血管生成擬態(tài)與Hif-1α、EphA2在原發(fā)性肝癌中表達(dá)關(guān)系的研究

李杰，馬曉潔，杜小波，譚榜憲

(1.綿陽(yáng)市中心醫(yī)院腫瘤科，四川 綿陽(yáng) 621000；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，四川 南充 637000)

血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM) 是一種獨(dú)立于內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的全新腫瘤微循環(huán)模式。在缺氧微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞表達(dá)部分內(nèi)皮細(xì)胞表型，模擬內(nèi)皮血管生成途徑形成可以輸送血液的微循環(huán)管道，被稱(chēng)為VM。過(guò)去十年針對(duì)VM的研究是腫瘤抗血管生成的熱點(diǎn)領(lǐng)域，關(guān)于VM的形成機(jī)制成取得不少成果，其中缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，Hif-1α)、上皮細(xì)胞激酶(epithelial cell kinase，EphA2)被認(rèn)為調(diào)控 VM形成的兩個(gè)關(guān)鍵因子。本研究旨在探究VM與 Hif-1α、EphA2之間的關(guān)系，揭示VM形成機(jī)制。

1 材料與方法

收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、綿陽(yáng)市中心醫(yī)院2010年至2014年P(guān)LC患者切除術(shù)后的蠟塊標(biāo)本161例，所有病例臨床病理資料完整。蠟塊重新切片HE染色，明確分化程度、是否合并肝硬化；免疫組化染色觀察Hif-1α和EphA2的表達(dá)。鏡下選取5個(gè)不重疊的腫瘤細(xì)胞視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行評(píng)分，陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5～25%為1分，25～50%為2分，50～75%為3分，>75%為4分；染色強(qiáng)弱程度計(jì)分，無(wú)色：0分；淺黃色：1分；深黃及棕紅色：2分；棕褐色：3分。然后將染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分比對(duì)應(yīng)的評(píng)分作為評(píng)分參考，0～3分為(-)；4分為(+)；5～8分為(++)；9～12分為(+++)，將≥4分者記為陽(yáng)性。VM通過(guò)CD31-PAS雙染進(jìn)行標(biāo)記，管壁細(xì)胞CD31染色陰性且管壁外附PAS陽(yáng)性的細(xì)胞外基質(zhì)，管腔內(nèi)有紅細(xì)胞為VM陽(yáng)性。另外選取15例正常肝組織作為對(duì)照組，將正常肝臟組織進(jìn)行CD31-PAS雙染。

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)分析。雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLC中VM表達(dá)與各臨床因素的關(guān)系

PLC中VM陽(yáng)性率為37.9%，正常肝臟組織中沒(méi)有VM表達(dá)。患者不同年齡、性別、病理類(lèi)型和HbsAg對(duì)VM表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。VM表達(dá)與腫瘤體積(>5 cm3或<5 cm3)呈正相關(guān)(χ2=4.590，P=0.032)；與臨床分期I-II和III-IV(AJCC/UICC第7版)呈正相關(guān)(χ2=5.022，P=0.025)；與HCC edmondson分級(jí)呈正相關(guān)(χ2=7.575，P=0.006)；與肝硬化呈正相關(guān)(χ2=8.284，P=0.004)。多因素回歸分析提示臨床分期、肝硬化是影響VM表達(dá)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P=0.020,P=0.012) 。見(jiàn)圖1、表1和表2。

