siRNA介導(dǎo)靶向下調(diào)TRPV1對偏頭痛大鼠的影響及可能機(jī)制研究

劉美霞，劉群會，周龍

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，1.神經(jīng)內(nèi)科；2.神經(jīng)外科，湖北 恩施 445000)

有數(shù)據(jù)顯示，偏頭痛是神經(jīng)內(nèi)科最常見疾病，其患病率在全球成年人群中占11%，在我國約9.3%；且近年呈明顯上升，尤以女性多見[1-2]。偏頭痛多表現(xiàn)為慢性疾病，遷延不愈，給患者生活和工作造成極大困惱，是臨床工作者及學(xué)者研究的重點(diǎn)；但至今其發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。目前，通常認(rèn)為其是神經(jīng)源性炎癥，與中樞敏化、痛覺處理過程異常和皮質(zhì)興奮性增高等相關(guān)[3-4]。瞬時感受器電位香草酸受體(transient receptor potential vanilloid,TRPV1) 是瞬時受體電位 (transient receptor potential,TRP ) 超家族-V亞家族的一種非選擇性陽離子通道，多表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞膜上，在炎性疼痛發(fā)生發(fā)展中地位顯著[5]。硝酸甘油是一氧化氮供體，后者可通過介導(dǎo)降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningene related peptide,CGRP)等多種神經(jīng)肽釋放觸發(fā)神經(jīng)源性炎癥，最終導(dǎo)致偏頭痛發(fā)作，具有成本低、方便，且可在清醒狀態(tài)觀察模型動物行為變化等優(yōu)勢，在偏頭痛建模中應(yīng)用較廣[6]。本研究采用此法建立偏頭痛大鼠模型，并通過siRNA靶向沉默TRPV1，探討其對偏頭痛大鼠的影響，并討論其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

24只成年雌性SD大鼠購自湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；硝酸甘油溶液(規(guī)格：1 mL，生產(chǎn)批號：20180522)購自上海榕柏生物技術(shù)有限公司；siRNA-TRPV1重組質(zhì)粒和siRNA空載質(zhì)粒由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及構(gòu)建；總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Sigma公司；Applied BiosystemTMSYBRTM實(shí)時熒光定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；BK、PGE、CCL2和5-HT ELISA試劑盒均購自上?？祈樕锟萍加邢薰?。

1.2 方法

1.2.1 建立偏頭痛大鼠模型 24只成年雌性SD大鼠，質(zhì)量約200 g，溫度、濕度適宜，晝夜規(guī)律，自由飲食，所有飼養(yǎng)及流程均符合《動物倫理審查基本原則》規(guī)定。本研究參照Tassorelli Cristina法[7]建立偏頭痛模型：于大鼠背部注射硝酸甘油溶液2 mL(10 mg/kg)，每周1次，共5周。判斷方法及標(biāo)準(zhǔn)：于每天注射硝酸甘油溶液后30 min左右，大鼠開始出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、爬籠和撓頭次數(shù)增加等煩躁不安的癥狀，可持續(xù)3 h左右，后開始蜷臥，活動減少，認(rèn)為造模成功。

1.2.2 構(gòu)建重組質(zhì)粒及分組 參考GeneBank中SD大鼠TRPV1基因序列設(shè)計(jì)相關(guān)靶序列，并在正義鏈和反義鏈5’端分別引入Kpn I和Bgl II酶切位點(diǎn)，95 ℃退火，與雙酶切骨架質(zhì)粒相連，轉(zhuǎn)化，然后抽提、純化、凍融及收集病毒上清液，構(gòu)建siRNA-TRPV1重組慢病毒，以備后續(xù)研究。按照此方法建立siRNA空載重組慢病毒。本研究共分為3組：siRNA-TRPV1組(siRNA-TRPV1重組慢病毒感染大鼠)、siRNA空載組(siRNA空載重組慢病毒感染大鼠)和空白對照組(無任何處理方式)，每組8只。其中感染方式為一次性將100 μL病毒液注入大鼠腹腔，繼續(xù)正常飼養(yǎng)，方式同前。

1.2.3 采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測各組血液TRPV1mRNA表達(dá) 轉(zhuǎn)染后第1 d，參照總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書完成總RNA提取及cDNA制備；后參考Applied BiosystemTMSYBRTM實(shí)時熒光定量PCR試劑盒操作說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增及熒光定量檢測，反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min， 92 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。其中以β-actin為參比基因，以2-△△Ct表示TRPV1mRNA相對表達(dá)水平，△Ct=TRPV1-Ct—β-actin-Ct。

1.2.4 行為觀察 轉(zhuǎn)染后第1 d設(shè)定一個時間，從該時間點(diǎn)開始記錄每組大鼠第一次耳紅開始及結(jié)束時間，以30 min為時間間隔，設(shè)定6個時間段(0～30、31～60、61～90、91～120、121～150和151～180 min)，并記錄各時間點(diǎn)撓頭和爬籠次數(shù)。

