亞洲6國普通野生稻群體遺傳多樣性分析

黃 娟，高利軍，高 菊，卿冬進，朱昌蘭，周維永

(1. 廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室/廣西作物遺傳改良重點實驗室，廣西 南寧 530007；2. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045；3. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】亞洲栽培稻是世界上最古老的作物之一，是亞洲國家最重要的糧食作物[1]。然而在目前的水稻育種中，由于骨干親本的遺傳背景狹窄，水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗性等的提高難以實現(xiàn)大幅度的突破。普通野生稻是亞洲栽培稻的祖先種，在長期的自然生長過程中為適應(yīng)環(huán)境形成了形態(tài)的多樣性并蘊含著豐富的基因資源，對其遺傳多樣性的分析比較和鑒定評價，可促進野生近緣種的利用，拓展栽培稻的遺傳背景，提高選育效率[2-6]。普通野生稻廣泛分布于亞洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，特別是南亞、東南亞地區(qū)氣候濕熱多雨，是生物多樣性豐富的區(qū)域，對該區(qū)域內(nèi)普通野生稻群體多樣性進行分析和評價，對于進一步認識該物種的分布狀況及其演變演化有著重要意義[7]?！厩叭搜芯窟M展】關(guān)于亞洲國家普通野生稻多樣性，孫傳清等[8]認為從DNA水平上看中國普通野生稻的多樣性大于南亞和東南亞的普通野生稻，主要因為南亞及東南亞國家的普通野生稻屬于原始型和偏秈型，而中國的普通野生稻類型相對更豐富。Cai等[9]分析來自中國、印度、泰國和印度尼西亞的7個居群普通野生稻的遺傳結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)居群間的遺傳分化明顯，而其多樣性類型與地理環(huán)境有關(guān)。Shishido等[10]分析了來自緬甸境內(nèi)3個不同地區(qū)的16份普通野生的多樣性，并與栽培稻的秈粳兩個亞種進行比較，結(jié)果表明野生稻具有很多獨特的基因位點并且變化范圍更大。孫希平等[11]對中國以及東南亞3國的14個普通野生稻群體進行多樣性比對，發(fā)現(xiàn)中國野生稻總體多樣性高于東南亞國家的野生稻。梁新霞等[12]通過分析比較認為中國普通野生稻居群的遺傳多樣性高于越南、尼泊爾等亞洲國家，并且越南、柬埔寨等東南亞國家與中國普通野生稻關(guān)系較近，尼泊爾居群與中國普通野生稻關(guān)系較遠。Huang等[33]對來自亞洲以及大洋洲的446份普通野生稻以及1086份栽培稻進行測序分析，通過主成分分析表明供試野生稻可分為3種類型，居群結(jié)構(gòu)與地理分布密切相關(guān)；實驗材料中來自中國南部的大部分普通野生稻聚為一類，并且這一類型中來自珠江流域的普通野生稻首先演變?yōu)樵嫉木绢愋??！颈狙芯壳腥朦c】以亞洲境內(nèi)6個國家的野生稻自然群體為研究對象，按照居群取樣原則收集野生稻材料[13]。涉及南亞、東南亞的5個國家以及中國4個野生稻資源豐富的省區(qū)，材料范圍跨度大，遺傳多樣性代表性強?！緮M解決關(guān)鍵問題】利用微衛(wèi)星(SSR)分子標(biāo)記檢測多個國家野生稻自然群體的遺傳多樣性并進行分析，進一步明確亞洲國家普通野生稻居群的內(nèi)遺傳結(jié)構(gòu)、居群間的遺傳關(guān)系及多樣性特點等，為普通野生稻資源的合理利用以及稻種資源的演變演化研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為中國科學(xué)院植物研究所提供的280份普通野生稻資源，分別來自6個亞洲國家的11個自然居群(表1)，各居群地理分布見圖1。按照群體遺傳多樣性取樣原則，每個居群分別采集約30份材料進行分析。

