西藏牦牛MyoD1基因多態(tài)性及與生長性狀的關聯(lián)性分析

黃 興，柴志欣，王 會，姬秋梅，信金偉，鐘金城*

(1.西南民族大學/青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏 拉薩 850009)

【研究意義】牦牛主要分布于海拔3000 m以上，以青藏高原為中心，及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)，能夠適用高寒缺氧等極端生態(tài)環(huán)境，素有“高原之舟”之稱[1]。能夠充分利用低海拔家畜難以利用的牧草資源，生活自如，繁衍后代。其耐粗、耐勞、善走陡坡險路、雪山沼澤，是高原牧區(qū)主要的運輸工具，為當?shù)啬撩裉峁┎豢苫蛉钡纳a(chǎn)生活資料。由于受分布區(qū)自然環(huán)境條件和經(jīng)濟社會發(fā)展水平的限制，加之牧民缺乏科學的管理，牦牛生產(chǎn)性能不高[2]。因此利用現(xiàn)代分子生物學技術對牦牛生長性狀相關基因進行挖掘并進行相關性分析，也成為牦牛種質資源的保護和經(jīng)濟性狀選育的主要手段?！厩叭搜芯窟M展】生肌決定因子1(Myostatin1，MyoD1)是肌肉調(diào)節(jié)因子(Muscle Regulatory Factors,MRFS)基因家族的一員，對成肌細胞的生長和分化具有重要的調(diào)控作用[3]。相關研究表明，牛MyoD1基因定位在第15號染色體上，全長2648 bp，由2個內(nèi)含子和3個外顯子組成[4-5]。MyoD1是調(diào)控骨骼肌生成或再生的一個重要轉錄因子，它能夠激活肌肉基因轉錄，使非肌細胞轉變?yōu)榧〖毎?，調(diào)控肌細胞的融合，促進成肌細胞分化為肌管，進而融合為肌纖維，是調(diào)控脊椎動物胚胎期肌肉發(fā)育過程的主調(diào)控因子[6]，同時也是參與壞損組織修復。因此，MyoD1基因的改變影響肌肉組織結構的表達，產(chǎn)生的遺傳改變對嫩度有影響。研究表明MyoD1與肉嫩度數(shù)量性狀顯著相關[7-8]。近年來，通過對影響牦牛生長發(fā)育等性狀候選基因的研究，篩選出許多影響其經(jīng)濟性狀的關鍵位點和分子標記[9,12]。目前，對牛、羊、雞、鴨等家畜及家禽MyoD1基因的研究較多，但對牦牛的研究尚存在較大的空缺。【本研究切入點】鑒于此，本研究通過對西藏不同牦牛類群(品種)MyoD1基因的PCR-RFLP研究，篩選關鍵SNP位點，并與其體重、體高、體斜長、胸圍、管圍等生長性狀進行關聯(lián)性分析?！緮M解決的關鍵問題】以期獲得對牦牛重要經(jīng)濟性狀具有顯著效應的遺傳標記，為解析牦牛重要經(jīng)濟性狀的遺傳基礎，挖掘鑒定與生長發(fā)育、抗逆、產(chǎn)肉、產(chǎn)乳等性狀相關的優(yōu)異基因，促進牦牛育種工作提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究樣品 選取4個具有代表性的西藏牦牛品種，分別為帕里(PL)26頭、斯布(SB)30頭、申扎(SZ)55頭、類烏齊(LWQ)37頭，共148頭健康成年牦牛。采集耳組織，置于75 %的乙醇，帶回實驗室，-80 ℃保存?zhèn)溆?，同時測定其體重、體高、體斜長、胸圍、管圍等體尺指標。

1.1.2 主要試劑與分析軟件 DNA提取試劑盒(TIANGEN)；TaqGreen PCR Master Mix(Thermo)；瓊脂糖(Amresco)、D2000DNA Ladder(BioMIGA)、EDTA、NAOH、甘油，XmaI酶(Thermo)等。

