以硼和苯基共摻雜的石墨相氮化碳納米片為模擬酶的過氧化氫熒光傳感器

鐘堅(jiān)海，陳 靖，黃建立，陳 宜，張艷燕，溫建榮，蘇雪香，郭良洽*

(1.龍巖出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，福建 龍巖 364000；2.福州大學(xué) 食品安全與生物分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350116；3.福建省糧油質(zhì)量監(jiān)測所，福建 福州 350012)

過氧化氫，俗稱雙氧水，可用作食品加工助劑，具有消毒、殺菌、漂白等功能。由于雙氧水對人的皮膚、眼睛和黏液膜有刺激作用，其蒸氣進(jìn)入人體呼吸系統(tǒng)后，可對肺部產(chǎn)生刺激作用，甚至嚴(yán)重?fù)p傷器官。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)也將其列為3類致癌物，過量使用或?yàn)E用雙氧水可能對人體造成嚴(yán)重影響，因此我國對其使用有嚴(yán)格的規(guī)定。食品中過氧化氫的測定方法主要有滴定法[1]、分光光度法[2]、色譜法[3]、化學(xué)發(fā)光法[4]、電化學(xué)法[5]等，上述方法大多存在操作復(fù)雜、受干擾因素影響大、檢出限高等問題，難以滿足檢測需求，因此丞需設(shè)計(jì)和開發(fā)新型的過氧化氫檢測方法。

模擬酶是人工方法合成的具有酶催化性質(zhì)的一類催化劑，相對于生物酶，模擬酶具有成本低、性能穩(wěn)定、不易失活或被蛋白質(zhì)酶分解等優(yōu)勢，受到了人們的極大關(guān)注。自2007年首次發(fā)現(xiàn)四氧化三鐵磁性納米顆粒[6]具有過氧化物酶的催化活性以來，其他納米材料包括金屬硫化物[7]、金屬氧化物[8-9]、金屬納米材料[10]、碳納米材料[11-12]等也被報(bào)道具有過氧化物酶活性。其活性與樣品中存在的痕量金屬催化劑無關(guān)，而是由材料自身的固有性質(zhì)決定[13]。納米材料的成本低、穩(wěn)定性高以及催化性能可調(diào)，使得這些納米材料組成的過氧化物模擬酶廣泛應(yīng)用于生物和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域[14]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)石墨相氮化碳(g-C3N4)可催化過氧化氫分解產(chǎn)生羥基自由基，進(jìn)而通過羥基自由基與過氧化物酶底物如3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、鄰苯二胺(OPD)的顏色反應(yīng)設(shè)計(jì)出H2O2、葡萄糖、尿酸等的傳感器[15-17]。為了進(jìn)一步提高g-C3N4的催化性能，通常可以采取摻雜的方式來調(diào)節(jié)電子帶隙，或者通過與其他納米材料雜化構(gòu)建納米復(fù)合物的策略來實(shí)現(xiàn)[18-20]。然而，通過g-C3N4與非金屬元素的摻雜來實(shí)現(xiàn)過氧化物模擬酶活性的研究鮮有報(bào)道，本研究采用“結(jié)構(gòu)摻雜”的方法制備得到硼和苯基共摻雜的石墨相氮化碳納米片，并利用其催化過氧化氫氧化熒光底物Amplex Ultrared試劑(AUR)生成高熒光物質(zhì)試鹵靈的反應(yīng)，設(shè)計(jì)了一種新型過氧化氫熒光傳感器。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Tecnai G2F20型透射電子顯微鏡(TEM，美國FEI公司)，Rigaku Ultima IV型X射線衍射儀(XRD，日本理學(xué)公司)，Nano ZS90納米粒度及Zeta電位分析儀(英國馬爾文公司)，Multimode NanoScope IIId型原子力顯微鏡(AFM，美國Bruker公司)，F(xiàn)-4600熒光分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)，ZF-20D 暗箱式紫外分析儀(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

氰胺溶液(50%)、3-氨基苯硼酸、氟化氫銨以及二氧化硅溶膠(12 nm，40%)購自Sigma-Aldrich公司。H2O2、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Amplex Ultrared試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司。所有試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 BP-C3N4材料的制備