表1 供試材料信息

圖1 供試居群分布Fig.1 Distribution of tested populations

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取 采用SDS[14]法提取供試普通野生稻葉片的DNA，紫外分光光度計測定濃度后，用 TE 稀釋保存。

1.2.2 SSR引物篩選 采用微衛(wèi)星(SSR)分子標(biāo)記對供試材料進行檢測，該分子標(biāo)記具有共顯性、多態(tài)性高及重復(fù)性強等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用。從120對備選SSR引物中篩出擴增效果好、多態(tài)性高且均勻分布于水稻 12 條染色體的 25 對引物(表2)。

表2 SSR引物信息

續(xù)表2 Continued table 2

引物Primer染色體Chromosome正向引物Forward sequence反向引物Reverse sequenceRM25411AGCCCCGAATAAATCCACCTCTGGAGGAGCATTTGGTAGCRM20611CCCATGCGTTTAACTATTCTCGTTCCATCGATCCGTATGGRM24712TAGTGCCGATCGATGTAACGCATATGGTTTTGACAAAGCGRM20A12ATCTTGTCCCTGCAGGTCATGAAACAGAGGCACATTTCATTG

1.2.3 DNA擴增 DNA擴增在Takara TP350擴增儀上進行，采用10 μl反應(yīng)體系。5.5 μl ddH2O，1 μl 10×PCR Buffer(含20 mmol·L-1Mg2+)，1 μl dNTPs(2.0 mmol·L-1)，1 μl Primer(2 μmol·L-1)， 0.5 μlTaq酶(2 U·L-1)，2 μl DNA(20 ng·μl-1)。反應(yīng)程序： 95 ℃ 5 min ℃，94 ℃40 s，56 ℃ 30 s(退火溫度隨引物而變)，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min[15]。擴增產(chǎn)物采用6 %聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分析，經(jīng)銀染、顯影，獲得擴增條帶并進行統(tǒng)計[16]。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 本試驗主要評價參試群體的遺傳多樣性，參考Nei等[17-18]提出的位點的等位基因數(shù)(A)、有效等位基因數(shù)(Ae)、預(yù)期雜合度(He)、實際雜合度(Ho)、固定指數(shù)(F)、香農(nóng)指數(shù)(I)、基因流(Nm)等參數(shù)來進行供試材料的遺傳多樣性度量，以上數(shù)據(jù)通過 POPGENE 3.2軟件及Excel 2007直接計算得到；居群的聚類分析通過 NTSYS 2.10以及Structure 2.2.4軟件分別進行分析和驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 居群整體遺傳多樣性評價

對供試材料的25對SSR引物評價的結(jié)果(表3)表明，25個SSR位點共檢測到442個等位基因，平均每個位點17.68個，期望雜合度達到0.87，香農(nóng)指數(shù)達到2.37，說明供試野生稻整體多樣性非常豐富，并且樣品個體間異質(zhì)性很高；基因流為1.69，說明這些居群間存在一定程度的基因交流。

表3 供試材料整體遺傳多樣性參數(shù)

續(xù)表3 Continued table 3

引物Primers等位基因數(shù)A有效等位基因數(shù)Ae實際雜合度Ho預(yù)期雜合度He香農(nóng)指數(shù)I固定指數(shù)F基因流NmRM287168.450.570.882.350.360.67RM254136.610.440.852.090.490.98RM2062112.020.440.922.680.520.63RM247179.690.480.902.450.460.82RM20A216.110.660.842.220.210.73平均值A(chǔ)verage17.328.710.510.872.340.430.72

