青蒿素對(duì)胃癌SGC-7901側(cè)群細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

劉元，錢軍*，郭晨旭，朱超，劉先富，承澤農(nóng)

（1.安徽省蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，安徽 蚌埠 233000；2.病理科）

從2015年的中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，胃癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率、患者的死亡率仍居于癌癥的前列［1］，其治療主要是手術(shù)與化療的結(jié)合，預(yù)后不理想。近些年，在基礎(chǔ)研究中發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤細(xì)胞中含有一種具有腫瘤干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群，即側(cè)群（side population，SP）細(xì)胞，其具有高分化、自我復(fù)制及在體內(nèi)高成瘤等特性［2-3］。研究發(fā)現(xiàn)，SP細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞的耐藥、復(fù)發(fā)方面起著重要的作用，從而導(dǎo)致腫瘤的治療效果不理想［4-5］。青蒿素是屠呦呦于1971年從黃花蒿中提取，并且對(duì)鼠瘧原蟲(chóng)的控制效果較好［6］，屠呦呦也因此獲得2015年諾貝爾獎(jiǎng)。近年來(lái)，隨著對(duì)青蒿素的研究，發(fā)現(xiàn)青蒿素具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性［7-8］。目前就青蒿素對(duì)胃癌SGC-7901 SP細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)擬探究SP細(xì)胞的高致瘤性及青蒿素對(duì)各組移植瘤生長(zhǎng)及凋亡蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB∕c-nu裸鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，4周齡，體重（16.6±0.92）g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001，均為雌性。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及藥材 RPMI-1640不完全培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青蒿素購(gòu)于杭州四季青公司，Hocehst 33342染料購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，維拉帕米購(gòu)于上海醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，免疫組化試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，SGC-7901胃癌細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2、95%濕度恒溫箱中。定期換液、傳代。

1.4 胃癌SGC-7901細(xì)胞株SP細(xì)胞及NSP細(xì)胞的分選 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化、離心后棄上清液，用含2%胎牛血清（FBS）的PBS將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×106∕ml。取其中2只離心管作為拮抗組，細(xì)胞懸液中加入維拉帕米 10 μl∕ml，余下的離心管作為實(shí)驗(yàn)組，在每個(gè)離心管的細(xì)胞懸液中加入 Hoechst 33342 5 μl∕ml，移入培養(yǎng)箱中孵育90 min，15 min振蕩一次。孵育后離心5 min，棄上清液，用含2%FBS的PBS將細(xì)胞數(shù)重懸至1×106∕ml。移至滅菌流式管中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選，Hoechst 33342在350 nm條件被激發(fā)，獲得熒光呈雙重波長(zhǎng)：藍(lán)光402～446 nm；紅光650～670 nm，分別收集SP細(xì)胞及NSP細(xì)胞。

1.5 裸鼠接種細(xì)胞懸液的制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP細(xì)胞和NSP細(xì)胞，消化、離心后棄上清液；用PBS重懸細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板記數(shù)活細(xì)胞，當(dāng)活細(xì)胞比率＞95%，稀釋細(xì)胞濃度至5×106∕ml。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組 取裸鼠20只，隨機(jī)分為SP細(xì)胞組和NSP細(xì)胞組，每組10只，取相應(yīng)的細(xì)胞懸液0.2 ml，接種在裸鼠右腋部偏后方皮下，SP細(xì)胞組和NSP細(xì)胞組再隨機(jī)分為生理鹽水（NS）組、青蒿素（將青蒿素純品溶解于少量DMSO，再用生理鹽水稀釋到所需濃度）組。

1.7 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn) 裸鼠接種細(xì)胞24 h后，青蒿素組予青蒿素懸液200 mg∕kg灌胃，對(duì)照組予0.5 ml NS灌胃，每天1次，連續(xù)給藥32 d。移植瘤體積有差異后每3 d測(cè)量一次移植瘤的長(zhǎng)∕短徑（a∕b），計(jì)算瘤體體積V，V=a×b2∕2。第32天處死裸鼠，剝離瘤體，稱取重量，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=（對(duì)照組相對(duì)重量-實(shí)驗(yàn)組相對(duì)重量）∕對(duì)照組相對(duì)重量×100%。

1.8 免疫組化檢測(cè) Bcl、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達(dá) 將瘤組織固定、脫水、透明、包埋，連續(xù)切片；切片脫蠟水化后，作抗原修復(fù)，用FBS代替一抗做陰性對(duì)照；每張切片加1滴3%H2O2溶液，常溫下孵育，PBS沖洗；每張切片滴加1滴相應(yīng)一抗，常溫下孵育，PBS沖洗；每張切片滴加1滴聚合物增強(qiáng)劑（試劑A），室溫下孵育，PBS沖洗；每張切片滴加1滴酶標(biāo)抗鼠∕兔聚合物（試劑B），室溫下孵育，PBS沖洗；每張切片滴加1滴新配置的DAB液，顯微鏡下控制發(fā)色，自來(lái)水沖洗終止顯色，復(fù)染、脫水透明、封片。結(jié)果判斷：（1）陽(yáng)性細(xì)胞百分比（PP）：在400倍的顯微鏡下，取5個(gè)不同視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)3遍，取其平均值，為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與該視野中細(xì)胞總數(shù)的比為陽(yáng)性細(xì)胞百分比。然后取平均值，作為該張切片的PP。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞記為0分，PP＜10%記1分；11%～50%記2分；51～75%記3分；＞75%記4分。（2）染色強(qiáng)度（SI）：0分為無(wú)色，淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。每張切片的PP×SI為免疫組化評(píng)分（IRS）［9］。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SP細(xì)胞的分選 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)出胃癌SGC-7901細(xì)胞中SP細(xì)胞所占比為1.53%±0.47%，經(jīng)維拉帕米拮抗后SP細(xì)胞所占比為0.1%。