分析軟件有：Primer Premier5.0、Excel2010、SPSS18.0、Popgen1.32、PIC-CALC、DNAMAN5.0、Chromas、Photoscape、BioEidit7.0.5、Watcut在線SNP-RFLP分析軟件等。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取與檢測 利用動物組織基因組DNA提取試劑盒，提取DNA，然后用紫外分光光度計檢測濃度，1.5 %的瓊脂糖檢測其純度，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 構建DNA池及SNP查找 分別從每個品種中提取10頭牦牛的DNA，共計40頭，放4度冰箱使其單個自身混勻，1 d之后，測濃度(利用DNA試劑盒洗脫液做空白)。分別測出40個樣的DNA濃度(上層，中層，下層)，平均3次取平均值(需>50 ng/μl)，每個稀釋到50 ng/μl，所有稀釋好的樣品使其混勻，靜止1周達到充分均勻。設計引物進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物進行測序并進行Chromas軟件處理和DNAMAN比對序列，查找SNP位點。

1.3 引物設計及PCR產(chǎn)物擴增

1.3.1 引物設計 根據(jù)GenBank公布的牛MyoD1基因序列(Accession No:AC_000172)，將內(nèi)含子2以及外顯子3的部分序列應用Primer Premier5.0軟件設計引物(表1)，引物由英濰捷基(上海)生物技術有限公司合成。

表1 牦牛MyoD1基因的引物序列

1.3.2 PCR產(chǎn)物擴增 PCR擴增總體系為25 μl：ddH2O 9.5 μl、上下游引物各1μl、DNA模板1μl、DreamTaqGreen PCR Master Mix(2×,1.25 mL) 12.5 μl。PCR反應程序為：95 ℃ 預變性2 min，95 ℃變性1 min，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳0.5 h后用凝膠成像系統(tǒng)觀察擴增情況，并保存結果。

1.4 PCR產(chǎn)物的XmaI酶切

將4 ℃保存的PCR產(chǎn)物進行酶切，酶切體系為20 μl：XmaI酶1.2 μl，10×Buffer 2 μl，ddH2O 8.8 μl，PCR產(chǎn)物8 μl。金屬浴37 ℃，過夜酶切12 h。酶切產(chǎn)物用1.5 %的瓊脂糖凝膠在80 V電壓下電泳50 min后用凝膠成像系統(tǒng)觀察酶切情況，并保存結果。

1.5 序列分析

PCR產(chǎn)物酶切處理后，顯帶分型，將不同基因型PCR產(chǎn)物純化后送由上海生物工程技術有限公司測序。利用DNAMAN5.0將測序序列比對，確定突變位點。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel2010、Popgen1.32、PIC-CALC等軟件進行西藏4個牦牛品種多態(tài)信息含量(PIC)分析和Hardy-Weinberg平衡檢測，以及基因型、基因頻率、雜合度、有效等位基因數(shù)的計算。運用SPSS18.0軟件采取最小二乘擬合線性模型(least squares fitting linear model)將不同基因型及體尺性狀數(shù)據(jù)進行關聯(lián)分析。

2 結果與分析

2.1 MyoD1-PCR擴增產(chǎn)物檢測

對西藏4個牦牛類群不同個體進行PCR擴增，獲得370 bp的目標片段(圖1)。利用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，其特異性好，均無雜帶，與預期的實驗結果一致，表明實驗成功，具備后續(xù)實驗的條件。

圖1 MyoD1基因擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophpresis of MyoD1 gene amplification products

2.2 PCR-RFLP分析

對西藏4個牦牛類群帕里(PL)、斯布(SB)、申扎(SZ)、類烏齊(LWQ)的不同個體進行XmaI酶切，通過2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測分型，存在CC、CT、TT 3種基因型,分別為370 bp/50 bp、370 bp/320 bp/50 bp、370 bp(圖2)。

第2、4、9泳道為TT型，3、5、8泳道為CC型，6、7、10泳道為CT型The 2,4,9 lanes are TT genotype: the3,5,8 lanes are CC genotype; the 6,7,10 lanes are CT genotype圖2 西藏牦牛MyoD1片段PCR產(chǎn)物XmaI酶切電泳圖Fig.2 Electrophoresis patterns of digesting PCR products of MyoD1 fragment with XmaI

2.3 SNPs位點篩選與檢測

對不同基因型個體進行測序，分析測序峰圖發(fā)現(xiàn)，在MyoD1基因第2內(nèi)含子上并未檢測到突變位點，在外顯子3的部分序列中發(fā)現(xiàn)C-T點突變(C1710T，圖3)。

