蛇足石杉1株產生物堿內生真菌的分離鑒定

張 杰，劉 悅，羅慧琳，張 橋*

(1.齊魯醫(yī)藥學院 細菌耐藥與微生物分子系統(tǒng)學研究室，山東 淄博 255000；2.齊魯醫(yī)藥學院護理學院，山東 淄博 255000；3.齊魯醫(yī)藥學院 醫(yī)學檢驗技術專業(yè)，山東 淄博 255000)

【研究意義】內生真菌是一個具有豐富多樣性的生物類群，是人類進行趨利性開發(fā)和利用的重要的真菌資源，在各類植物體內廣泛分布。植物內生真菌(endophyte)最早由Debary(1866年)[1]提出，鑒于內生真菌與宿主在長期互作過程中與宿主形成了協同進化的關系，而沒有引發(fā)明顯的感染癥狀，致使關于內生真菌方面的研究成果鮮有報道。自1993年，Strobel 等[2]從短葉紫杉(Taxusbrevifolia) 中分離獲得一株能產生紫杉醇(抗癌)的內生真菌，越來越多的人們才逐漸意識到內生真菌與宿主植物間在化學和生態(tài)學方面的協同性關系，并對有生物學活性的次生代謝產物投入了更多關注，使得尋找和利用藥用植物內生真菌生產具有生物學活性物質而成為微生物學和天然藥物化學研究和開發(fā)的重要領域。【前人研究進展】蛇足石杉[Huperziaserrata(Thunb.)Trev.]，別名蛇足石松、千層塔等，為石杉科石杉屬多年生蕨類草本植物。藥學研究表明，蛇足石杉全草含生物堿，其中的石杉堿甲(Hup-A)及其類似物能選擇性抑制乙酰膽堿酶的活性[5]，因能起到提高學習記憶功能、改善血管性癡呆患者認知功能等藥理作用，對阻止早期老年癡呆進一步發(fā)展、維持殘存的腦功能、治療重癥肌無力等[6-12]而引起全世界科學家的共同關注，成為治療阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)最具前景的藥物[13-14]。由于眾多因素限制，石杉堿甲及其類似物的獲得至今仍無法進行工業(yè)化生產[15]。因此要解決藥源問題，尋找新的途徑勢在必行。鑒于藥用植物內生真菌具有的潛在重要的應用價值，【本研究切入點】本研究從蛇足石杉內分離獲得一株產生物堿的內生真菌，【擬解決的關鍵問題】為蛇足石杉生物堿的綜合利用開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植株 蛇足石杉：供試蛇足石杉[Huperziaserrata(Thunb.) Trev.]健康植株材料于2017年 5月由福建龍巖當地居民采集。

1.1.2 主要試劑與儀器 石杉堿甲對照品購于上海同田生物技術股份有限公司；引物(ITS1和ITS4)由生工生物工程上海股份有限公司合成；薄層色譜硅膠 GF254為青島海浪硅膠干燥劑廠制造；其他藥品為分析純。

恒溫搖床(ZHNY-2112B)，中國天津歐諾公司；Eppendorf AG 5424CP755468高速離心機，德國 Eppendorf 公司；旋轉蒸發(fā)儀 (RE-2000)，上海亞榮生化儀器廠。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar，PDA)，用于植株樣品內生真菌的形態(tài)研究，培養(yǎng)基中加入 15 μg/mL 鏈霉素用于分離純化內生真菌。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(potato dextrose broth，PDB)，用于內生真菌的搖床培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 內生真菌的分離培養(yǎng)、純培養(yǎng)和保存 本部分實驗操作參考閔長莉等[16]的方法并作了適當的改良。將采集的新鮮蛇足石杉植株先用自來水浸泡和沖洗，然后在無菌室按照如下程序操作：整株蛇足石杉先用75 % 酒精進行浸泡消毒 30 s，無菌水沖洗 4 次，接著用 10 % NaClO 浸泡 5 min，無菌水沖洗 4 次，最后再用75 %酒精浸泡消毒30 s，無菌水沖洗4 次，消毒完成后將根、莖、葉用滅菌鑷子和剪刀分開，并用無菌刀片將根和莖切成0.5 cm 大小帶斜口的段，葉片切成0.3 cm × 0.3 cm 小塊，獲得組織塊共計100塊。將根和莖以斜口面垂直于平板斜插入一半到含 15 μg/mL鏈霉素的 PDA 平板上，葉片貼覆到含有 15 μg/mL鏈霉素的 PDA 平板表面，隨后倒置于 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。同時將末次消毒的最后一次沖洗組織塊的無菌水涂布在PDA平板表面同樣條件下進行培養(yǎng)作為對照用以檢驗消毒效果。2 d 后逐日觀察，無菌操作法挑取在根、莖斜面和葉片切口及與之接觸的培養(yǎng)基表面所長出的菌絲，轉種到新鮮的 PDA 平板上，對于轉種生長繁殖的真菌，挑取菌絲尖端部分再次轉種分離純化，直到獲得純化的內生真菌為止。純化的內生真菌菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基上經培養(yǎng)后放置于 4 ℃冰箱保藏待用。