表1 PLC中VM表達(dá)與各臨床因素的關(guān)系

臨床因素nVM (%)陽(yáng)性陰性P值組別0.001 PLC組16162(38.5)99(61.5) 對(duì)照組15015(100.0)性別0.768 男性12247(38.5)75(61.5) 女性3914(35.9)25(64.1)年齡0.773 <60歲11444(38.6)70(61.4) ≥60歲4717(36.2)30(63.8)HBsAg0.865 陰性9937(37.4)62(62.6) 陽(yáng)性6224(38.7)38(61.3)肝硬化0.004 無(wú)11636(31.0)80(69.0) 有4525(55.6)20(44.4)病理類(lèi)型0.337 肝細(xì)胞肝癌13850(36.2)88(63.8) 膽管細(xì)胞癌156(40.0)9(60.0) 混合型肝癌85(62.5)3(37.5)臨床分期0.025 Ⅲ-Ⅳ期10446(44.2)58(55.8) Ⅰ-Ⅱ期5715(26.3)42(73.7)edmondson分級(jí)0.006 Ⅲ-Ⅳ級(jí)8137(45.7)44(54.3) Ⅰ-Ⅱ級(jí)5713(22.8)44(77.2)腫瘤體積0.032 <5cm35916(27.1)43(72.) ≥5cm310245(44.1)59(55.9)

表2 Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析

2.2 Hif-1α和EphA2蛋白的表達(dá)

Hif-1α和EphA2蛋白主要在胞漿中表達(dá)，鏡下可見(jiàn)呈巢團(tuán)狀分布，染色后呈棕黃色(圖2)。VM陽(yáng)性組Hif-1α和EphA2陽(yáng)性表達(dá)率分別為75.4%和80.3%，VM陰性組Hif-1α和EphA2陽(yáng)性表達(dá)率分別為60.0%和63.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.608，χ2=8.490；P=0.014，P=0.037)(表3)。Spearman法相關(guān)性分析顯示EphA2與Hif-1α在PLC中的表達(dá)存在顯著相關(guān)性(r=0.194，P=0.014)(表4)。

表3 VM表達(dá)與EphA2、Hif-1α的關(guān)系

表4 EPHA2與Hif-1α相關(guān)性分析

VariablesEphA2-++++++r值P值Hif-1α-2319112+1414216++1010116+++28220.1940.014

3 討論

原發(fā)性肝癌包括肝細(xì)胞癌、肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞癌以及兩者混合發(fā)生三種病理類(lèi)型，根據(jù)2015年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，世界范圍內(nèi)，肝癌致死率在所有惡性腫瘤中排名因第二[1]，是公認(rèn)的嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的惡性腫瘤之一。中國(guó)作為肝癌高發(fā)區(qū)，每年約有40萬(wàn)人死于肝癌，病死率排在我國(guó)惡性腫瘤致死原因第二位[2]。PLC治療效果差是其高死亡率的主要原因，越來(lái)越多的研究者著力于探索新的治療手段，近年來(lái)抗腫瘤血管生成靶向治療成為了研究熱點(diǎn)，研究者對(duì)抗腫瘤學(xué)血管生成治療的領(lǐng)域進(jìn)行了廣泛的探索，研發(fā)出多種抗血管生成治療的分子靶向藥物，如貝伐單抗、索拉非尼、阿帕替尼、恩度等藥物廣泛運(yùn)用于臨床，但肝癌患者的總體療效未得到顯著改善。研究發(fā)現(xiàn)，惡性程度較高的侵襲性腫瘤[3-5]，除了經(jīng)典的內(nèi)皮細(xì)胞依賴(lài)性血管生成途徑以外，腫瘤細(xì)胞可以模擬內(nèi)皮細(xì)胞表型形成網(wǎng)狀管道樣結(jié)構(gòu)并與內(nèi)皮依賴(lài)性血管相連而成的新生血管,這種血管形成途徑完全不依賴(lài)內(nèi)皮細(xì)胞，被稱(chēng)為血管生成擬態(tài)(VM)。VM由腫瘤細(xì)胞直接構(gòu)成血管管壁，可為腫瘤的血性轉(zhuǎn)移提供更為便捷的途徑。因此探索VM的形成機(jī)制成為必要，以VM為靶標(biāo)的治療策略成為近年抗血管生成治療研究的重點(diǎn)[6-7]。

