分散固相萃取-高效液相色譜法測定谷物中的桔霉素

黃曉東,盧 健,謝飛飛

(1.安徽省生物制品與食品檢測檢驗及其標準化技術公共服務平臺,安徽蕪湖 241000;2.安徽工程大學生物與化學工程學院,安徽蕪湖 241000)

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分散固相萃取-高效液相色譜法測定谷物中的桔霉素

黃曉東1,盧 健2,謝飛飛2

(1.安徽省生物制品與食品檢測檢驗及其標準化技術公共服務平臺,安徽蕪湖 241000;2.安徽工程大學生物與化學工程學院,安徽蕪湖 241000)

目的:建立谷物中桔霉素含量的測定方法。方法:以60%乙醇作提取劑,C18吸附劑分散固相萃取凈化樣品中的桔霉素,應用高效液相色譜進行分析。結果:該方法標準曲線方程Y=3.13×10-7X-5.59×10-2,線性相關系數R2=0.9999,檢出限為0.005mg/L,重復性實驗精密度(RSD)為4.51%,加標回收率范圍為87.7%～96.4%,所測的三種谷物樣品桔霉素含量為0.116～0.385μg/g。結論:該方法簡便、準確,可用于谷物中桔霉素含量的測定。

分散固相萃取,桔霉素,谷物,高效液相色譜法

桔霉素(citrinin)是一種真菌產生的次級代謝產物,具有腎毒性。通常在污染的大麥、燕麥、大米和玉米等谷物中可能含有桔霉素[1],但我國還沒有建立相關的國家標準檢測方法。目前文獻報道的桔霉素檢測方法有高效液相色譜法[2]、酶聯免疫吸附法[3]、液質聯用分析法[4]、薄層層析法[5]、抑菌圈法[6]等。薄層層析法、抑菌圈法是較早用于毒素檢測的一種方法,方法簡單,但靈敏度相對較差,已遠遠不能滿足現代檢測要求。酶聯免疫法適合于大批量樣本的檢測,但重現性差,常常需要驗證。目前國外相關報道中多為高效液相色譜法和酶聯免疫吸附法,Dohnal等[7]選用反相高效液相色譜法進行檢測,以甲醇-磷酸鹽(80∶20)作為流動相,檢測波長為321nm,最低檢測限量可達100pg。高效液相色譜法、液質聯用分析法、氣質聯用分析法等方法靈敏、準確[8],但在桔霉素樣品前處理時有操作復雜、成本較高等缺陷。分散固相萃取法[9-11]是近幾年發(fā)展起來的前處理方法,將固相萃取吸附劑顆粒分散在樣品的萃取液中,省去了固相萃取法的繁瑣,方法更加快速、簡便。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米、小麥、大麥 產自安徽蕪湖;桔霉素標準品 純度≥99%,北京泰樂琪科技有限公司;乙醇(分析純)和乙腈(色譜純) 均購于國藥集團化學試劑有限公司;甲醇 色譜純,天津市大茂化學試劑廠；水為超純水。

1.2 儀器和設備

Prominence LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司;KQ-250E型超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;RE-85Z旋轉蒸發(fā)儀 上海青浦滬西儀器廠;TGL-16G高速離心機 上海安亭儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件 Shim-pack VP-ODS色譜柱(150mm×4.6mm,5μm);柱溫:28℃;流速:1.0mL/min;進樣量:10uL;流動相:乙腈∶甲醇∶水=70∶10∶20(以磷酸調pH為2.5);檢測器:熒光檢測器,激發(fā)波長331nm,發(fā)射波長500nm[2]。

1.3.2 桔霉素標準曲線的繪制 準確稱取1.0mg桔霉素固體標準品,用甲醇配制成100mg/L桔霉素標準儲備液。取一定量的儲備液,用甲醇逐級稀釋成濃度分別為10.0、5.0、1.0、0.25、0.1、0.05mg/L的桔霉素標準溶液,在選定色譜條件下進行HPLC檢測,并計算桔霉素標準曲線線性關系方程。