1.2.2 內生真菌的液體培養(yǎng)和發(fā)酵液粗提物的制備 將分離得到的蛇足石杉內生真菌接種到PDA斜面培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作菌株活化，待其長滿斜面后將活化的菌株分別接種于裝有100 mL PDL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中(每個菌株接種3瓶)，置于搖床上，28 ℃，120 r/min 振蕩培養(yǎng)10 d。振蕩培養(yǎng)10 d 后，在三角瓶中加入100 mL乙酸乙酯，放置于搖床上120 r/min，12 h。之后分裝于離心管中，4000 r/min離心10 min，取上清，所得水相繼續(xù)用等體積的乙酸乙酯萃取2次。合并有機相，然后用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至干，再用10 mL乙酸乙酯溶解，取出烘干，最后用 2 mL甲醇溶解，冷凍保存待用。

1.2.3 產石杉堿甲內生真菌的初步篩選 ①生物堿檢測。選用碘化鉍鉀試劑、碘化汞鉀試劑、碘-碘化鉀試劑和硅鎢酸試劑作為蛇足石杉內生真菌發(fā)酵液生物堿的檢測試劑。取保存的發(fā)酵液粗提物0.5 mL于1.5 mL離心管中，共裝4管，分別加入3滴生物堿沉淀反應試劑，靜置30～60 min后觀察結果。②產石杉堿甲內生真菌的篩選。薄層層析法參照 Zhang et al.[17]等方法進行產石杉堿甲內生真菌的初步篩選。層析板采用GF254硅膠板，用毛細管將石杉堿甲對照品溶液、待檢樣品溶液以及待撿樣品溶液和對照品溶液的混合液在硅膠板上分別點樣，然后置于層析缸中，展開劑為丙酮∶氯仿∶異丙醇(4∶4∶2，體積比)溶液，在紫外線下照射顯示熒光。通過Rf值初步篩選產石杉堿甲的菌株。設置不產生物堿內生真菌發(fā)酵液和不接種內生真菌的PDL作為對照組。

1.2.4 蛇足石杉內生菌菌株的形態(tài)學研究和鑒定 采用點種法將蛇足石杉內生真菌接種于 PDA平板上置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，依照真菌的經典分類鑒定方法，進行形態(tài)學研究。肉眼觀察內生真菌菌落的的宏觀形態(tài)特征，包括菌落形狀、正反面顏色、菌落大小、邊緣特征、菌絲性狀、生長速度和菌絲體等情況。用透明膠帶以菌落中心向邊緣的方向粘取菌落的表面菌絲，置于普通光學生物顯微鏡觀察孢子梗、孢子的有無、孢子形狀以及孢子顏色或其他產孢結構等微觀特征。參考相關菌物分類學專著確定菌株的屬種[18-20]。

1.2.5 蛇足石杉內生真菌的分子系統(tǒng)學研究 ①供試菌株基因組DNA的提取。將產生物堿內生真菌種入PDA平板表面，在28 ℃條件下培養(yǎng)3～7 d后刮取菌絲放入滅菌的研缽中，再加入液氮充分研磨，最后用CTAB法提取基因組DNA。②PCR擴增。擴增和測序所用的引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)與ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)(White et al，1990)，上海生工生物工程技術有限公司合成。擴增體系(50 μl)：2×PowerTaqPCR MasterMix(25 μl)；Primer1(2 μl，0.2 μmol/L)；Primer2(2 μl，0.2 μmol/L)；DNA模板(2 μl)；ddH2O(19 μl)。擴增條件：95 ℃ 預變性 3 min；35個循環(huán)：94 ℃ 變性 1 min，55 ℃ 復性 1 min，72 ℃ 延伸1 min 20 s；72 ℃ 延伸 10 min。用含G-Red的1.0 % 瓊脂糖凝膠對擴增產物檢測，然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司青島分公司進行產物純化和測序。 ③構建系統(tǒng)發(fā)育樹。將獲得的ITS序列與GenBank/EMBL/DDBJ核酸數據庫中已經錄入的序列進行BLAST search，并下載數據庫中近緣菌株的序列，用于構建系統(tǒng)發(fā)育樹。用Clustalx1.83進行多序列比對(Alignment)，比對結果利用MEGA6.0軟件采用Maxium Likelihood統(tǒng)計學方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設置為1000。

