產(chǎn)阿扎霉素F菌株Streptomyces malaysiensis 種子培養(yǎng)條件研究

張 慶，白亭亭，李銘剛，施竹鳳，楊群輝，彭榮珍，楊明英，楊佩文，王家銀,趙黎明

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205；2.云南大學(xué)，云南 昆明 650091；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，云南 昆明 650205;4.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 成都 610066)

【研究意義】 阿扎霉素F系列化合物是從云南省寧蒗縣土壤樣品中分離篩選得到的一株鏈霉菌所產(chǎn)生的具有獨(dú)特大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的抗生素，該抗生素具有廣譜的抗真菌活性，具有開發(fā)為新型殺菌劑的潛力[1]。前期試驗(yàn)結(jié)果表明，菌種是從自然界中篩選的野生菌株，目標(biāo)化合物產(chǎn)量較低，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。因此，需要通過改進(jìn)生產(chǎn)菌株的種子質(zhì)量，創(chuàng)造適合菌體生長(zhǎng)的最佳條件，充分發(fā)揮菌種的生產(chǎn)潛力，從而實(shí)現(xiàn)提高目標(biāo)化合物發(fā)酵產(chǎn)量的目的?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程中，通過培養(yǎng)獲得質(zhì)量?jī)?yōu)良的種子是整個(gè)發(fā)酵工藝的前提[2-3]。培養(yǎng)基組成(如碳源、氮源、磷酸鹽等的種類和濃度)和培養(yǎng)條件(如溫度、酸堿度、溶解氧等)是對(duì)菌體生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)物的生物合成、產(chǎn)品的分離精制乃至產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量都能直接或間接地產(chǎn)生影響的重要因素。通過優(yōu)化培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件，可實(shí)現(xiàn)提高菌株種子質(zhì)量的目的[4-5]。Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)和響應(yīng)面分析(Response Surface Analysis，RSA)試驗(yàn)是優(yōu)化培養(yǎng)基組成常用的方法。通過PB試驗(yàn)，可以從多個(gè)考察因素中快速有效地篩選出主要因素，是RSA試驗(yàn)的前提[6]。RSA試驗(yàn)則是采用多元二次回歸方程的方法，擬合主要考察的各因素與其響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)函數(shù)響應(yīng)面和等高線的分析以及試驗(yàn)指標(biāo)的各因子水平及其交互作用分析，確定各考察因素最優(yōu)參數(shù)的試驗(yàn)方法[7-8]?！颈狙芯康那腥朦c(diǎn)】在菌株ECO-00002工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)實(shí)踐中，菌株種子的優(yōu)劣直接影響到菌株發(fā)酵周期和阿扎霉素F系列化合物的產(chǎn)量。因此，有必要進(jìn)行種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件篩選優(yōu)化研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬通過菌株種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化，提高菌體生物量，為后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)物的形成打下基礎(chǔ)，指導(dǎo)工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 菌株

云南大學(xué)微生物研究所保藏菌種馬來西亞鏈霉菌S.malaysiensisECO-00002。

1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基[9]：酵母膏4 g，葡萄糖4 g，麥芽膏5 g，復(fù)合維生素(維生素B11 mg，維生素B61 mg，核黃素1 mg，煙酸1 mg，苯丙氨酸1 mg，生物素1 mg，丙氨酸0.3 mg)，微量鹽(FeSO4·7H2O20 mg，MnCl2·2H2O 10 mg，ZnSO4·7H2O 10 mg)，瓊脂20 g，水1000 mL，pH 7.5，制作平板和試管斜面。液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖14.5 g，酵母膏15 g，麥芽膏20 g，CaCO33 g，MgSO4·7H2O 1 g，MnSO4·4H2O 0.1 g，KH2PO40.2 g，水1000 mL，pH7.5。

PB試驗(yàn)培養(yǎng)基和RSM試驗(yàn)種子培養(yǎng)基：采用STATISTICA 6.0進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并配制相應(yīng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基于1×105Pa下滅菌20 min。

1.3 PB和RSA試驗(yàn)方法

采用PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察主要的碳氮源成分對(duì)種子生長(zhǎng)的影響，篩選適宜的碳氮源；在此基礎(chǔ)上，采用RSA試驗(yàn)優(yōu)化適宜碳氮源的比例。具體方法：將供試菌株接種于斜面試管培養(yǎng)基上，然后置于28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)120 h。再用滅菌蒸餾水洗下菌體，并按照10 % 的接種量接入裝有100 mL 種子培養(yǎng)基(PB培養(yǎng)基和RSA培養(yǎng)基)的500 mL 三角瓶中，并于28 ℃、200 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)48 h。待培養(yǎng)結(jié)束，種子液用濾紙過濾后，于80 ℃烘干至恒重，并稱取菌體生物量。

