不同雜草防除模式對(duì)大蔥產(chǎn)量及根際土壤生物學(xué)性狀的影響

王帥帥 ，吳人敏，張傳進(jìn)，楊尚東, 2*

( 1. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】雜草具有數(shù)量大、抗逆性強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，不僅與農(nóng)作物爭(zhēng)奪有限的土壤肥力與光照，抑制作物的生長(zhǎng)和發(fā)育，還會(huì)造成病蟲(chóng)害的發(fā)生與蔓延，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生嚴(yán)重危害[1-2]。目前，防除雜草的方法主要有人工除草、覆蓋地膜和使用化學(xué)除草劑等。其中，以聚乙烯烴類為原料的地膜在使用后會(huì)大量殘留在土壤中，極易形成持久性污染，對(duì)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3]?；瘜W(xué)除草劑亦會(huì)長(zhǎng)時(shí)間地殘留在土壤中，影響農(nóng)作物產(chǎn)量、品質(zhì)與食品安全[4]。因此，研究雜草生態(tài)防除模式對(duì)保護(hù)生態(tài)環(huán)境和提高作物產(chǎn)量具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】土壤微生物在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中起著極其重要的作用[5]，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)外界環(huán)境條件的變化非常敏感，可以反映環(huán)境變化和生態(tài)學(xué)功能[6]。王棟等[7]研究了水稻覆草旱作和免耕覆草旱作對(duì)稻田土壤理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與常規(guī)方法相比，免耕覆草旱作可以顯著提高土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮和土壤基礎(chǔ)呼吸。謝駕陽(yáng)等[8]研究了覆草對(duì)土壤有機(jī)碳氮和生物活性的影響，結(jié)果表明覆草能增加土壤有機(jī)碳氮的易礦化組分，提高土壤有機(jī)質(zhì)的生物有效性。嚴(yán)奉君等[9]發(fā)現(xiàn)覆蓋能夠有效促進(jìn)雜交稻根系的生長(zhǎng)，增加干物質(zhì)與氮素積累以及提高氮肥利用效率?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)雜草防除的研究主要集中于地上部分雜草防除效果方面，基于傳統(tǒng)的生物學(xué)分析方法與高通量測(cè)序技術(shù)，探究不同雜草防除模式對(duì)大蔥根際土壤生物學(xué)性狀的影響的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】篩選最佳的雜草防除方法，為建立有效的雜草生態(tài)防除模式提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況及供試材料

試驗(yàn)于2017年11月至2018年4月在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜生產(chǎn)基地(東經(jīng)108°18′，北緯22°51.2′)進(jìn)行。大蔥品種為“攬勝”(購(gòu)自上海惠和種業(yè)公司)；覆蓋木糠購(gòu)于南寧市白蒼嶺農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。試驗(yàn)地土壤類型為赤紅壤，土壤pH 5.71，有機(jī)質(zhì)含量8.42 g·kg-1、全氮0.51 g·kg-1、全磷0.67 g·kg-1、全鉀7.21 g·kg-1、堿解氮13.17 mg·kg-1、速效磷0.59 mg·kg-1、速效鉀80.6 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，分別為不除草(CK)、人工除草(T1)和木糠覆蓋(T2)，每個(gè)處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，共9小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積15.0 m2(2.5 m×6.0 m)。施肥、灌溉和病蟲(chóng)害防治均按常規(guī)方法相同管理。

1.3 樣品采集

大蔥定植80 d進(jìn)入采收期后采集土壤樣品。每個(gè)處理小區(qū)隨機(jī)選取5株，連根拔起，依據(jù)抖根法[10]采集根際土壤并用無(wú)菌袋收集。每份土壤樣品分為2部分，一部分過(guò)10目篩后置于4 ℃冰箱保存，用于土壤生物學(xué)性狀分析；另一部分置于-80 ℃冰箱保存，用于細(xì)菌多樣性分析。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.4.1 產(chǎn)量估算 大蔥產(chǎn)量的估算采用常規(guī)計(jì)算法，收獲3個(gè)處理相應(yīng)的大蔥，稱重計(jì)算單位平方面積大蔥產(chǎn)量，以單位面積產(chǎn)量估算每公頃產(chǎn)量。

1.4.2 生物學(xué)性狀分析 利用梯度稀釋平板法測(cè)定可培養(yǎng)微生物數(shù)量[11]。分別采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基和高氏一號(hào)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)可培養(yǎng)細(xì)菌、可培養(yǎng)真菌和可培養(yǎng)放線菌。

