QuEChERS/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中四溴雙酚A與六溴環(huán)十二烷

于紫玲，左 優(yōu),2，馬瑞雪，朱曉輝，朱俊彥,2，陳希超，劉立婷,3，向明燈*，于云江*

(1.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所 國(guó)家環(huán)境保護(hù)環(huán)境污染健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510535; 2.長(zhǎng)安大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710064；3.錦州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

四溴雙酚A(Tetrabromobisphenol A，TBBPA)和六溴環(huán)十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCD)作為添加型阻燃劑，廣泛應(yīng)用于電子產(chǎn)品、塑料、紡織品和建筑材料等[1-2]。其中，HBCD主要有α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD 3種同分異構(gòu)體。近年來，TBBPA和HBCD對(duì)人體健康的影響備受關(guān)注。美國(guó)國(guó)家毒理學(xué)計(jì)劃(NTP)的研究顯示，TBBPA暴露能增加雌性大鼠的子宮腫瘤發(fā)生率[3]。此外，國(guó)際癌癥研究中心也將TBBPA提升為2A類致癌物[4]。歐洲化學(xué)品管理署指出HBCD是一類具有持久性、生物累積性和毒性的化合物，并將其列入《斯德哥爾摩公約》禁止在全球范圍內(nèi)使用[5]。目前，各環(huán)境介質(zhì)和生物樣本中均檢出TBBPA和HBCD[6-8]。Schecter等[9]對(duì)美國(guó)市場(chǎng)310份食品中HBCD的調(diào)查顯示，HBCD的含量范圍為23～593 pg/g。Shi等[10]對(duì)中國(guó)16個(gè)省份人體母乳中TBBPA和HBCD的檢測(cè)結(jié)果顯示，其平均含量分別為7.58 ng/g(脂重)和10.1 ng/g(脂重)。歐洲食品安全局(EFSA)呼吁各成員國(guó)提供食品中TBBPA和HBCD的研究數(shù)據(jù)，以評(píng)估兩者的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)[11-12]。但提供的652份樣品中TBBPA的分析結(jié)果大多低于檢出限，且未檢出的樣品類型主要為魚類等水產(chǎn)品(n= 465)[11]。因此，迫切需要建立更為準(zhǔn)確可靠的水產(chǎn)品中TBBPA和HBCD的分析方法。

目前，單獨(dú)對(duì)TBBPA和HBCD的儀器分析技術(shù)已相對(duì)成熟，主要采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定[13-14]，TBBPA和HBCD作為溴代阻燃劑的添加劑，通常同時(shí)存在，且分析檢測(cè)方法相近，因此可將這兩類物質(zhì)進(jìn)行同時(shí)分析[15-16]。通常這兩類物質(zhì)的前處理主要采用索氏提取法、超聲提取法和加速溶劑萃取法等提取后，再經(jīng)層析柱、自動(dòng)凝膠滲透色譜(GPC)等凈化手段，操作過程繁瑣，無法滿足常規(guī)監(jiān)測(cè)的時(shí)效性要求[6-10，17]。施致雄[17]建立了同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中TBBPA和HBCD的超高效液相色譜-質(zhì)譜方法，其中前處理采用傳統(tǒng)的索氏提取法，樣品凈化采用GPC結(jié)合濃硫酸除脂，該方法雖能達(dá)到很高的回收率，但操作復(fù)雜，耗時(shí)(20 h)且所耗溶劑較多(150 mL)。QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)方法是美國(guó)農(nóng)業(yè)部Anastassiades教授等[18]提出的一種新的快速樣品前處理技術(shù)，具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速、高效、成本低等優(yōu)點(diǎn)。但該方法主要針對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的高效分析，應(yīng)用于水產(chǎn)品中TBBPA和HBCD的分析檢測(cè)報(bào)道甚少[19-21]。本文建立了基于QuEChERS提取和凈化為一體的水產(chǎn)品中TBBPA和HBCD的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析方法，通過快速、有效的樣品前處理步驟，保證TBBPA和HBCD的有效提取，為水產(chǎn)品健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了更為簡(jiǎn)便、靈敏和可靠的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 超高效液相色譜(美國(guó)安捷倫科技有限公司)，AB SCIEX4000Qtrap MS三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(SCIEX 公司)；E-916/914加速溶劑萃取儀、R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；N-EVAPTM112氮吹儀(美國(guó)Oranomation Associates);Milli-Q超純水器(美國(guó)Millipore公司)；R-470C冷凍干燥機(jī)(美國(guó)SP Scientific公司)；SX-13-10馬弗爐(滬越科學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器廠)；Model 945617渦旋混合器(美國(guó)Talboys公司)；高速離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)。

甲醇(色譜純，德國(guó)Merck公司)；丙酮、二氯甲烷、正己烷、乙腈(色譜純，德國(guó)CNW科技公司)；N-丙基乙二胺(PSA)、C18(天津博納艾爾杰公司)；無水硫酸鈉(廣州市化學(xué)試劑廠)。