1.3.3 樣品處理 將谷物粉碎后,充分混勻。稱取1.0g谷物樣品于15mL離心管中,加入4.0mL 60%乙醇,震蕩混勻后,于30℃超聲提取30min,8000r/min離心10min。重復提取一次,合并上清液并用60%乙醇定容至10mL。

向上述提取液中加入100.0mg C18固相分散萃取凈化劑,震蕩混勻,8000r/min離心10min,取上清液至旋轉蒸發(fā)儀中,在(39±2)℃的水浴上旋轉蒸發(fā),旋干后,用2.0mL甲醇復溶。經0.45um有機濾膜過濾后,供HPLC分析[9]。

1.3.4 超聲提取條件的選擇 提取溫度:取1.0g小麥樣品,加入5.0mL 60%乙醇,分別于20、30、40、50℃超聲提取20min,進行樣品處理,通過HPLC測定,選擇最佳提取溫度。

提取時間:取1.0g小麥樣品,加入5.0mL 60%乙醇,于30℃超聲提取20、25、30、35、40min,進行樣品處理,通過HPLC測定,選擇最佳提取時間。

固液比:取1.0g同一小麥樣品4份,分別按提取劑與樣品的固液比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)加入60%乙醇,于30℃超聲提取30min,進行樣品處理,通過HPLC測定,選擇最佳固液比。

1.3.5 提取劑濃度的選擇 分別用濃度為50%、60%、70%和80%的乙醇溶液作為提取劑,對添加了1.0mL 10.0mg/L的桔霉素標準液的小麥樣品按1.3.3進行處理,HPLC測定,根據桔霉素的回收率選擇最佳提取劑濃度。

1.3.6 分散吸附劑的選擇 分別用C8吸附劑、C18吸附劑、PSA(乙二胺-N-丙基)吸附劑和石墨化碳作為分散吸附劑,在添加了1.0mL 10.0mg/L桔霉素標準液的小麥樣品中加入60%的乙醇溶液,按1.3.3進行樣品處理,通過HPLC測定,確定最佳的分散吸附劑。

1.3.7 方法的重復性實驗 稱取1.0g小麥樣品,添加1.0mL 10.0mg/L桔霉素標準液,按1.3.3進行樣品處理,通過HPLC分析。連續(xù)五天平行測定同一種谷物樣品,計算其精密度。

1.3.8 方法的回收率實驗 在1.0g小麥樣品中添加1.0mL 10.0mg/L桔霉素標準液,依法進行HPLC分析,計算其加標回收率。

1.3.9 結果計算公式c1=c×V/m

式中:c1為樣品中桔霉素含量,單位為微克每克(μg/g);c為儀器檢測的質量濃度,單位為毫克每升(mg/L);V為最終定容體積,單位為毫升(mL);m為樣品質量,單位為克(g)。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的選擇

2.1.1 超聲提取條件的選擇 結果如圖1,表明固液比為1∶4,在30℃時超聲處理30min,樣品的提取效果比較好。

圖1 超聲提取條件優(yōu)化Fig.1 Optimization of ultrasound extraction

2.1.2 提取劑濃度的選擇 根據文獻[12]報道,桔霉素易溶于甲醇、乙醇,但甲醇具有低毒性,因此本文采用乙醇作為提取劑。結果如圖2?？梢婋S著乙醇濃度的升高,桔霉素的回收率增加,至60%乙醇時達到最高,此后逐步下降,故選用60%乙醇作為提取劑。