表4 11個普通野生稻居群遺傳多樣性檢測

2.2 不同居群間的遺傳多樣性比較

多樣性分析結(jié)果(表4)表明，11個居群的平均等位基因數(shù)為3.28(P9)～10.12(P10)，平均有效等位基因數(shù)為2.06(P9)～6.22(P6)，期望雜合度為 0.43(P9)～0.84(P10)；實際雜合度為0.32(P5)～0.69(P6)；香農(nóng)指數(shù)為0.79(P9)～1.98(P10)。把不同居群的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、實際雜合度、預(yù)期雜合度及香農(nóng)指數(shù)等5項遺傳多樣性參數(shù)曲線作圖進行直觀比較，可以看到這5項參數(shù)在居群間的變化趨勢是相似的，最低值出現(xiàn)在來自中國廣東茂名的P9居群，最高值出現(xiàn)在來自中國海南南昌的P10居群以及來自越南的P6居群。整體而言，來自老撾的P2、P3居群，來自越南的P6居群以及來自中國海南南昌的P10居群的遺傳多樣性比較高。固定指數(shù)多數(shù)為正值，表示群體中以純合子居多，只有P8和P9兩個居群以雜合子居多，說明進一步進行遺傳分化的潛力較大。自中國云南西雙版納的P11居群固定指數(shù)為0，說明該群體處于哈迪-溫格爾平衡狀態(tài)(圖2)。

2.3 6個國家間普通野生稻遺傳多樣性比較

由表5可知，6個國家普通野生稻多樣性遺傳參數(shù)變化情況如下：等位基因數(shù)變化范圍為6.12(柬埔寨)～13.00(中國)，有效等位基因數(shù)變化范圍為3.5(柬埔寨)～6.22(越南)，預(yù)期雜合度變化范圍為0.68(柬埔寨)～0.83(越南)，香農(nóng)指數(shù)變化范圍為1.36(柬埔寨)～2.02(老撾)。從各參數(shù)的變化可知，來自柬埔寨的野生稻材料各項指標(biāo)都為最低值，說明來自該區(qū)域的普通野生稻遺傳多樣性總體比較低，而較高值分別出現(xiàn)在越南、中國及老撾3個國家。越南的普通野生稻雖然只有一個居群，但表現(xiàn)出比較高的多樣性特征。綜合了2個居群數(shù)據(jù)結(jié)果的老撾普通野生稻各項指標(biāo)都有所提升，說明供試個體的增加提高了整個群體的遺傳多樣性。中國的5個普通野生稻居群整體等位基因數(shù)和香農(nóng)指數(shù)相比單個居群有所提升，但是預(yù)期雜合度與海南文昌居群相比卻略有下降。

圖2 11個普通野生稻居群的5項遺傳多樣性參數(shù)對比Fig.2 Comparison of 5 genetic diversity indexes of 11 O. rufipogon populations

表5 6個國家普通野生稻居群間遺傳多樣性檢測

2.4 不同居群普通野生稻的聚類分析

按照野生稻居群間遺傳一致度將所有居群進行聚類分析，結(jié)果(圖3)可部分反應(yīng)出居群之間的距離與遺傳一致度之間的相關(guān)性。來自老撾的2個居群VN01和VN02遺傳一致度達到了0.69，而與其緊密相鄰的越南居群與2個老撾居群的一致度也達到了0.63以上。在遺傳一致度為0.30處，可把所有居群分為3個類群，VN01、VN02、VT、KHM、WC、MMR和NEP等7個居群聚為一類，標(biāo)為類群I；來自中國云南西雙版納的居群JH獨立成為一個類型，標(biāo)記為類群II；來自中國賀州、北海、茂名的3個居群聚集為類群III。

2.5 不同國家普通野生稻的聚類分析

將供試普通野生稻按照國家分類后進行聚類分析，結(jié)果(圖4)表明，越南、柬埔寨和老撾3個國家普通野生稻的遺傳一致度達到了0.52以上，特別是老撾與越南，其遺傳一致度達到了0.69；而中國與尼泊爾的普通野生稻一致度達到了0.50，表現(xiàn)出較高的親緣關(guān)系。來自緬甸的普通野生稻居群與其他國家表現(xiàn)出比較遠的親緣關(guān)系。

圖3 11個普通野生稻居群的遺傳聚類圖Fig.3 Genetic clustering diagram of the tested 11 O. rufipogon populations

圖4 6個國家普通野生稻的遺傳聚類圖Fig.4 Genetic clustering diagram of O. rufipogon from 6 different countries