參考李振高[12]以及趙久成[13]稍加改良的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定β-葡糖苷酶、氨肽酶和磷酸酶，分別采用氯仿熏蒸提取—容量分析法、氯仿熏蒸提取—茚三酮比色法和氯仿熏蒸提取—磷鉬藍(lán)比色法測(cè)定土壤中微生物生物量碳、氮和磷[14]。

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序完成。測(cè)序具體流程：DNA抽提和PCR擴(kuò)增：根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒 (Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提，使用NanoDrop2000檢測(cè)DNA濃度和純度，用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。用338F和806R引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 Illumina Miseq測(cè)序：回收PCR產(chǎn)物(2 %瓊脂糖凝膠)→純化(Extraction Kit)→Tris-HCl洗脫→電泳檢測(cè)→檢測(cè)定量(QuantiFluorTM-ST)→構(gòu)建PE 2*300的文庫(kù)。構(gòu)建文庫(kù)的步驟如下：①連接“Y”字形連接器；②用磁珠過(guò)濾自連接片段；③通過(guò)PCR擴(kuò)增文庫(kù)模板；④氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina Miseq測(cè)序公司MiseqPE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物制藥有限公司)。原始數(shù)據(jù)上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。

ACE指數(shù)、Chao指數(shù)、Simpson指數(shù)和Hiep指數(shù)的計(jì)算方法和結(jié)果均來(lái)自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司I-sanger云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)(www.majorbio.com)。具體公式如下：

Chao：

其中，Schao1:估計(jì)的OTU數(shù)；Sobs:實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)；n1:只含有1條序列的OTU數(shù)目；n2:只含有2條序列的OTU數(shù)目。

ACE：

其中，

ni:含有i條序列的OTU數(shù)目；

Srare:含有“abund”條序列或者少于“abund”的OTU數(shù)目；

Sabund:多于“abund”條序列的OTU數(shù)目；

abund :“優(yōu)勢(shì)”O(jiān)TU的閾值，默認(rèn)為10。

Simpson：

其中，Sobs:實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)目；ni:第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)；N: 所有的序列數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003和SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，并利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的I-sanger云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析，構(gòu)建細(xì)菌群落柱形圖和多樣性分析，探究不同雜草防除模式對(duì)大蔥根際土壤肥力與健康狀況的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雜草防除模式對(duì)大蔥產(chǎn)量及根際土壤生物學(xué)性狀的影響

2.1.1 不同雜草防除模式對(duì)大蔥產(chǎn)量和根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響 由表1可知，處理T2的大蔥產(chǎn)量顯著高于CK和處理T1(P<0.05，下同)，分別增產(chǎn)了6.5 %和8.0 %，處理T1和CK間差異不顯著(P>0.05，下同)；處理T2大蔥根際土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌數(shù)量與CK相比分別增加了20.8 %、33.3 %，均達(dá)顯著差異水平，但處理T1和T2之間可培養(yǎng)微生物(細(xì)菌、真菌和放線菌)數(shù)量差異未達(dá)顯著水平。此外，處理T1與CK相比，可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量雖呈增加趨勢(shì)，但兩處理之間差異并未達(dá)顯著水平。上述結(jié)果表明：與CK相比，處理T2顯著提高了大蔥產(chǎn)量和根際土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌數(shù)量，但處理T1相應(yīng)的影響效果不顯著。

2.1.2 不同雜草防除模式對(duì)大蔥根際土壤中涉及C、N和P循環(huán)相關(guān)酶活性的影響 由表2可知，與對(duì)照相比，除磷酸酶活性外，處理T2顯著提高了大蔥根際土壤中β-葡糖苷酶和氨肽酶的活性，分別提高了14.4 %和6.89 %。但處理T1僅顯著提高了大蔥根際土壤中β-葡糖苷酶的活性，氨肽酶和磷酸酶活性與對(duì)照之間無(wú)顯著差異。這一結(jié)果表明：處理T2比T1更有助于改善大蔥根際土壤中β-葡糖苷酶和氨肽酶的活性。

2.1.3 不同雜草防除模式對(duì)大蔥根際土壤微生物生物量C、N和P的影響 土壤微生物生物量的多少及其變化是土壤肥力高低及其肥力變化的重要依據(jù)之一[15-16]。由表3可知，與對(duì)照相比，除微生物生物量磷外，處理T2顯著提高了大蔥根際土壤中微生物生物碳和氮，分別提高了3.81和1.37倍，處理T1對(duì)土壤微生物生物量的影響呈現(xiàn)與處理T2相似的變化趨勢(shì)，該模式對(duì)微生物生物量碳和氮的提升效果分別為對(duì)照的3.47和1.25倍，與處理T2一樣均顯著高于對(duì)照，而且處理T2和T1之間無(wú)顯著差異。此外，微生物生物量磷在3個(gè)處理中均無(wú)顯著差異。結(jié)果表明：無(wú)論是處理T2亦或是處理T1均有助于提高或保持大蔥根際土壤的微生物生物量碳、氮和磷，有利于提高和保持大蔥根際的土壤肥力。

表1 不同雜草防除模式對(duì)大蔥產(chǎn)量及根際土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0. 05)，下同。

Note：Values followed by different lowercase letters in the same column are significantly different at 0.05 level. The same as below.