2 結果與分析

2.1 產生物堿內生真菌的篩選

2.1.1 生物堿試劑沉淀法檢測 生物堿試劑的沉淀反應結果分別為淡紅棕色沉淀、白色沉淀、淡褐色沉淀和白色沉淀。經過篩選，獲得均產生沉淀的菌株1株，菌株編號為LYS081(表1)。

2.1.2 薄層色譜法檢測 采用GF254硅膠板對內生真菌 PDL 的發(fā)酵液粗提物進行薄層層析(TLC)，再用疑似菌株進行第二批次的發(fā)酵、萃取和薄層層析(圖1)。檢測發(fā)現，菌株LYS081的發(fā)酵液粗提物呈現與 HupA 標準品的遷移率(Rf值)非常接近，其Rf值均為0.5882，石杉堿甲標準品Rf值為 0.6176。但和標準品混合后，在薄層層析結果圖上的斑點并沒有重合。

表1生物堿試劑與蛇足石杉內生真菌發(fā)酵液沉淀反應

Table 1 Precipitation reaction between alkaloid reagents and broth produced by endophytic fungi fromHuperziaserrata

MLYS02LYS081碘化汞鉀--+硅鎢酸--+碘-碘化鉀--+碘化鉍鉀--+

注：+：產生沉淀；-：不產生沉淀;M：PDB培養(yǎng)基提取物。

Note: +: Positive results; -: Negative results.

C：石杉堿甲標準品；1：PDB培養(yǎng)基提取物；2、4：分別為菌株LYS02、LYS081培養(yǎng)濾液提取物；3：菌株LYS081培養(yǎng)濾液提取物與石杉堿甲標準品混合物C: Standard HupA sample; 1: The extracts of potato dextrose medium; 2, 4: Metabolite of strain LYS02, LYS081; 3: The mixture of HupA and metabolite of strain LYS081圖1 蛇足石杉內生菌PDB中發(fā)酵液提取物的TLCFig.1 TLC analysis of extracts of fermentation by Huperzia serrata endophytic fungi in PDB

2.2 蛇足石杉內生菌菌株的形態(tài)學特征和鑒定

菌株LYS081在PDA平板上經28 ℃的恒溫暗培養(yǎng)，4 d 后菌落直徑85 mm，生長速度快。菌落正面白色，絮狀菌絲，菌落中心氣生菌絲有逐漸消失趨勢，背面米黃色(圖2A、B)。菌絲有隔，色淺，寬4～10 μm(圖2C)。分生孢子梗單生(圖2D、F)，有分枝(圖2D)，長約20～30 μm，瓶梗單個或簇生，在瓶梗頂端產生瓶梗孢子(圖2D、E)，瓶梗孢子聚集成頭部(圖2E、F)，瓶梗孢子單細胞，圓形或卵圓形，色淺，透明或半透明，瓶梗孢子大小為3～5 μm。經查閱相關菌物學專著文獻[18-20]，發(fā)現以上特征符合木霉屬(Trichoderma)真菌的形態(tài)特征，形態(tài)學確定隸屬于木霉屬(Trichoderma)。

2.3 基于ITS 序列的分子系統(tǒng)學分析

將獲得的ITS序列與GenBank/EMBL/DDBJ核酸數據庫中已經錄入的序列進行BLAST search，并下載數據庫中近緣菌株的序列，同時將該序列錄入核酸數據庫，獲得登錄號(accession number)MH321525.1，該序列和下載序列一并用于構建基于rDNA ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。

