hAPOB的克隆、原核表達及抗體效價分析

徐志偉，王 期，徐一然，陳永霞，徐小波，于建寧*

(1.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400；2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江蘇 南京 210023；3.江蘇大學(xué)土木工程與力學(xué)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；4.江蘇省句容市動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇 句容 212400；5.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014)

【研究意義】載脂蛋白(APOlipoprotein，APO)是指來源于血漿脂蛋白中的蛋白部分[1]，APO既是脂蛋白的構(gòu)成組分，又具有穩(wěn)定脂蛋白的功能，同時能通過修飾與脂代謝有關(guān)的酶活性影響脂肪代謝[2-4]。人載脂蛋白B(hAPOB)在人體脂蛋白代謝中具有重要的生理功能，APOB是低密度脂蛋白(LDL)膽固醇的主要結(jié)構(gòu)蛋白，能夠識別LDL受體，參與LDL代謝過程[5-8]，由此可見，hAPOB對人體保持體內(nèi)恒定的血脂水平和介導(dǎo)體內(nèi)脂類代謝必不可少?；趆APOB在人體中的重要功能，檢測hAPOB對于診斷急性冠狀動脈綜合癥、糖尿病等心血管疾病以及后期臨床治療等方面具有重要的醫(yī)療應(yīng)用價值[9-10]?！厩叭搜芯窟M展】在動物生物技術(shù)中，免疫血清制備是一項常用的技術(shù)。通過制備高效價、高特異性的免疫血清可以為免疫學(xué)診斷提供試劑，亦可用于醫(yī)學(xué)上特異性免疫治療或者相關(guān)醫(yī)療研究。要制備免疫血清，抗原是第一位，抗原的純度、質(zhì)量好壞直接關(guān)系到免疫血清的效價與特異性；另一方面，由于采用大動物生產(chǎn)免疫血清需要的抗原量較大，目前多采用商業(yè)化的抗原，成本較高。因此通過免疫大動物獲得免疫血清時，如何在提高抗體效價的同時降低抗原成本，是拓寬免疫血清應(yīng)用的主要限制因素之一?！颈狙芯壳腥朦c】本研究中創(chuàng)新性的采用原核質(zhì)粒表達生產(chǎn)hAPOB抗原，構(gòu)建了hAPOB的原核表達載體，將大腸桿菌原核表達的hAPOB的蛋白進行純化后，通過免疫湖羊原核表達的APOB抗原，分析湖羊產(chǎn)生羊抗人血清的效果，通過抗體效價、抗體產(chǎn)生規(guī)律和hAPOB產(chǎn)品性能檢測，鑒定原核生產(chǎn)hAPOB抗原的性能，【擬解決的關(guān)鍵問題】為后續(xù)大規(guī)模制備抗hAPOB抗體奠定基礎(chǔ)，同時為開發(fā)相關(guān)免疫檢測試劑盒提供了有力保障，更為增加傳統(tǒng)畜牧養(yǎng)殖的經(jīng)濟收益提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)均由本實驗室保存。表達質(zhì)粒pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)由南京基諾美生物科技有限公司通過密碼子優(yōu)化全基因合成方法合成hAPOB(97-526AA)片段并成功構(gòu)建至pGEX-4T-1原核表達載體。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶XhoⅠ，EcoRⅠ、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、核酸標準相對分子質(zhì)量購自TaKaRa公司；蛋白質(zhì)分子量標準購自MBI公司；蛋白胨和酵母粉購自O(shè)XOID公司；氨芐青霉素購于Ameresco公司；IPTG購自Merck公司；丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺購自Promega公司；四甲基乙二胺購自BioRad公司；考馬斯亮藍R-250 購自Sanland公司；膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；弗氏完全佐劑和不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 試驗動物與分組 選用30只健康青年湖羊，體重約35 kg，全部打上耳標，采用群養(yǎng)放牧飼養(yǎng)方式，白天放牧4 h，上午、下午各2 h，晚上添加少量精料，自動飲水，每天早晚各觀察1次羊的健康狀況。將30只湖羊隨機分成3組，每組 10 只，抗原量分別為組1每次0.2 mg，組 2 每次0.4 mg，組3每次1.0 mg。

1.2 試驗方法

1.2.1 pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)人源的APOB蛋白的全長氨基酸序列(Uniprot ID∶P04114)，考慮到全長APOB蛋白序列太長，故利用抗原表位分析軟件Dnastar，預(yù)測出hAPOB在97-526AA此序列段的氨基酸親水性、抗原性等參數(shù)值最高，于是通過密碼子優(yōu)化全基因合成hAPOB(97-526AA)的DNA序列做為原核表達質(zhì)粒構(gòu)建的模板。設(shè)計引物, 5′和3′端分別加入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點。上游引物：5′ CCGGAATTCTGTACCTTAAAAGAAGTTTACG3′；下游引物：5′AAACTCGAGTGCTTTTTGAATCATTAAGCTC 3′。以上述全基因合成的hAPOB的97-526AA序列為模板做PCR：95 ℃5 min，30 ×(94 ℃ 30 s，59 ℃30 s，72 ℃1 min 30 s)，72 ℃10 min。對PCR產(chǎn)物和pGEX-4T-1載體分別進行EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細胞。篩選重組質(zhì)粒陽性克隆進行DNA測序，該重組質(zhì)粒命名為pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)。