表2不同雜草防除模式對(duì)大蔥根際土壤酶活性活性的影響

Table 2 Effects of different mulching treatments on soil enzyme activities in rhizosphere of scallion

(nmol·g-1·min-1, 30 ℃)

表3 不同雜草防除模式對(duì)大蔥根際土壤微生物量碳、氮和磷的影響

2.2 基于高通量測(cè)序的大蔥根際土壤細(xì)菌多樣性分析

2.2.1 根際土壤細(xì)菌的Alpha多樣性分析 由表4可知，基于高通量測(cè)序技術(shù)，3個(gè)處理樣品得到的序列數(shù)均在3萬(wàn)條之上，3個(gè)樣品中產(chǎn)生的OTU總數(shù)量為2094個(gè)。其中CK、處理T1和T2分別為1937、1951和1981個(gè)。其中OTU數(shù)量最多的組合為處理T2，為1981個(gè)，最少的是CK，為1937個(gè)；本次研究獲得的細(xì)菌群落共33個(gè)門(mén)，75個(gè)綱，155個(gè)目，283個(gè)科，502個(gè)屬，958個(gè)種。在相似度97 %的分類水平下，基于I-sanger云數(shù)據(jù)分析平臺(tái)計(jì)算屬水平不同雜草防除模式下，大蔥根際土壤中細(xì)菌的豐富度、多樣性和均勻度指數(shù)。ACE指數(shù)和Chao指數(shù)用于估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)；此處選取ACE指數(shù)和Chao指數(shù)來(lái)表示物種豐富度，ACE指數(shù)和Chao指數(shù)排列順序?yàn)椋篢2>T1>CK，表明處理T2的土壤微生物物種豐富度更高；Simpson指數(shù)用于估算樣本中微生物多樣性，指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低；Simpson指數(shù)大小順序?yàn)椋篊K>T1>T2，表明CK物種多樣性最低，處理T2的物種豐富度更高；Heip指數(shù)用于衡量土壤細(xì)菌群落均勻度，指數(shù)值越大，說(shuō)明群落結(jié)構(gòu)更為均衡，Heip指數(shù)的排列順序?yàn)椋篢2>T1>CK，表明處理T2的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更均勻；Coverage是指各樣本文庫(kù)的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高，本試驗(yàn)中Coverage水平達(dá)到了近100 %。綜上所述，處理T2具有提高大蔥根際土壤細(xì)菌豐度、多樣性和均勻度的作用。

2.2.2 門(mén)分類水平的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群分析 根據(jù)土壤細(xì)菌群落柱狀堆疊圖(圖1)，可以直觀呈現(xiàn)兩方面信息，即：每一樣本在某一分類學(xué)水平上含有何種細(xì)菌和樣本中各種細(xì)菌的相對(duì)豐度?；陂T(mén)分類水平發(fā)現(xiàn)：雜草不同防除模式下，大蔥根際土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)有10種，分別為：變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)和Latescibacteria。其中，酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)在處理T2的根際土壤中分別比對(duì)照增加了28.08 %、7.53 %和74.59 %。酸桿菌門(mén)細(xì)菌是一類基于新分類方法劃分的細(xì)菌門(mén)，目前已有研究發(fā)現(xiàn)酸桿菌具有許多編碼纖維素酶和半纖維素酶的基因[17]。此外，土壤中擬桿菌門(mén)細(xì)菌主要參與土壤有機(jī)質(zhì)的分解[18]。綠彎菌門(mén)細(xì)菌屬兼性厭氧微生物，是一類可通過(guò)光合作用產(chǎn)生能量的細(xì)菌。

表4 不同處理大蔥根際土壤細(xì)菌測(cè)序序列統(tǒng)計(jì)及屬水平多樣性指數(shù)