2.2 青蒿素對(duì)移植瘤的影響 移植瘤見(jiàn)于接種細(xì)胞后第3天。于第5天移植瘤體積出現(xiàn)差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SP細(xì)胞及NSP細(xì)胞青蒿素組移植瘤體積均小于NS組（P＜0.05）；NSP細(xì)胞NS組移植瘤體積小于SP細(xì)胞NS組（P＜0.05），見(jiàn)表1。SP細(xì)胞與NSP細(xì)胞青蒿素組的抑瘤率分別為55.02%和47.09%，見(jiàn)表2。

表1 裸鼠移植瘤體積比較（n=5，mm3）

表2 裸鼠移植瘤重量及抑瘤率

2.3 免疫組化檢測(cè)瘤體中相關(guān)蛋白的表達(dá)Bcl-2在SP細(xì)胞、NSP細(xì)胞青蒿素組的表達(dá)低于相應(yīng)NS組；在NSP細(xì)胞NS組中的表達(dá)低于SP細(xì)胞NS組（P＜0.05）；NS組中Caspase-9、Caspase-3、Bax的表達(dá)低于相應(yīng)青蒿素組，在NSP細(xì)胞NS組的表達(dá)高于SP細(xì)胞NS組（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表3。

圖1 凋亡相關(guān)蛋白的免疫組化圖（SP×400）

表3 凋亡相關(guān)蛋白的免疫組化結(jié)果（IRS平均分值）

3 討論

腫瘤細(xì)胞對(duì)西藥的治療逐漸出現(xiàn)耐藥，而這種耐藥卻很難逆轉(zhuǎn)，對(duì)于腫瘤的治療，也開(kāi)始轉(zhuǎn)向中藥輔助治療，且中藥對(duì)腫瘤的治療有效、副作用低等優(yōu)勢(shì)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用也得到進(jìn)一步的了解，通過(guò)作用細(xì)胞溶酶體、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及激活機(jī)體免疫系統(tǒng)而間接地抑制腫瘤生長(zhǎng)［10-13］。

在本次實(shí)驗(yàn)中，再次驗(yàn)證了胃癌SGC7901細(xì)胞中是含有SP細(xì)胞，量較少，結(jié)合移植瘤的體積及重量，驗(yàn)證了同等量SP細(xì)胞成瘤能力強(qiáng)于NSP細(xì)胞。在細(xì)胞的線粒體凋亡通路中，蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9扮演著重要的角色，Bcl-2蛋白家族增加細(xì)胞線粒體膜通透性，釋放細(xì)胞色素C，誘導(dǎo)Caspase-3和Caspase-9發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14-15］。Bcl-2蛋白家族成員包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，在細(xì)胞中兩者的比例決定著細(xì)胞的 凋 亡 與 否［12］。 Caspase-9、Caspase-3 蛋 白 為Caspase家族中的成員，分別為起始和效應(yīng)Caspase，Caspase-9、Caspase-3蛋白的激活，為細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要特征，當(dāng)Caspase蛋白高表達(dá)時(shí)，預(yù)示細(xì)胞處于一種凋亡狀態(tài)，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)［16-17］。所以當(dāng)移植瘤組織中低表達(dá)Bcl-2，高表達(dá)Bax、Caspase蛋白時(shí)，細(xì)胞是處于一種高凋亡狀態(tài)，腫瘤生長(zhǎng)較慢，相反，則利于腫瘤生長(zhǎng)。在本實(shí)驗(yàn)NS組中，相對(duì)于NSP細(xì)胞組，SP細(xì)胞瘤體組織中高表達(dá)Bcl-2，低表達(dá)Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白，處于一種低凋亡的狀態(tài)，利于腫瘤的生長(zhǎng)。SP細(xì)胞NS組瘤體的體積大于NSP細(xì)胞NS組，SP細(xì)胞的成瘤強(qiáng)于NSP細(xì)胞，與SP細(xì)胞處于一種低凋亡狀態(tài)有關(guān)。在SP及NSP細(xì)胞組中，青蒿素組的瘤體較NS組小，與瘤體組織中低表達(dá)Bcl-2，高表達(dá)Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白相關(guān)，青蒿素處理后可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的凋亡狀態(tài)，是細(xì)胞由低凋亡狀態(tài)向高凋亡狀態(tài)轉(zhuǎn)變，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

經(jīng)過(guò)本組基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胃癌SGC-7901細(xì)胞中是含有極少量的SP細(xì)胞，而SP細(xì)胞具有高成瘤能力，高成瘤的特性與SP細(xì)胞處于一種低凋亡的狀態(tài)有關(guān)，青蒿素對(duì)SP、NSP細(xì)胞裸鼠成瘤具有一定的抑制作用，其機(jī)制與通過(guò)改變細(xì)胞凋亡狀態(tài)，使細(xì)胞處于一種高凋亡的狀態(tài)有一定的相關(guān)性，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。由于目前對(duì)于青蒿素的研究尚處于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，確切機(jī)制尚待探討，望不久可以應(yīng)用于腫瘤臨床的治療。