圖5 設(shè)定不同K值的△K變化Fig.5 △K value at different K

2.6 基于Structure軟件的普通野生稻居群結(jié)構(gòu)分析

利用Structure 2.2.4軟件對來自亞洲6個國家的11個居群的普通野生稻材料進行遺傳結(jié)構(gòu)分析，以進一步解析供試材料的居群結(jié)構(gòu)特征，利用軟件計算結(jié)果lnP(D)(±SD)[19]來推測最優(yōu)K值而確定群體的潛在遺傳結(jié)構(gòu)數(shù)目。由于本試驗中l(wèi)nP(D)值沒有出現(xiàn)拐點，因此通過計算△K[lnP(D)的校訂值]來確定K值[20-21]，圖5顯示K=11時出現(xiàn)拐點，說明供試普通野生稻可分為11個潛在遺傳支系，與自然群體基本一致。

通過K值的確定得到供試普通野生稻的遺傳結(jié)構(gòu)(圖6)，圖中數(shù)字1～11對應(yīng)表1中各居群的信息來源，11種顏色表示11個潛在的分支，與自然居群的劃分基本一致。由圖6可知，來自老撾的P1與P2居群大部分個體同為綠色，說明其分化不明顯，其中P2居群以及P10居群(中國海南文昌)的部分個體與來自越南的P6居群同為黃色，具有相同的血統(tǒng)，從遺傳距離計算上也體現(xiàn)出了這幾個地區(qū)的高相似度。來自緬甸的P5居群內(nèi)部分化為2個分支，來自中國海南的P10居群有3個明顯的分支，說明這2個居群本身有潛在的遺傳分化。

3 討 論

本研究中，供試的亞洲6國普通野生稻具有豐富的遺傳多樣性。本試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示遺傳多樣性檢測中的重要指標(biāo)期望雜合度(He)達到0.87，香農(nóng)指數(shù)(I)為2.34，高于前期對東南亞及中國野生稻居群的遺傳多樣性評價數(shù)值[11-12, 27]及其他地區(qū)普通野生稻多樣性研究的參數(shù)水平[22-25]，說明供試材料總體多樣性較豐富。本試驗使用Structure軟件對野生稻材料進行分析，通過多位點基因型數(shù)據(jù)構(gòu)建混群模型來揭示隱藏的群體遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)，從結(jié)構(gòu)圖上可直觀的判斷某個體歸屬的群體。分析結(jié)果表明，11個潛在的遺傳分支基本與供試的野生稻自然居群一致，說明中國南方省區(qū)(廣西、廣東、云南及海南)與越南、老撾、柬埔寨、緬甸及尼泊爾等亞洲國家普通野生稻居群之間的遺傳分化較明顯；基因流檢測結(jié)果表明亞洲國家的普通野生稻并不是孤立的，在漫長的演變演化過程發(fā)生了基因間的交流，相同的氣候環(huán)境條件下促進了類似的遺傳多樣性演變。

圖6 野生稻自然居群的遺傳結(jié)構(gòu)Fig.6 Genetic structure of tested natural population of O. rufipogon

普通野生稻的遺傳多樣性在亞洲各地區(qū)的分布表現(xiàn)出比較明顯的地域性。位于中南半島東南方向的越南、老撾和柬埔寨緯度較低，熱帶季風(fēng)氣候顯著，普通野生稻具有較近的親緣關(guān)系，越南與老撾的普通野生稻遺傳一致度高達0.69。緬甸位于中南半島的西部，東南部的泰國將其與半島東部的國家隔離，緯度上與中國及尼泊爾相距較遠，因此該地區(qū)的野生稻表現(xiàn)出與其他國家較遠的親緣關(guān)系。本研究中，中國海南文昌的野生稻居群與老撾和越南居群有較近的遺傳關(guān)系，從Structure以及居群聚類圖上也可直觀地看出老撾、越南及中國海南文昌的普通野生稻居群具有部分相同親緣關(guān)系，因而被歸為一個類群(I)。在地理位置分布上，中國海南文昌居群與老撾和越南居群間存在海洋的隔離，但由于這3個地區(qū)具有相似的高溫高濕熱帶季風(fēng)氣候，遺傳演化更相似，與內(nèi)陸地區(qū)的其他居群表現(xiàn)出較大的遺傳差異。來自中國云南西雙版納的居群(JH)獨立劃分為一個類群(II)，這樣的狀態(tài)與該居群的地理位置有較大的關(guān)系。該野生稻居群處于山區(qū)隔離狀態(tài)，阻斷外界基因交流，通過其自交而達到了群體內(nèi)的平衡狀態(tài)。從各國小居群之間的關(guān)系來看，來自老撾境內(nèi)的2個居群遺傳一致度非常高，中國南方區(qū)域的廣西、廣東居群之間表現(xiàn)出較為相近的親緣關(guān)系(居群聚類圖中標(biāo)記為類群III)，驗證了距離與遺傳關(guān)系理論模型[26]。