1.2.2 Gst-hAPOB(97-526AA)融合蛋白的小試誘導(dǎo)表達及鑒定 將上述重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliBL21(DE3)，平板上挑取3個克隆，接種于含100 mg·L-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)使OD600達到0.8～1，加IPTG至終濃度為1 mM，離心收集菌體進行SDS-PAGE結(jié)合考馬斯亮藍染色，分析融合蛋白的表達情況。

1.2.3 Gst-hAPOB(97-526AA)融合蛋白的大量表達及表達產(chǎn)物分布 將上述鑒定正確表達的pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)菌株接種于含100 mg·L-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，擴大培養(yǎng)至OD600達到0.8～1時，加IPTG至終濃度0.5 mM，20 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)12 h，12 500 g 離心收集菌體，PBS緩沖液重懸菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎后，12 500 g，4 ℃離心15 min后取上清和沉淀留樣，進行SDS-PAGE分析gst-hAPOB(97-526AA)融合蛋白表達情況。

1.2.4 Gst-hAPOB(97-526AA)融合蛋白的純化 上述蛋白沉淀分別經(jīng)2、3、4、6、8 mol·L-1的尿素溶液對沉淀進行梯度重懸、洗滌處理，每次洗滌完后4 ℃、12 500 g 離心20 min重新收集沉淀。透析袋中加入洗脫下的目的蛋白，放入PBS溶液中透析過夜。SDS-PAGE電泳結(jié)合western-blot檢驗洗脫后的蛋白；采用BCA法測定純化后蛋白濃度，-80 ℃保存。

1.2.5 hAPOB多克隆抗體的制備 首免：每只羊接種 4 mL免疫原乳劑，采用皮下與皮內(nèi)注射。一共16個注射點，分別為頜下、背部皮下各2個點；后足窩皮下共2個點；前腹股溝皮內(nèi)各2個點；后腹股溝皮內(nèi)各3個點注射。二免：首次后第15天進行二免，采用皮下與淋巴結(jié)注射。一共18個注射點，分別為頜下、背部皮下各2個點；前腹股溝皮下各2個點；后腹股溝皮下各3個點；前后腹股溝淋巴結(jié)共計4個點。三免：二免后第10天進行三免，采用皮下注射。共計14個注射點，分別為頜下、背部皮下各2個點；前腹股溝皮下各2個點；后腹股溝皮下各3個點。四免：三免后第10天進行四免，免疫方式同三免。五免：四免后第10天進行五免，免疫方式同三免。

1.2.6 hAPOB血清制備及效價測定 雙向瓊脂擴散法檢測抗血清效價：在免疫前、二免前、三免前、五免后 5 d 分別采血，設(shè)定標準陽性血清孔和陰性孔，主要步驟為瓊脂板的配制、打孔、補底和加樣。

ID-ELISA(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay)：5 次免疫注射后分別采集靜脈血5～10 mL進行血清分離，以免疫前湖羊血清作為陰性對照，以hAPOB純化融合蛋白(2 μg·mL-1)為抗原進行ID-ELISA測定[11]，PBS作為空白對照。

效價檢測合格后將所有血采完。將采得的全血于38 ℃水浴中靜置1.5～2 h，使血清充分析出后置于4 ℃冰箱中保存過夜。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用分析軟件SPSS 17.0進行ANVOA分析，統(tǒng)計作圖采用SigmaPlot繪圖軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

利用上述設(shè)計的引物對hAPOB(97-526AA)段序列進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，擴增出一個特異性的DNA條帶，與理論值1287 bp相符。EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒后，獲得4969、1287 bp 2個條帶，初步說明重組成功。重組質(zhì)粒經(jīng)測序，結(jié)果正確，可以確定pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)原核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

1：pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)重組質(zhì)粒未經(jīng)酶切；2：pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I/Xho I雙酶切圖1 pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)重組質(zhì)粒雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳驗證Fig.1 Double digestion of pGEX-4T-1-hAPOB (97-526AA) recombinant plasmid by agarose gel electrophoresis

泳道1：全菌蛋白；泳道2：上清蛋白；泳道3：沉淀蛋白；泳道4～8：沉淀蛋白分別經(jīng)2M、3M、4M、6M、8M尿素洗脫純化；M：蛋白分子量標準。箭頭所示為目的蛋白圖2 pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)-BL21(DE3)放大誘導(dǎo)后的蛋白SDS-PAGE檢測Fig.2 SDS-PAGE detection of protein of pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)-BL21(DE3) after magnification