2.2.3 屬分類水平的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌群分析 高通量測(cè)序結(jié)果基于屬分類水平(圖2)分析發(fā)現(xiàn)：不同雜草防除模式下大蔥根際土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌屬(>1 %)主要有假單胞菌屬(Pseudomonas)、硝化螺旋菌屬(Nitrospira)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、類諾卡氏屬(Nocardioides)、玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)、酸微菌屬(Acidibacter)、Gaiella、和Chryseolinea10個(gè)菌屬。其中，處理T1和T2中假單胞菌屬(Pseudomonas)變化幅度最大，比對(duì)照分別減少了486 %、925 %，假單胞菌屬細(xì)菌具有降解蛋白質(zhì)和淀粉的作用[19]；硝化螺旋菌屬細(xì)菌廣泛應(yīng)用于城市污水處理廠進(jìn)行生物脫氮[20]，鏈霉菌屬細(xì)菌廣泛分布于有機(jī)物豐富、酸度和含水量適中的土壤中對(duì)土壤中復(fù)雜有機(jī)物的礦化發(fā)揮重要作用。Chryseolinea具有降解單糖、二糖、多糖及部分有機(jī)酸的作用[21]。

圖1 不同處理大蔥根際土壤細(xì)菌門(mén)分類水平的相對(duì)分布Fig.1 Relative abundance distribution of species in different treatments at phylum level

圖2 不同處理大蔥根際土壤細(xì)菌屬分類水平的相對(duì)分布Fig.2 Relative abundance distribution of species in different treatments at genus level

3 討 論

土壤中的微生物生物量、酶活性以及微生物多樣性均可作為指示土壤肥力和評(píng)價(jià)土壤健康狀況的敏感生物學(xué)指標(biāo)[22-24]。不同雜草防除模式影響著大蔥根際土壤中可培養(yǎng)微生物數(shù)量，木糠覆蓋處理大蔥根際土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌數(shù)量與對(duì)照組之間均達(dá)到顯著性差異水平，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[25]，表明木糠覆蓋改變了大蔥根際微環(huán)境，改善了土壤結(jié)構(gòu)，為微生物創(chuàng)造了良好的生存和繁殖環(huán)境。木糠覆蓋處理大蔥根際土壤中β-葡糖苷酶活性顯著高于對(duì)照，人工除草和木糠覆蓋處理大蔥根際土壤中氨肽酶活性亦顯著高于對(duì)照，表明人工除草和木糠覆蓋處理促進(jìn)了大蔥根際土壤中碳和氮的轉(zhuǎn)化，提高了碳和氮的循環(huán)速率，改善了大蔥根際土壤的碳和氮肥力狀況，這一結(jié)果與白雪等[26]和李旺霞等[27]的研究結(jié)果相似。此外，木糠覆蓋具有常規(guī)地膜不具備的優(yōu)勢(shì)，木糠可逐漸被微生物分解，提高了土壤有機(jī)質(zhì)的含量。人工除草和木糠覆蓋處理大蔥根際土壤中微生物生物量碳、氮顯著高于對(duì)照，但微生物生物量磷與對(duì)照之間無(wú)顯著差異，這一結(jié)果與魏靜等[28]研究微生物生物量碳、氮和磷的結(jié)果相類似，表明人工除草和木糠覆蓋有利于豐富大蔥根際土壤中的碳和氮庫(kù)的儲(chǔ)備量，提高了大蔥根際土壤肥力。與人工除草方式相比，木糠覆蓋處理并未增加土壤中磷的含量，可能是木糠中磷含量不高導(dǎo)致微生物攝入或分解量不高等原因所致。

基于高通量測(cè)序結(jié)果可知，人工除草和木糠覆蓋模式均有助于提高大蔥根際土壤中細(xì)菌豐度、均勻度與多樣性指數(shù)，而且木糠覆蓋處理的提升效果更為顯著。此外，與對(duì)照相比，人工除草和木糠覆蓋處理雖然沒(méi)有顯著改變大蔥根際土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的組成，但顯著改變了根際土壤中不同優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的比例。其中，酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)和、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)是木糠覆蓋處理中顯著增加的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)；假單胞菌屬細(xì)菌則是人工除草和木糠覆蓋處理中顯著減少的優(yōu)勢(shì)菌屬。大蔥根際土壤中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌組成比例的變化可能與人工除草或木糠覆蓋改變了大蔥根際土壤的水分含量、溫度和光照等環(huán)境條件緊密相關(guān)。

4 結(jié) 論

木糠覆蓋防除雜草的模式可以改善大蔥根際土壤的健康狀況，提高大蔥產(chǎn)量，適宜作為南方大田作物生產(chǎn)中雜草生態(tài)防控的管理模式進(jìn)行規(guī)?；茝V。