本研究中，越南P6居群、中國海南文昌P10居群以及老撾P1居群的普通野生稻表現(xiàn)出較高的多樣性特征，其中P10居群多樣性最為豐富，有3個潛在的分支結(jié)構(gòu)，除了地處海岸東部，充沛的降雨之外，較低的緯度也是這幾個居群遺傳多樣性較高的原因。中國云南、廣西及廣東的普通野生稻居群所在緯度較高，各項多樣性檢測指標(biāo)都處于較低水平。來自尼泊爾的野生稻居群位于該國南部地區(qū)，該地區(qū)受季風(fēng)及地形影響，雨量及熱量較充足，雖然緯度最高，但野生稻多樣性并不是最低，且與中國南方居群(海南居群除外)有較近的遺傳關(guān)系，可能是由于高緯度以及亞熱帶季風(fēng)氣候影響造成了兩國野生稻演化演變的相似性。綜合4個省區(qū)5個居群的普通野生稻多樣性數(shù)據(jù)后，中國普通野生稻的總體遺傳多樣性與老撾相當(dāng)，較越南單一居群稍低。根據(jù)前人研究結(jié)果可知中國普通野生稻的遺傳多樣性高于其他國家和地區(qū)[11-12, 32]，主要原因在于中國地域廣闊，野生稻類型多樣，在供試材料絕對數(shù)量和居群上要遠高于國外野生稻，因而總體表現(xiàn)出較高的多樣性。通過以上分析可知，中國以低緯度的海南地區(qū)的普通野生稻多樣性最為豐富，其他高緯度地區(qū)的野生稻多樣性相對較低；而東南亞等國家緯度偏低，普通野生稻普遍表現(xiàn)出較豐富的遺傳多樣性特征，體現(xiàn)了緯度與多樣性之間的相關(guān)性[27-28]。

普通野生稻是水稻遺傳改良的重要基因資源，亞洲普通野生稻具有豐富的遺傳多樣性。東南亞國家作為水稻的主要栽培地區(qū)，不但栽培稻資源類型多樣[29-33]，野生稻資源也具有其遺傳特異性，是水稻基因挖掘和品種改良的重要補充。為促進水稻品種的改良及資源的充分應(yīng)用，在今后的稻種資源收集和保存過程中，要促進與亞洲各國野生稻資源豐富的國家之間的交流和種質(zhì)資源的交換利用，以豐富我國稻種資源。

4 結(jié) 論

6個亞洲國家普通野生稻總體多樣性豐富，越南、老撾、柬埔寨及緬甸等東南亞國家及中國海南等地區(qū)由于緯度較低，其普通野生稻居群遺傳多樣性高。中國南方省區(qū)由于野生稻分布范圍廣泛，綜合遺傳多樣性較高。來自尼泊爾的野生稻居群由于受季風(fēng)及地形影響，多樣性高于中國緯度相似地區(qū)的野生稻。6個國家的普通野生稻存在基因交流，距離越近，交流越明顯。加強亞洲各國之間的野生稻資源收集，有助于提高我國稻種資源的利用效率，推動水稻育種進程。