下，研究了大腸桿菌 FUS4代謝生成L-Phe的過程，發(fā)酵76 h后L-Phe產(chǎn)量達(dá)到22.8 g/L。Wu等[58]使用溫度敏感性質(zhì)粒，過量共表達(dá)抗反饋抑制突變體pheAfbr以及野生型aroF和透明顫菌血紅蛋白基因，研究了溶氧條件對其發(fā)酵產(chǎn)物的影響，結(jié)果表明，高溶氧濃度下L-Phe產(chǎn)量達(dá)44.21 g/L。2011年，Zhou等[44]在大腸桿菌BR-42發(fā)酵罐中進行發(fā)酵優(yōu)化，研究恒速給料、線性遞減給料和指數(shù)給料對L-Phe產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明L-Phe的最終產(chǎn)量高達(dá)57.63 g/L。2015年，Yuan等[21]采用分階段指數(shù)型進料L-Tyr，與指數(shù)進料相比，最終L-Phe產(chǎn)量增加15.33%，L-Tyr補充量降低45.38%。此外補料分批策略可以在一定程度上解決副產(chǎn)物醋酸帶來的問題。

通常利用大腸桿菌工程菌株生產(chǎn)L-Phe需要較高的供氧率。在實際生產(chǎn)中，常通過增加曝氣速度和攪拌速度以及純O2補充來增加O2供應(yīng)。但是高O2供應(yīng)可能會導(dǎo)致功耗過大和整體工藝成本增加。Wu等[58]研究發(fā)現(xiàn)，由tac啟動子驅(qū)動的透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)與aroF和pheAfbr基因的共表達(dá)，能夠提高產(chǎn)率并減少大腸桿菌CICC10245曝氣的需求。當(dāng)vgb、aroF和pheAfbr一起表達(dá)時導(dǎo)致L-Phe生產(chǎn)顯著增加，最高可增加4.13倍。另外，在限氧條件下，大腸桿菌CICC10245產(chǎn)生L-Phe的量明顯少于高通氣條件下的結(jié)果。大腸桿菌菌株P(guān)APV在高通氣條件下產(chǎn)生約6.23 g/L的L-Phe，而在低通氣條件下產(chǎn)生約5.82 g/L的L-Phe。

最后，生物過程設(shè)計也是L-Phe生產(chǎn)的重要因素。L-Phe的生物合成是最復(fù)雜的氨基酸合成途徑之一。2014年，Liu等[59]探究了L-Phe系統(tǒng)級工程化生產(chǎn)：①通過失活crr來減少葡萄糖特異性磷酸烯醇丙酮酸-碳水化合物磷酸轉(zhuǎn)移酶(PTS)系統(tǒng)，以減少葡萄糖攝取率以減少溢出代謝；②開啟或關(guān)閉phefbr、aroG15、ydiB、aroK和tyrB基因的表達(dá)以增加前體的供應(yīng)；③采用tyrA突變株來減少碳轉(zhuǎn)移并導(dǎo)致非生長細(xì)胞；④通過過量表達(dá)yddG來增加L-Phe的外排，使平衡向L-Phe合成移動進行反饋調(diào)節(jié)。首先比較PTS中的突變體并首先篩選crr突變體，表達(dá)yddG的菌株以較高的速率向培養(yǎng)基中分泌L-Phe，并且只有較少L-Phe在細(xì)胞內(nèi)積累。通過系統(tǒng)工程，L-Phe產(chǎn)量高達(dá)47.0 g/L，這是非優(yōu)化發(fā)酵條件下最高的。2018年，Liu等[60]研究發(fā)現(xiàn)，在未優(yōu)化的發(fā)酵條件下，通過系統(tǒng)級工程5 L發(fā)酵罐中Xllp21菌株的L-Phe產(chǎn)量達(dá)到72.9 g/L，是原始菌株Xllp01的1.62倍。

3.2.3 尋找新菌株

盡管可以產(chǎn)生較高濃度的L-Phe，但大腸桿菌工程菌在工業(yè)化生產(chǎn)L-Phe時遇到了許多問題，特別是噬菌體感染致使發(fā)酵終止[61]。因而需要尋找穩(wěn)定的替代工程菌株，如谷氨酸棒桿菌。谷氨酸棒桿菌具有生長速度快、缺乏內(nèi)毒素、分離過程簡單等優(yōu)點，同時隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，谷氨酸棒桿菌基因測序已完成，基因操作工具也已成熟[62-63]，代謝工程谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)L-Phe取得了顯著效果[64]。

谷氨酸棒桿菌的研究主要集中在表達(dá)解除反饋抑制的關(guān)鍵酶。為了改善谷氨酸棒狀桿菌中L-Phe的積累，Zhang等[23]在谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中異源表達(dá)大腸桿菌來源的DAHPS和CM-PDT，最終獲得L-Phe產(chǎn)量為4.64 g/L，是出發(fā)菌的29倍，說明過量表達(dá)這2個關(guān)鍵酶能顯著提高L-Phe的積累量。同時，使用正交試驗設(shè)計及響應(yīng)面優(yōu)化法，分別對種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，確定了重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵L-Phe的最佳種子培養(yǎng)基及最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，最終在最佳培養(yǎng)基條件下L-Phe產(chǎn)量高達(dá)9.14 g/L，比優(yōu)化前的7.46 g/L提高了22.5%[31]。Zhang等[23]分析了谷氨酸棒狀桿菌ATCC13032中莽草酸和分支酸途徑的關(guān)鍵酶，發(fā)現(xiàn)通過突變的pheA和野生型aroH基因的共表達(dá)，L-Phe增加了13.6倍。Liu 等[64]將aroG-pheA整合到谷氨酸棒桿菌染色體中由于生物合成途徑中關(guān)鍵酶活性的改善，也有利于L-Phe的合成。這兩個因素使得L-Phe生物合成產(chǎn)量增加了30%。

4 結(jié)論與展望

對近年來國內(nèi)外L-苯丙氨酸制備的研究進展進行了綜述，主要結(jié)論如下：

1)L-Phe制備方法有多種，但微生物發(fā)酵法由于具有原料廉價易得、環(huán)境污染較小、產(chǎn)物純度高等優(yōu)點，是目前國內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)L-Phe的主要方法。

2)根據(jù)L-Phe代謝機制，對途徑內(nèi)的幾個分支點進行代謝流的優(yōu)化和控制，是微生物發(fā)酵獲得高濃度L-Phe的有效方法。

3)谷氨酸棒桿菌具有速度快、缺乏內(nèi)毒素、分離過程簡單等優(yōu)點，在一定程度上可以克服大腸桿菌工程菌株的一些局限，是L-Phe微生物發(fā)酵合成的潛在菌種，成為當(dāng)前研究的主要方向之一。

目前，微生物發(fā)酵合成L-Phe已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化，但仍存在亟待解決的問題。因此，下一步需要進一步開展研究，例如進行菌種的篩選和高產(chǎn)工程菌株的構(gòu)建，以獲得性能更加優(yōu)良的生產(chǎn)菌株；同時，對發(fā)酵工藝和過程進行優(yōu)化，來提高L-Phe的產(chǎn)量；對于L-Phe的代謝流調(diào)控和代謝機制進行更加深入詳細(xì)的研究等。隨著深入研究，L-Phe的應(yīng)用會不斷擴大，在不同工業(yè)領(lǐng)域?qū)⒂懈鼜V闊的前景。