圖2 提取劑對回收率的影響Fig.2 Effect of different extraction agents on recovery

2.1.3 分散吸附劑的選擇 結果如圖3,可見用石墨化碳吸附劑和C8吸附劑作為分散吸附劑時,桔霉素的回收率較低,且PSA對樣品中的雜質等干擾物吸附去除量不大,而使用C18吸附劑時,桔霉素的回收率能達到87.88%,同時,考慮高效液相色譜所用色譜柱是反相C18柱,在前處理過程中使用C18吸附劑,有助于去除對色譜柱性能及分離分析有影響的雜質,故本文選用C18作為分散吸附劑。

圖3 分散吸附劑對回收率的影響Fig.3 Effect of different Scattered adsorbent on recovery

2.2 桔霉素標準曲線的繪制

以峰面積為橫坐標,桔霉素濃度為縱坐標繪制標準曲線,經計算其回歸方程為:Y=3.13×10-7X-5.59×10-2,R2=0.9999,表明在0.05～5mg/L的范圍內,峰面積與桔霉素質量濃度之間線性關系良好,根據信噪比S/N=3得出最低檢出限為0.005mg/L。

圖4為濃度為1.0mg/L的桔霉素標準液的色譜圖,桔霉素的保留時間為7.163min,理論塔板數為3362,較大,表明柱效較好。

圖4 1.0mg/L桔霉素標準溶液色譜圖Fig.4 The chromatogram of standard citrinin(1.0mg/L)

2.3 方法的重復性實驗

對小麥樣品,在同樣實驗條件下從前處理步驟開始每天測定1次,連續(xù)5d,測定結果見表1。由表1可知,該方法具有良好的重復性和精密度。

2.4 方法的回收率實驗

回收率結果見表2。數據顯示,實驗獲得的回收率范圍為87.7%～96.4%,平均回收率為92.48%,RSD為3.68%,方法的準確度較高。

表1 方法重復性實驗結果Table 1 Result to method repeated experiments

表2 桔霉素加標回收率測定結果Table 2 Recovery rates of citrinin

2.5 谷物樣品測定

分別對大米、小麥、大麥等三種谷物樣品進行了測定,結果見表3。由表3可知,在大米、小麥、大麥等三種谷物中均存在桔霉素,且大麥中桔霉素的含量較高,相對標準偏差在3.77%～4.43%之間。圖5是大米樣品的色譜圖,可見檢測時間在10min之內,較為快捷。

表3 樣品桔霉素含量測定結果Table 3 The contain of citrinin in grain

圖5 大米樣品色譜圖Fig.5 The chromatogram of rice

3 結論

本文建立的分散固相萃取高效液相色譜法測定谷物中的桔霉素,樣品前處理操作快速簡便,方法重現性較好。加標回收率在87.7%～96.4%之間,重復性實驗RSD為4.51%,最低檢出限為0.005mg/L,實際樣品檢測中大米含桔霉素為0.116～0.125μg/g,小麥為0.151～0.165μg/g,大麥為0.357～0.385μg/g,檢測效果較為滿意,適用于谷物中桔霉素的快速檢測。

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Determination of citrinin in grain bydispersive solid-phase extraction and HPLC

HUANG Xiao-dong1,LU Jian2,XIE Fei-fei2

(1.Anhui Public Service for Biological Products and Food Inspection withStandardization Technology Platform,Wuhu 241000，China;2.College of Biochemistry Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

Objective:To establish a method to determine the content of citrinin in grain. Method:The samples were extracted with 60% ethanol,and cleaned up by dispersive solid-phase extraction with C18dispersant sorbent and ready for HPLC determination. Results:A standard curve equation was built as follows:Y=3.13×10-7X-5.59×10-2with linear correlation coefficient of 0.9999 and RSD was 4.51%. The average recovery range was 87.7%～96.4%.The citrinin content range of the samples was 0.116～0.385μg/g.Conclusion:This method was sample and accurate,which could be used for detecting citrinin in grain.

dispersive SPE;citrinin;grain;HPLC

2014-05-04

黃曉東(1963-)，男，碩士，副教授，研究方向：生物制品與食品檢驗。

TS207.3

B

1002-0306(2015)05-0263-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.05.047