硼和苯基共摻雜的石墨相氮化碳納米片(BP-C3N4)材料的合成步驟如下：將0.03 g的 3-氨基苯硼酸溶解在4 g 氰胺液體中，隨后加入8 g 二氧化硅溶膠，將混合物置于60 ℃下攪拌過夜以除去溶劑。在氮?dú)夥諊?，將所得淺黃色粉末以4.5 ℃/min 的速率加熱至600 ℃，并保持4 h，自然冷卻。最后將所得棕紅色粉末用4 mol/L NH4HF2溶液處理24 h 以除去二氧化硅模板。所得混合溶液在1 000 r/min下離心15 min，將沉淀重新分散在水中并透析除去多余的NH4HF2(透析袋截留分子量：3 500 D)。此后，再次離心并將粉末重新分散在50 mL 水中超聲處理24 h后，離心并將沉淀物真空冷凍干燥,得到BP-C3N4材料。

1.3 H2O2熒光檢測

取50 μL 磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 6.0)和50 μL AUR(20 μmol·L-1)，混合均勻后加入100 μL BP-C3N4(0.2 mg·mL-1)和300 μL不同濃度的H2O2溶液，于旋渦混勻器上混勻。將混合溶液置于水浴恒溫振蕩器中于35 ℃ 800 r/min轉(zhuǎn)速下避光振搖30 min后，測定混合溶液的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 BP-C3N4的表征

參照已有文獻(xiàn)方法[19]，以SiO2納米顆粒為模板，通過熱聚合3-氨基苯硼酸和氰胺得到BP-C3N4和SiO2的復(fù)合納米材料，進(jìn)一步經(jīng)NH4HF2處理后，采用超聲剝離的方法得到所需的BP-C3N4材料。透射電鏡(TEM)結(jié)果表明，BP-C3N4呈不規(guī)則的帶狀(圖1A)，寬度約5～50 nm。AFM結(jié)果顯示其厚度約為8～15 nm(圖1B)，平均厚度約12 nm。采用納米粒度及Zeta電位分析儀測得其粒徑約130 nm(圖1C)，pH 7.0時(shí)Zeta電位為-39.3 mV。XRD分析結(jié)果(圖1D)表明，相對于純的g-C3N4，BP-C3N4在27.5°只有一個(gè)較弱的層間(002)衍射峰，且峰形變寬，這是由超聲剝離導(dǎo)致片層厚度變薄引起。此外，硼和苯基的摻雜使其在13.3°處的面內(nèi)(100)衍射峰基本消失[19]。

圖2 不同溶液的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of different solutionsa.AUR+BP-C3N4，b.AUR+H2O2，c.AUR+ BP-C3N4+H2O2

2.2 BP-C3N4的模擬酶活性

采用熒光底物Amplex Ultrared試劑(AUR)作為熒光探針，對BP-C3N4催化H2O2氧化AUR的模擬酶活性進(jìn)行了研究。圖2給出了BP-C3N4、H2O2以及BP-C3N4和H2O2同時(shí)存在時(shí)AUR的熒光光譜圖。只加入BP-C3N4或H2O2時(shí)，AUR的熒光強(qiáng)度無明顯變化(曲線a和b)，此時(shí)紫外燈照射下肉眼觀察不到熒光。然而H2O2和BP-C3N4同時(shí)存在時(shí)，AUR在590 nm處出現(xiàn)強(qiáng)熒光(曲線c)，且紫外燈下可觀察到明顯的橙紅色熒光。上述結(jié)果表明，單獨(dú)的BP-C3N4或H2O2不會氧化AUR，而兩者同時(shí)存在時(shí)，由于BP-C3N4具有過氧化物模擬酶催化活性，可以催化H2O2與AUR反應(yīng)生成高熒光的試鹵靈。其可能的機(jī)理為：AUR通過π-π相互作用吸附到BP-C3N4的表面，其孤對電子先后轉(zhuǎn)移給BP-C3N4和H2O2并產(chǎn)生羥基自由基(·OH)，從而使得AUR更容易被氧化，而硼原子和苯環(huán)的摻雜可以提高電荷分離效率，有利于提升材料的穩(wěn)定性和催化活性[17,19-20]。

2.3 反應(yīng)時(shí)間的影響

實(shí)驗(yàn)研究了不同反應(yīng)時(shí)間下體系熒光強(qiáng)度的變化情況。發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長，體系的熒光強(qiáng)度快速增大，隨后增速變緩，大約在30 min后趨于穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)最終選擇30 min作為傳感體系的反應(yīng)時(shí)間。