菌株LYS081在系統(tǒng)樹上與康寧木霉[Trichodermakoningiopsis(KY568699.1)]聚在一起，支持率86 %，他們之間的相似性很高，達到了99 %，說明有著很高的同源性，在發(fā)育關系上有著很近的距離。LYS081和參考株康寧木霉[Trichodermakoningiopsis(KY568699.1)]的遺傳距離有0.0248，大于0.01，存在較大的分歧。綜合系統(tǒng)發(fā)育分析和序列遺傳距離數據，結合形態(tài)學特征，菌株LYS081隸屬于木霉屬(Trichoderma)，較難鑒定到種，明確界定種屬需要進一步的分析和研究。

A、B：在PDA平板上28 ℃培養(yǎng)形成色白色菌落，85 mm/4d，A正面，B反面；C：菌絲，菌絲有隔；D、E和F：產孢結構，分生孢子梗單生，有分枝，瓶梗簇生，分生孢子聚集黏連成頭部；G：分生孢子，單細胞，圓形或卵圓形。A、B標尺為20 mm；C、D、E、F、G為10 μmA and B: Forming white colony on PDA culture medium at 28 ℃ for 4 days, A: The obverse side, B: The reverse side; C: Hypha,septate hypha; D,E and F: Spore-formed structure; G: Conidia. Bars: A and B=20 mm; C, D, E, F and G=10 μm圖2 蛇足石杉內生真菌LYS081的菌落、產孢結構及分生孢子形態(tài)Fig.2 Morphological characters of strain LYS081

菌株名或種名后的括號為序列的登錄號；系統(tǒng)樹內節(jié)點處的數字表示bootstrap檢驗值；標尺刻度代表序列差異The accession number is shown in parenthesis; Numbers at the branch points indicated the value of bootstrap test support based on 1000 sets; The scale bar means sequence difference圖3 LYS081基于rDNA ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 LYS081 phylogenetic tree based on rDNA ITS sequence

3 討 論

植物內生真菌與宿主在長期互作用中逐漸演化形成了一種互惠共生的關系，可產生與植株相似，甚至相同的具有生物活性的次生代謝產物，開發(fā)和利用內生真菌產具有生物學活性的物質成為目前國內外研究的新領域和熱點。木霉屬(Trichoderma)真菌菌屬于半知菌亞門(Deuteromycotina)絲孢綱(Hyphomycetes)叢梗孢目(Moniliales)叢梗孢科(Moniliaceae)，廣泛存在于自然界。Weindling[21](1932年)研究發(fā)現木霉屬真菌有著對植物病原真菌的拮抗作用，開發(fā)和利用木霉菌進行生防有了較大進展。據報道，木霉屬真菌對Rhizoctoniasolani、Fusariumspp、Sclerotiumrolfsii和Phythiumspp.等植物病原菌具有拮抗作用[22-23]；魏洪璇等[24]報道哈茨木霉(Trichodermaharzianum)發(fā)酵液具有廣譜抗菌活性和抗腫瘤活性。

生物堿是一類廣泛存在于生物界重要的天然化合物，有著顯著的生物學活性?，F有報道表明，植物內生真菌能夠產生數十種生物堿，這些生物堿具有拮抗病原菌、拮抗線蟲等多種生物學活性。隨著1993年，Strobel 等[2]從短葉紫杉(Taxusbrevifolia) 中分離獲得一株能產生紫杉醇(抗癌)的安德氏紫杉霉(Taxomycesandreanae)內生真菌，發(fā)現越來越多的植物內生真菌能產生和宿主植物相同或相似的活性物質。如，抗腫瘤藥物喜樹堿[25]、抗菌和抗腫瘤活性的吲哚二酮哌嗪類生物堿[26]、收縮血管效用的麥角類生物堿[27]、乙酰膽堿酯酶高抑制活性的石杉堿甲[28]等。本研究中，對分離獲得的蛇足石杉內生真菌進行生物堿和疑似產石杉堿甲的菌株進行初步篩選，發(fā)現菌株LYS081能合成生物堿。該菌株產生的生物堿是什么，有什么樣結構，有無乙酰膽堿酯酶抑制活性、或有無拮抗植物病原菌活性、或有無抗腫瘤活性，活性機制是什么，其產量如何，遺傳穩(wěn)定性如何，都值得進一步研究，這將為利用內生真菌發(fā)酵生產乙酰膽堿酯酶抑制性物質提供新的菌種支持。