1.4 復(fù)合維生素、復(fù)合鹽和CaCO3的優(yōu)化試驗(yàn)方法

在確定種子生長(zhǎng)適宜碳氮源的基礎(chǔ)上，優(yōu)化種子培養(yǎng)基中的復(fù)合維生素(維生素B11 mg/L、維生素B61 mg/L、核黃素1 mg/L、煙酸1 mg/L、苯丙氨酸1 mg/L，生物素1 mg/L，丙氨酸0.3 mg/L)、復(fù)合鹽(MgSO4·7H2O 1.00 g/L、MnSO4·4H2O 0.10 g/L、KH2PO40.20 g/L)和CaCO3(3.00 g/L)的比例。各因素的比例分別按初始液體種子培養(yǎng)基中的比例設(shè)置添加與不添加2個(gè)處理，試驗(yàn)方法和測(cè)定方法同上。

1.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)方法

在培養(yǎng)基篩選優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行起始pH、搖瓶裝液量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)。分別設(shè)置初始pH為4、5、6、7、8、9等6個(gè)梯度和種子瓶裝液量為80、100、120、140、160、180 mL/500 mL等6個(gè)梯度試驗(yàn)，試驗(yàn)方法和測(cè)定方法同上。

1.6 不同培養(yǎng)條件對(duì)種子生物量的影響試驗(yàn)和方法

根據(jù)培養(yǎng)基篩選優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果，配制種子培養(yǎng)基，并根據(jù)優(yōu)化的培養(yǎng)條件，進(jìn)行種子培養(yǎng)，考察優(yōu)化前后菌株種子生長(zhǎng)情況，試驗(yàn)方法和測(cè)定方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 PB試驗(yàn)結(jié)果與分析

對(duì)種子培養(yǎng)基組成中的葡萄糖、酵母膏、麥芽膏、(NH4)2SO4、NaNO3等5個(gè)碳氮源因素進(jìn)行篩選，每個(gè)因素設(shè)高低2個(gè)水平，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表1～2所示。回歸分析表明，葡萄糖、酵母膏以及麥芽膏是主要的影響因素，3者在大于95 %的概率水平上差異顯著，其它2個(gè)因素(NH4)2SO4和NaNO3在95 %的概率水平上差異不顯著，由此確定葡萄糖、酵母膏和麥芽膏為主要因素進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 種子培養(yǎng)基中的碳氮源篩選PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2 種子培養(yǎng)基中的碳氮源篩選統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.2 RSA試驗(yàn)結(jié)果與分析

在PB試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以麥芽膏2.0 %為比例，對(duì)葡萄糖和酵母膏的配比進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果用STATISTICA 6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表3～4和圖1所示。各因素之間有一定交互作用，二次方模型與上述結(jié)果的擬合較好(模型的R2>0.98)。模型為： mycelia cake=5.43624+0.11894 ×葡萄糖濃度(%)+3.12863×酵母膏濃度(%)-0.91677×葡萄糖濃度(%)2-1.42188×酵母膏濃度(%)2+1.50750×葡萄糖濃度(%)×酵母膏濃度(%)，各因素優(yōu)化的比例：葡萄糖濃度1.45 %，酵母膏濃度1.50 %，麥芽膏2.00 %。

2.3 復(fù)合維生素、復(fù)合鹽和CaCO3的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

在PB試驗(yàn)和RSA試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)置添加與不添加2個(gè)處理，考察復(fù)合維生素、復(fù)合鹽和CaCO3對(duì)種子生物量的影響，試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合鹽和CaCO3對(duì)菌株生物量有較大影響，而復(fù)合維生素的影響不明顯。種子培養(yǎng)基中可以不加復(fù)合維生素，但必須加復(fù)合鹽和CaCO3。

2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 起始pH對(duì)種子生物量的影響 不同起始pH對(duì)菌株種子生物量的影響試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。從表6可以看出，當(dāng) pH<5時(shí)菌株生長(zhǎng)較差，生物量低；當(dāng)pH為7～8時(shí)，菌株生長(zhǎng)較好，生物量最高，隨著pH持續(xù)升高，生物量反而下降。因此，選擇種子培養(yǎng)基的初始pH為7.5。

表3 RSA試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 RSA試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

2.4.2 裝液量對(duì)種子生物量的影響 不同種子瓶裝液量對(duì)菌株生物量的影響試驗(yàn)結(jié)果如表7所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，在80、100、120、140、160、180 mL等6個(gè)梯度種子瓶裝液量試驗(yàn)中，裝液量與菌體生物量呈反比，則隨著裝液量的增加，菌體生物量逐漸降低。但綜合考慮種子瓶的利用效率，500 mL三角瓶裝種子培養(yǎng)基的量選擇100～120 mL為適宜。

圖1 RSA試驗(yàn)確定響應(yīng)最大值Fig.1 The maximum response value determined by RSA test

項(xiàng)目Item復(fù)合維生素Multivitamin復(fù)合鹽Inorganic salt碳酸鈣CaCO3添加Added不添加Not added添加Added不添加Not added添加Added不添加Not added生物量(%)Biomass5.715.866.803.045.363.1148 h pH5.245.135.065.784.935.25