2.4 體系pH值的影響

pH值對類過氧化物酶的催化活性有重要影響，分別考察了pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的磷酸鹽緩沖液對體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，隨著溶液pH值的增大，體系的熒光強(qiáng)度一開始隨著pH值的遞增而遞增，在約pH 6.0時(shí)強(qiáng)度最高，隨后開始下降，表明在溶液呈中性偏酸條件下更有利于AUR的氧化[8]，考慮到傳感體系的穩(wěn)定性和BP-C3N4的催化活性，控制反應(yīng)體系的pH值為6.0。

2.5 溫度的影響

考察了不同溫度下體系熒光強(qiáng)度的變化。發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，體系的熒光強(qiáng)度逐漸增大，在35 ℃時(shí)達(dá)到最大值，隨后逐漸減小，這與已報(bào)道的其他納米材料及天然過氧化物酶催化的適宜溫度類似[17,21]。因此最終選擇體系的反應(yīng)溫度為35 ℃。

2.6 H2O2的熒光檢測

基于BP-C3N4內(nèi)在的過氧化物模擬酶催化活性，建立了一種新型的熒光傳感方法?？疾炝薍2O2濃度為0～600 μmol/L時(shí)體系熒光光譜的變化情況，結(jié)果顯示，體系的熒光強(qiáng)度隨著H2O2濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，在100 μmol/L以后趨于穩(wěn)定。過氧化氫濃度(x)在0～100 μmol/L范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度(y)呈線性關(guān)系，線性方程為y=8.801 8x+112.09，r2=0.992 2?；诳瞻讓?shí)驗(yàn)3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的方法計(jì)算得出方法的檢出限為1.1 μmol/L。

2.7 方法的選擇性

2.8 實(shí)際樣品中H2O2含量的檢測

經(jīng)不同濃度過氧化氫溶液浸泡處理過的腐竹樣品晾干后，以水浸泡提取，分別采用本方法和雙氧水檢測試紙法對殘留過氧化氫進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1。從表1數(shù)據(jù)可見，本方法測得的結(jié)果與試紙法的結(jié)果一致，但本方法的靈敏度優(yōu)于試紙法，且通過測定熒光強(qiáng)度可以準(zhǔn)確定量檢測H2O2殘留量。

表1 不同濃度過氧化氫溶液浸泡處理過的腐竹樣品殘留檢測結(jié)果Table 1 The results for the detection of H2O2 residues in the dried bean milk cream in tight rolls samples after soaked in different concentrations of H2O2 solutions (mg/kg)

2.9 與其他方法的比較

將本方法與已報(bào)道的基于g-C3N4模擬酶催化活性的H2O2檢測方法進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。從表2可以看出，與未摻雜的g-C3N4相比，本方法具有線性范圍寬、檢出限較低等優(yōu)點(diǎn)。

表2 與其他過氧化氫檢測方法的對比Table 2 Comparison with other methods for determination of H2O2

(續(xù)表2)

CatalystLinear range(μmol/L)Detection limit(μmol/L)ReferenceCu2+-g-C3N4NPsg-C3N4-Fe3O4MnSe-g-C3N4Se-g-C3N4/BP-C3N40～1 0001～4018～1 80016～4 0000～600400.31.81.61.1[22][23][24][25]This work

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硼和苯基共摻雜的石墨相氮化碳具有過氧化物模擬酶的內(nèi)在催化活性，BP-C3N4可以催化H2O2氧化AUR生成強(qiáng)熒光的試鹵靈，使反應(yīng)體系的熒光增強(qiáng)，基于該原理設(shè)計(jì)了一種新型H2O2傳感器。研究結(jié)果表明，該傳感體系的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)時(shí)間、緩沖液pH值、反應(yīng)溫度有關(guān)，熒光強(qiáng)度與過氧化氫濃度在0～100 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，檢出限為1.1 μmol/L，對實(shí)際樣品的檢測結(jié)果與常用的試紙法一致。與現(xiàn)有方法相比，此法具有容易操作、選擇性好、靈敏度高等特點(diǎn)。此外，傳感體系所產(chǎn)生的熒光在紫外燈的照射下還可通過裸眼直接觀察，有望通過目視比色的方法實(shí)現(xiàn)過氧化氫的現(xiàn)場快速檢測。