圖3 MyoD1片段測序結果Fig.3 The results of sequencing of MyoD-Exon2 fragment

位點Loci品種Breeds個體數(shù)Individuals基因型頻率Genotypes frequencies基因頻率Allele frequenciesCCCTTTCTMyoD-C1710T帕里(PL)260.5000.3850.1150.6920.308斯布(SB)300.3330.5340.1330.6000.400類烏齊(LWQ)550.3460.5090.1450.3950.605申扎(SZ)370.1620.6220.2160.4730.527

表3 4個牦牛類群MyoD1基因1個SNP位點的Hardy-Weinberg平衡的χ2 檢驗

表4 4個牦牛類群MyoD1基因SNP位點的遺傳多態(tài)性指標

2.4 突變位點的群體遺傳學分析

2.4.1 基因型頻率、等位基因頻率、χ2檢驗 由表2,3可知，斯布(SB)、申扎(SZ)、類烏齊(LWQ)3個牦牛類群中雜合型(CT)為優(yōu)勢基因型，基因型頻率分別為0.534、0.509和0.622，而帕里(PL)CC純合型為優(yōu)勢基因，基因頻率達到0.500。等位基因C在帕里(PL)和斯布(SB)中為優(yōu)勢基因，分別達到0.692和0.600。等位基因T在申扎(SZ)和類烏齊(LWQ)中為優(yōu)勢基因，分別達到0.605和0.527。χ2適合性檢驗顯示，χ2分別為0.245、0.371、0.202和2.255，P值均大于0.05，均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

2.4.2 多態(tài)指標分析 如表4所示，帕里(PL)、斯布(SB)、申扎(SZ)和類烏齊(LWQ)4個牦牛類群的多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.335、0.365、0.365和0.374，均處于中度多態(tài)(0.25

2.5 MyoD1基因XmaI位點多態(tài)性和生長性狀關聯(lián)分析

利用SPSS18.0軟件，根據(jù)最小二乘擬合線性模型，對西藏4個牦牛類群MyoD1基因外顯子3上的C1710T突變位點的不同基因型與體尺指標進行關聯(lián)分析。將4個牦牛類群共計148頭個體整體進行多重比較，結果顯示，CT基因型在身高、體重、體斜長、管圍、胸圍上均大于CC和TT基因型，但差異不顯著(P>0.05)；每個類群單獨分析時，帕里牦牛CC基因型在體重、體斜長、胸圍、管圍上均大于CT和TT基因型，CT基因型在體高上大于CC和TT基因型，但差異不顯著(P>0.05)；斯布牦牛CT基因型在體重、胸圍、管圍上均大于CC和TT型，而體高和體斜長CC型大于CT和TT型，差異不顯著(P>0.05)；申扎牦牛CT型在體重、體高、胸圍和管圍上大于CC和TT型，而體斜長CC型長于CT和TT型，申扎牦牛C1710T突變位點TT和CT基因型與胸圍存在顯著相關性，CT型的胸圍達到116.72 cm，TT型胸圍為96.50 cm，相差達到了20.22 cm,差異顯著(P<0.05；表5)；類烏齊牦牛在生長性狀指標上CT型均高于CC和TT型，CT型為優(yōu)勢基因型，但差異不顯著，不存在關聯(lián)性。

表5 申扎牦牛MyoD1基因Xmal位點對體尺性狀的影響(平均數(shù)±標準誤)

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：The different scripts (a,b) mean differ significantly (P<0.05).

3 討 論

3.1 候選基因多態(tài)位點的關聯(lián)性

目前，MyoD1基因多態(tài)性研究在人，小鼠和豬等物種中開展的較早且全面，而對羊和牛等反芻動物的研究相對滯后[13]。1987年Davis[14]利用小鼠的MyoD基因作為探針，克隆并分離了人的MYF3基因，后被證實為MyoD基因。在對豬的研究中，Knoll等[15,18]研究表明豬MyoD基因內(nèi)含子1上存在DdeI-PCR-RFLP位點，且該位點顯著影響眼肌面積、腿臀比例、胴體瘦肉率、皮脂含量和胴體長度，從而間接影響豬肉品質，Lee等[19]研究顯示，豬的MyoD基因不同的單核苷酸多態(tài)性影響其基因的表達水平，并且其在一定程度上對瘦肉率、肌纖維特性及肉質性狀存在影響。田璐等[20]在對黃牛的研究中發(fā)現(xiàn)MyoD基因第二內(nèi)含子39和112 bp處存在突變位點，且這2個位點對肉牛的宰前活重、胴體重和凈肉重等有顯著影響。賈偉德[21]在牛MyoD基因家族多態(tài)性及其與肉質性狀的關聯(lián)性分析中發(fā)現(xiàn)該基因第1外顯子166 bp處有一處突變。黃萌等[22]在對肉牛的研究中發(fā)現(xiàn)MyoD基因的第3外顯子1867 bp處存在突變位點，且不同基因型對肉牛的背膘厚和大腿肉厚的具有顯著影響。趙金紅等[23]研究顯示，牛MyoD基因第1外顯子782 bp處發(fā)現(xiàn)一處突變，與肌纖維發(fā)育、肌肉色澤和肉質嫩度等方面都密切相關。已發(fā)現(xiàn)的多態(tài)位點均與基因的表達存在關聯(lián)，而本研究所發(fā)現(xiàn)的突變位點尚未見報道。