表6 起始pH對(duì)菌株種子生物量的影響

表7 種子瓶裝液量對(duì)菌株種子生物量的影響

2.5 不同培養(yǎng)條件對(duì)種子生物量的影響

以初始種子培養(yǎng)條件為對(duì)照，考察了優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下菌株種子生長(zhǎng)情況，試驗(yàn)結(jié)果如表8所示。在優(yōu)化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，菌株生物量(菌絲體干重)由原來的4.09 g提高到8.91 g，提高率為117.70 %(P<0.01)。

3 討 論

3.1 培養(yǎng)基成分對(duì)種子質(zhì)量的影響

在微生物發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)中，培養(yǎng)生理狀態(tài)好、生長(zhǎng)快、菌體生物量高、延滯期短的優(yōu)良種子是獲得目標(biāo)化合物高產(chǎn)的先決條件[10-12]。不同培養(yǎng)類型的微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素(碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子等)的需求不同，需要根據(jù)所培養(yǎng)菌種對(duì)營(yíng)養(yǎng)要素和生長(zhǎng)條件的需求，進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，才能獲得優(yōu)良的菌株種子[13-15]。目前種子培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)常用的方法有單因子試驗(yàn)法、正交試驗(yàn)法和響應(yīng)面試驗(yàn)法等多種方法。單因子試驗(yàn)法主要確定單一因素對(duì)菌株生物量的影響，而不能研究各因素間的交互作用[16]。正交試驗(yàn)法可以同時(shí)考察多個(gè)因素對(duì)菌株生物量的影響，既能同時(shí)考察多個(gè)因素對(duì)菌株生物量的影響，又能研究多個(gè)因素之間的交互作用，從而求得因素和響應(yīng)值之間的回歸方程，試驗(yàn)次數(shù)少、周期短，是優(yōu)化種子培養(yǎng)基的一種有效辦法[17-19]。陳光義等通過對(duì)產(chǎn)環(huán)己酰亞胺的菌株種子培養(yǎng)基優(yōu)化，目標(biāo)化合物的產(chǎn)量比原始產(chǎn)量提高了10.7 %[9]。劉金國等采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)鏈霉菌702的種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，目標(biāo)活性化合物的生物效價(jià)提高了27.7 %[4]。本試驗(yàn)采用 PB試驗(yàn)法，從葡萄糖、酵母膏、麥芽膏、(NH4)2SO4、NaNO3等5個(gè)影響因素中，篩選出具有顯著影響的因素為葡萄糖、酵母膏和麥芽膏，進(jìn)一步通過RSA試驗(yàn)法確定了3 個(gè)因素的最優(yōu)水平，菌株生物量比原始培養(yǎng)條件下提高了117.70 %，優(yōu)化效果顯著，表明PB試驗(yàn)法和RSM試驗(yàn)法相結(jié)合，可以快速、有效地從多個(gè)因素中，篩選出主要的影響因素，確定其最優(yōu)值。

表8 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株種子生物量的影響(X±SE)

3.2 種子培養(yǎng)條件對(duì)種子質(zhì)量的影響

菌株種子的質(zhì)量好壞是影響發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)水平的重要因素，除營(yíng)養(yǎng)條件外，種子生長(zhǎng)條件也是決定其質(zhì)量好壞的主要條件[20]。在種子培養(yǎng)過程中，保持菌株生長(zhǎng)所需的最適溫度，則有利于菌體快速生長(zhǎng)，從而可以縮短生長(zhǎng)期。而pH值是微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動(dòng)的綜合指標(biāo)，每一類微生物都有其最適的和能耐受的pH值范圍，它對(duì)菌體的生長(zhǎng)也有較大影響。同時(shí)，良好的氧氣供應(yīng)是好氧微生物生長(zhǎng)最重要條件之一，裝液量直接決定微生物生長(zhǎng)過程中獲得溶解氧量的高低。一定的轉(zhuǎn)速下，裝液量越少，微生物獲得的溶解氧越高，菌株生長(zhǎng)越旺盛。培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短則是影響種子質(zhì)量和濃度的另一個(gè)重要因素，種齡過長(zhǎng)或過短，不但會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期，而且會(huì)降低產(chǎn)量[21-22]。觀察供試株菌ECO0002種子生長(zhǎng)過程可以發(fā)現(xiàn)，隨著菌體的生長(zhǎng)，生物量不斷提高，到40 h時(shí)達(dá)到最大，之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，生物量變化不大。表明40 h時(shí)，菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中后期，作為種子液最為適宜。

4 結(jié) 論

阿扎霉素產(chǎn)生菌馬來西亞鏈霉菌ECO-00002種子生長(zhǎng)的主要影響碳源為葡萄糖、酵母膏、麥芽膏，各因素的最大響應(yīng)值為葡萄糖1.45 %，酵母膏1.50 %，麥芽膏2.00 %；無機(jī)鹽為CaCO33.00 g/L、MgSO4·7H2O 1.00 g/L、MnSO4·4H2O 0.10 g/L、KH2PO40.20 g/L，初始pH 7.50，裝液量100 mL/500 mL，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為200 r/min振蕩培養(yǎng)40 h。在優(yōu)化的種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，菌體生物量由原來的4.09 g提高到8.91 g，提高率為117.70 %，優(yōu)化效果顯著。