15例正常肝臟組織進(jìn)行CD31-PAS雙染，沒(méi)有觀察到VM表達(dá)。PLC的三種病理類(lèi)型，VM總陽(yáng)性率為38.5%。其中非肝細(xì)胞癌23例，VM陽(yáng)性率40%以上，肝細(xì)胞癌VM陽(yáng)性率36.2%。本研究中不同病理類(lèi)型VM的表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由于非肝細(xì)胞肝癌樣本量少，不足以說(shuō)明不同病理類(lèi)型VM表達(dá)的是否存在差異，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

研究表明缺氧微環(huán)境中Hif-1α的過(guò)表達(dá)是調(diào)控VM形成的重要因素[8]，而EphA2則是VM形成過(guò)程中重要的起始調(diào)節(jié)物[9]。本研究結(jié)果還證實(shí)了EphA2在Hif-1a高表達(dá)區(qū)呈強(qiáng)陽(yáng)性,且與Hif-1a呈顯著正相關(guān)，腫瘤形成VM的能力顯著增加。研究表明RNA干擾抑制Hif-1a基因在食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá),可在一定程度上降低EphA2的表達(dá),抑制VM的形成[10]。調(diào)控機(jī)制可能是伴隨著腫瘤體積逐漸增大，腫瘤組織缺血缺氧，缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)Hif-1表達(dá)增強(qiáng)，調(diào)節(jié)EphA2等基因的活性促進(jìn)血管生成。一些可塑性強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞分化和表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表型并模擬內(nèi)皮血管結(jié)構(gòu)形成VM,與正常血管連通,共同為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，腫瘤組織重新獲得血氧供應(yīng)。在本研究當(dāng)中，腫瘤體積越大、腫瘤分期越晚VM陽(yáng)性率越高，恰恰應(yīng)證這種調(diào)控機(jī)制。腫瘤體積增大、臨床分期增加，腫瘤組織內(nèi)部部分區(qū)域血供不足，出現(xiàn)缺血缺氧，缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)VM的形成。此外，本研究中肝硬化能增強(qiáng)Hif-1α的表達(dá)，提示肝細(xì)胞癌合并肝硬化可加重低氧微環(huán)境的形成,其原因可能與肝細(xì)胞結(jié)節(jié)性增生、肝癌小梁細(xì)胞層增多和纖維結(jié)締組織過(guò)度增殖有關(guān)。因此不難理解，合并肝硬化的腫瘤組織中VM表達(dá)更強(qiáng)。

在多數(shù)實(shí)體瘤中，VM的形成改變了腫瘤局部微環(huán)境，增加了對(duì)腫瘤局部浸潤(rùn)、微轉(zhuǎn)移的途徑，從而影響腫瘤患者的預(yù)后。本課題組前期回顧性研究發(fā)現(xiàn)證實(shí)VM表達(dá)陽(yáng)性是原發(fā)性肝癌患者PLC預(yù)后不良的獨(dú)立因素[11-12]。本文主要討論VM的調(diào)控機(jī)制，關(guān)于VM對(duì)患者預(yù)后的影響需要更多的干預(yù)性研究來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明。腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，離不開(kāi)血液的供應(yīng)，血液供應(yīng)需要新生血管形成，而血管形成是一個(gè)多因素，多靶點(diǎn)的調(diào)控過(guò)程，VM的發(fā)現(xiàn)使研究者對(duì)腫瘤血管生成有了更全面的認(rèn)識(shí)。近年的研究發(fā)現(xiàn)IL-6[13]、VE-cadherin[14]、Bcl-2和Twist1[15]在VM的調(diào)控機(jī)制中也發(fā)揮著重要的作用，但是目前對(duì)VM形成過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制尚未系統(tǒng)的闡明，諸多疑問(wèn)還需要分子水平的研究進(jìn)一步回答。本研究選取石蠟標(biāo)本，可能存在蛋白丟失，對(duì)結(jié)果造成影響，下一步將在術(shù)后新鮮肝癌組織進(jìn)行進(jìn)一步探索。