1.2.5 采用ELISA法檢測各組血液BK、PGE、CCL2和5-HT表達(dá) 分別于第1 h、2 h和第3 h 抽取腹主動脈血1 mL置于抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，取上清液-血漿進(jìn)行BK、PG、CCL2和5-HT檢測，具體操作步驟參考試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組血液TRPV1mRNA比較

轉(zhuǎn)染后，siRNA-TRPV1組、siRNA空載組和空白對照組三組大鼠血液TRPV1mRNA相對水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，siRNA-TRPV1組明顯低于siRNA空載組和空白對照組(P<0.001)，但siRNA空載組和空白對照組兩組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 各組行為指標(biāo)比較

siRNA-TRPV1組、siRNA空載組和空白對照組三組大鼠耳紅開始時間、結(jié)束時間及各時間段爬籠及撓頭次數(shù)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且表現(xiàn)為：siRNA空載組和空白對照組兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，siRNA-TRPV1組開始時間晚于以上兩組，而結(jié)束時間則早于前兩組(P<0.05)；siRNA-TRPV1組各時間段爬籠及撓頭次數(shù)明顯少于siRNA空載組和空白對照組(P<0.05)；見表1和表2。

表1 各組耳紅變化時間比較

表2 各組爬籠及撓頭次數(shù)比較

*注：三組比較均有aP、bP、cP、dP、eP及fP<0.05。

2.3 各組炎癥因子比較

siRNA-TRPV1組、siRNA空載組和空白對照組三組大鼠血液BK、PGE、CCL2和5-HT比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，siRNA-TRPV1組明顯低于siRNA空載組和空白對照組(P<0.001)，但siRNA空載組和空白對照組兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組炎癥因子比較

2.4 各炎癥因子與TRPV1mRNA的關(guān)系

經(jīng)Pearson法分析得知，TRPV1與BK、PGE、CCL2和5-HT呈正相關(guān)(r=0.631/0.694/0.654/0.663,P=0.001/0.001/0.001/0.001)。見圖2。

3 討論

偏頭痛發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，難以從根本上闡明，目前關(guān)于其理論主要基于假說，主要包括皮質(zhì)擴(kuò)展抑制學(xué)說和腦干-三叉神經(jīng)-血管反射學(xué)說；近年隨著基因研究不斷普及，學(xué)者們試圖從基因水平解釋偏頭痛[8-9]。TRPV1基因最初發(fā)現(xiàn)于外周初級感覺神經(jīng)元中，近年發(fā)現(xiàn)其也在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，在大腦對炎癥疼痛轉(zhuǎn)化及調(diào)節(jié)中占重要地位[10]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥，可表現(xiàn)為紅腫熱痛，機(jī)體可釋放緩激肽、前列腺素、趨化因子及P物質(zhì)等炎癥相關(guān)因子[11]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)可使TRPV1mRNA及蛋白水平明顯升高，而炎癥得到控制后其隨之降低[12]。

偏頭痛可被認(rèn)為是一種中樞性炎癥疾病，有研究表明TRPV1在偏頭痛患者中呈高表達(dá)，但未進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究[13]。本研究利用重組慢病毒，具有敲除基本準(zhǔn)確、效率高、可穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，通過siRNA介導(dǎo)達(dá)到靶向敲除TRPV1基因目的，本研究主要分為三組：siRNA-TRPV1組、siRNA空載組和空白對照組，第一組和第三組是為了探討TRPV1作用價值，而siRNA空載組設(shè)定是為了排除質(zhì)粒本身對實(shí)驗(yàn)的影響。在本研究中siRNA空載組和空白對照組所有研究結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，證實(shí)空載質(zhì)粒對本研究影響可不予重視。本研究siRNA-TRPV1組TRPV1mRNA明顯降低，從微觀上提示敲除模型建立成功；與其余兩組比較，siRNA-TRPV1組耳紅開始時間晚，結(jié)束時間早，且爬籠、撓頭次數(shù)減少，從宏觀上說明敲除模型建立成功，且提示TRPV1對偏頭痛的重要性。本研究還發(fā)現(xiàn)siRNA-TRPV1組TRPV1mRNA和炎癥相關(guān)因子(BK、PGE、CCL2和5-HT)均明顯下降，提示TRPV1和炎癥相關(guān)因子在偏頭痛中占有重要地位；后經(jīng)Pearson法分析得知TRPV1與炎癥相關(guān)因子均呈明顯正相關(guān)(P<0.05)，提示TRPV1可能通過激活巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，釋放BK、PGE、CCL2和5-HT，參與偏頭痛發(fā)生發(fā)展，為其機(jī)制研究提供了更多理論依據(jù)。

綜上認(rèn)為，靶向下調(diào)TRPV1可明顯減少硝酸甘油致偏頭痛大鼠爬籠、撓頭等癥狀發(fā)生次數(shù)，與BK、PGE、CCL2和5-HT等相關(guān)炎癥因子水平降低相關(guān)，為偏頭痛患者的有效治療提供了新思路。