本研究通過隨機挑選1/3左右的樣本建立DNA池，初步確定了西藏牦牛的突變位點，利用在線SNP-RFLP分析軟件篩選出來的XmaI酶對西藏牦牛所有樣本進行PCR-RFLP分型，分型后對不同基因型進行測序，測序與酶切分型結果一致。研究顯示，斯布(SB)、申扎(SZ)、類烏齊(LWQ)3個牦牛類群中雜合型(CT)為優(yōu)勢基因，表現(xiàn)出雜合優(yōu)勢，與張潤峰[13]在牛MRF家族基因變異及其與生長性狀的相關分析中，黃牛群體MyoD基因突變位點基因型雜合型均高于純合型結果一致；帕里(PL)牦牛純合型(CC)為優(yōu)勢基因，與田璐等[20]在MyoD基因對肉牛胴體性狀影響的分析中，AA型呈現(xiàn)優(yōu)勢基因情況相似，說明MyoD基因在不同物種中突變位點的優(yōu)勢基因型與關聯(lián)性狀、分析個體及突變位點本身有關，除此之外，可能有以下的原因：①所研究的樣本量太小，沒有反應出真實的水平，在一定范圍內(nèi)樣本量大小與所觀測到的等位基因的檢出率呈正相關，同時雜合度較低的位點隨樣本變化波動較大[24]。②該位點的選擇可能存在一些性狀的影響因素或與之連鎖的基因，有證實FoxO1基因和MyoD1基因有著相互調(diào)控的關系，共同發(fā)揮其生物學功能[25,28]。

突變位點經(jīng)卡方適合性檢驗得到，χ2分別為0.245、0.371、0.202、2.255，均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05)。由此可知，在有突變的情況下，經(jīng)自然選擇，加上人為選育的干擾，最終各種因素相互抵消，使得群體仍處于遺傳動態(tài)平衡狀態(tài)。通過對C1710T突變位點多態(tài)性指標的分析可知，多態(tài)信息含量(PIC)均處于中度多態(tài)(0.25

3.2 候選基因多態(tài)性與西藏牦牛生長性狀的相關性討論

利用候選基因多態(tài)性與西藏牦牛生長性狀關聯(lián)分析，148頭牦牛劃成一個整體進行多重比較，結果發(fā)現(xiàn)在身高、體重、體斜長、管圍和胸圍上的均值CT型均大于CC和TT型，且對4個群體單獨分析時，帕里牦牛在體重、體斜長、胸圍和管圍上的均值CC型均大于CT、TT型，斯布牦牛體高和體斜長CC型大于CT和TT型，申扎牦牛在體斜長CC型長于CT和TT型，類烏齊牦牛在5項生長性狀指標上CT型均高于CC和TT型，但以上指標差異均不顯著，類烏齊牦?；蛐团c生長性狀的相關性與多重比較分析一致。原因可能有：①部分種群的數(shù)量采集的不夠充足，基因型在群體中分布不均。在對不同品種牛的研究上已驗證過[29]。②4個類群分布區(qū)域、海拔高度及地域文化、經(jīng)濟發(fā)展程度、人工選育程度均存在差異，使其遺傳特性不同，以致在體型外貌、血液蛋白、染色體特征及DNA分子等多個不同層次上存在差異，研究顯示以上類群均具有豐富的遺傳多樣性[30]。