2.2 Gst-hAPOB(97-526AA)融合蛋白的誘導(dǎo)表達產(chǎn)物分布及純化

重組原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)后SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，在80 kDa位置出現(xiàn)特征蛋白條帶，與預(yù)期分子量相一致。

將pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)凍存菌放大誘導(dǎo)培養(yǎng)，取上清和沉淀分別進行SDS-PAGE，圖2顯示，上清中幾乎無融合蛋白gst-hAPOB(97-526AA)表達；8 M的尿素溶液洗脫后獲得的融合蛋白的純度及產(chǎn)量最佳。

對包涵體純化后，收集的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析和Western blot檢測并經(jīng)BCA法計算其濃度為1.45 mg·mL-1，純度約為90 %。

2.3 原核表達抗原h(huán)APOB免疫羊只后抗血清產(chǎn)生規(guī)律

從圖3中可以看出，隨著免疫次數(shù)的增加，血清中抗體效價逐步升高，到五免后抗體效價到達最高；而且圖中顯示 0.4 mg 組從二免前一直到五免后的抗體效價都要顯著高于其他兩組，提示最佳的免疫原注射量為0.4 mg/次。注射量較少(0.2 mg)或者較多(1.0 mg)都不利于血清中抗體濃度的升高。

2.4 hAPOB抗血清效價測定

采用最佳的免疫原注射量為 0.4 mg/次，多點注射免疫湖羊，檢測抗血清的效價。以蛋白溶液(2μg·mL-1)為抗原進行ID-ELISA測定(圖4)，以表達的gst-hAPOB(97-526AA)融合蛋白作抗原，抗血清稀釋40 000倍后仍明顯地呈陽性反應(yīng)。效價判斷標準為大于最大D450 nm的一半的最小D450 nm所對應(yīng)的稀釋度，即為1︰40000。

圖3 不同免疫抗原濃度的抗體效價趨勢圖Fig.3 Antibody titer trend with different immune antigen concentrations

3 討 論

諸多研究表明，APOB對于醫(yī)學(xué)診斷及疾病治療具有重要作用。在臨床上，檢測載脂蛋白A與載脂蛋白B對血脂的判斷具有重要意義[8-9, 12]。由于APOB在體內(nèi)脂類轉(zhuǎn)運、代謝以及維持血脂水平的恒定中所起的核心作用，所以APOB的基因變異可能與動脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病有必然聯(lián)系[8,13-14]。另一方面，測定脂蛋白及載脂蛋白對這些疾病發(fā)生狀態(tài)的跟蹤與分析意義重大[9,16]。但目前用于檢測APOB的試劑盒尚不成熟。

目前抗血清的商業(yè)生產(chǎn)主要應(yīng)用馬、綿羊和山羊等大型家畜，這類家畜具有壽命長、易管理、靜脈采集血液方便等優(yōu)點[10,16]。制備高效價的免疫血清的主要影響因素有抗原自身性質(zhì)、抗原的注射劑量、注射次數(shù)、間隔時間、注射途徑及抗原佐劑等[17-19]。本實驗首次采用原核表達hAPOB作為抗原，并采用不同劑量進行免疫。目前生產(chǎn)大量APOB抗血清所采用的純化方法主要是高密度脂蛋白純化法，該方法的缺點是分離純化過程中會混入一些血清蛋白等雜蛋白，若要去除這些雜蛋白成份提高純度，會導(dǎo)致生產(chǎn)成本的提高。若這些雜蛋白不加以去除又會影響抗體的質(zhì)量，導(dǎo)致非特異性抗體的產(chǎn)生，而APOB的臨床精確檢測會大打折扣。所以我們實驗中創(chuàng)新性采用原核表達抗原，一方面可以使表達蛋白更純，另一方面降低成本。從結(jié)果看，原核表達的hAPOB抗原純度高，抗血清的效價足以滿足商用標準，可以替代商業(yè)購買的抗原。

有研究表明，免疫劑量的不同導(dǎo)致對免疫系統(tǒng)的刺激強弱存在差異，從而產(chǎn)生不同水平的抗體，進而影響免疫血清的效價[20-22]。本試驗在原核表達抗原的免疫劑量方面亦進行了有效探索。從免疫原的注射劑量入手，對免疫劑量進行優(yōu)化，不但進一步增高了抗體的效價，而且節(jié)省了抗原用量，降低了生產(chǎn)成本。

圖4 ID-ELISA測定hAPOB抗血清效價Fig.4 hAPOB antibody titer detected by ID-ELISA

綜上所述，本實驗成功選取了APOB蛋白的抗原表位，進而構(gòu)建了載體表達APOB的重組蛋白抗原，成功避開了血清中雜蛋白殘留的問題，降低生產(chǎn)成本的同時提高抗體的特異性及效價，是一種經(jīng)濟高效的抗體制備方法，為后續(xù)的抗體應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。