申扎牦牛MyoD1基因外顯子3上的多態(tài)位點與體尺性狀關聯(lián)分析，得到TT和CT基因型與胸圍存在著相關性，差異顯著(P<0.05)，可能和申扎所處地理位置及氣候條件有關。申扎縣位于西藏西部，平均海拔達4750 m，高山、丘陵和盆地交錯，為高原亞寒帶季風性氣候，主要分布高山灌叢草甸草場，因海拔較高，生態(tài)條件惡劣，植被草場長勢較差，使申扎牦牛整體發(fā)育情況較其它牦牛類群差，前期對申扎牦牛大群體生長指標測定顯示，申扎牦牛是目前西藏自治區(qū)現(xiàn)有牦牛類群中個體發(fā)育最小的一個類群。相比較其他地區(qū)，亞東縣帕里鎮(zhèn)，帕里牦牛的主要產(chǎn)區(qū)，平均海拔達4640 m，冰雪融水量豐富，草場主要分布高寒草甸草場、亞高山草場，牧草充足，是發(fā)展牧業(yè)好地方。而西藏自治區(qū)昌都市類烏齊縣，平均海拔達4500 m，俗稱“西藏小江南”，這里晝夜溫差較大，但光照充足，氣候類型為高原溫帶半濕潤性氣候，牧草產(chǎn)量豐富，同時類烏齊牦牛膘肥體壯、肉質鮮嫩，被列為地理標志保護產(chǎn)品。斯布牦牛分布于西藏自治區(qū)拉薩河流域周圍，平均海拔約4000 m，氣候溫暖而濕潤，牧草長勢良好，牦牛于斯布河谷周圍終年放牧，耐粗飼，繁殖力較高，人為選育的因素較小?？傊暝笈７植紖^(qū)域的氣候條件與帕里，斯布，類烏齊相比更加的惡劣，牧草資源匱乏，總能量存在著夏季富余、冬季不足的現(xiàn)象，生態(tài)系統(tǒng)脆弱，抗干擾能力差。長期以往，牧草長勢好壞直接影響牦牛體格，形成表觀遺傳學，適應當?shù)氐臍夂蚝蜕鷳B(tài)條件。同時申扎縣多農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)相結合，牦牛選育程度較高，現(xiàn)擁有建成的牦牛育肥實驗基地。人為選育的作用不同[31]，同時生態(tài)氣候因子對牦牛的體型有著直接的影響[32]，這兩個因素共同影響其遺傳選擇[33]。

Verner等[34]報道豬的MyoD基因多態(tài)性與大理石花紋性狀具有極顯著相關性；田璐等[20]在3個不同品種的黃牛(魯西牛、晉南牛、秦川牛)和4個雜交牛品種中，對MyoD基因第二內(nèi)含子SSCP多態(tài)位點進行檢測，發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點與胴體性狀(如胴體重、凈肉重、高檔肉重、眼肌面積)差異顯著；Bhuiyan等[35]研究結果表明MyoD基因與生長和胴體性狀具有極顯著相關性；在2012年，褚敏等[36-37]在對180頭成年甘南牦牛和296頭成年大通牦牛的MyoD1基因研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點與體尺性狀差異顯著。通過以上研究顯示，MyoD基因可作為影響不同物種生長發(fā)育及肉質性狀的候選基因。通過對西藏牦牛的MyoD1基因的研究，C1710T多態(tài)位點與申扎牦牛胸圍存在相關性，為后續(xù)研究提供了依據(jù)，可進一步擴大樣本量，廣泛開展對不同品種的研究，增加調(diào)控區(qū)段的多態(tài)性位點的研究，進一步了解基因的遺傳效應，為選育自己有特色的地方牦牛品種提供貢獻以及帶來經(jīng)濟效益，為少數(shù)民族地區(qū)帶來福祉。

4 結 論

綜合西藏牦牛MyoD1基因結構和生物學功能的基礎資料，MyoD1基因內(nèi)含子2上未發(fā)現(xiàn)突變位點，外顯子3上發(fā)現(xiàn)一個SNP(C1710T)，為XmaI酶切位點。基因型與生長性狀關聯(lián)分析可知，申扎牦牛CT型和TT型基因型個體存在顯著差異(P<0.05)，3種基因型與胸圍顯著相關，其他牦牛類群差異均不顯著。4個群體MyoD1外顯子3上的C1710T突變位點多態(tài)性高，遺傳變異大。申扎牦牛C1710T多態(tài)位點可能是影響體尺性狀的重要功能基因座，是一個作為改良生長性狀的遺傳位點，具有很好的研究價值。