TBBPA、α-HBCD、β-HBCD、γ-HBCD、13C-TBBPA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories)，D18-α-HBCD、D18-β-HBCD、D18-γ-HBCD內(nèi)標(biāo)(美國(guó)AccuStandard公司)。

1.2 儀器條件

1.2.1液相色譜條件CORTECS?C18色譜柱(4.6 mm×100 mm×2.7 μm，美國(guó)Waters公司)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為超純水。梯度洗脫程序?yàn)椋?～4.5 min，90% A;4.5～5.5 min，90%～100% A;5.5～6.5 min，100% A；6.5～10 min，100%～90% A。流速為0.7 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為40 ℃。

1.2.2質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源(ESI)，在負(fù)離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式分析。電噴霧電壓為-4 500 V；入口電壓為-10 V；碰撞室出口電壓為-15 V；TBBPA和HBCD各單體的母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量見表1。

表1 TBBPA和HBCD優(yōu)化的質(zhì)譜條件Table 1 MS parameters for the analysis of TBBPA and HBCD

* quantitative ion

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1 g(精確至0.001 g)樣品至15 mL離心管中，加入20 μL 2.5 mg/L13C-TBBPA 和D18-HBCD混合內(nèi)標(biāo)，加入2 mL飽和氯化鈉和4 mL乙腈，渦旋振蕩10 min，7 500 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液至15 mL離心管中。重復(fù)萃取2次，氮吹定容至1 mL后轉(zhuǎn)移溶液至2 mL裝有50 mg無水硫酸鎂和50 mg C18的離心管中，渦旋振蕩10 min，10 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm親水聚四氟乙烯(PTFE)濾膜，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜與液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化采用針泵進(jìn)樣的方式，將500 μg/L 的TBBPA和HBCD各單標(biāo)溶液以20 μL/min的流速連續(xù)注入ESI源中，在負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式下分別進(jìn)行Q1和Q3掃描確定母離子和子離子對(duì)，然后優(yōu)化各化合物的去簇電壓和碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。TBBPA和HBCD的最佳質(zhì)譜條件如“1.2.2”所示。

圖1 TBBPA和HBCD單體的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms(TIC) of TBBPA and HBCD isomers

2.1.2液相色譜條件的優(yōu)化采用CORTECS?C18(4.6 mm×100 mm×2.7 μm)為分離色譜柱，比較了乙腈-水和甲醇-水溶液作為流動(dòng)相的分離效果。結(jié)果表明，此2種流動(dòng)相均能達(dá)到良好的分離效果，但乙腈-水作流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)峰的響應(yīng)值較低，因此本研究選用甲醇-水為流動(dòng)相。10 μg/L 加標(biāo)貝肉組織勻漿樣品中TBBPA和HBCD各單體的總離子流圖見圖 1。

圖2 不同萃取次數(shù)對(duì)TBBPA和HBCD提取效果的影響Fig.2 Effects of extraction time on extraction efficiencies of TBBPA and HBCD isomers compare with one time(a),two times(b) and three times(c) extraction,p<0.05

圖3 不同C18用量對(duì)TBBPA和HBCD回收率的影響Fig.3 Effects of C18 content on recoveries of TBBPA and HBCD isomers compare with C18 of 25 mg(a),50 mg(b) and 100 mg(c),p<0.05

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1萃取次數(shù)的影響以1 μg/L HBCD和0.5 μg/L TBBPA暴露7 d后的河蚌組織勻漿樣品為研究對(duì)象，選用QuEChERS樣品提取方法，比較了不同萃取次數(shù)對(duì)TBBPA和HBCD各單體的提取效率(圖2)。結(jié)果表明，樣品萃取1、2和3次時(shí)，TBBPA的含量分別為1 984±119、2 833±291和3 097±259 ng/g(干重)，其中萃取2次和3次提取出的TBBPA含量顯著高于萃取1次(p<0.05)，而萃取2次和3次提取的含量不存在顯著差異(p>0.05)。萃取次數(shù)對(duì)HBCD各單體提取效率的影響與TBBPA類似。因此，為減少溶劑消耗以及提高處理效率，本研究選擇萃取次數(shù)為2次。

2.2.2與加速溶劑萃取方法的比較對(duì)比了QuEChERS法和加速溶劑萃取法(ASE)對(duì)樣品中TBBPA和HBCD的提取效率。ASE法參照文獻(xiàn)[22]：以正己烷-二氯甲烷(體積比1 ∶ 9)為提取溶劑，萃取溫度為90 ℃，靜態(tài)提取時(shí)間為4 min，循環(huán)3次。結(jié)果表明，ASE法提取的TBBPA含量(2 919±146 ng/g)略高于QuEChERS法(2 833±291 ng/g)，但差異不顯著(p>0.05)；ASE法提取的HBCD各單體含量略高于QuEChERS法，也不存在顯著差異(p>0.05)。因此，QuEChERS方法用于提取水產(chǎn)品中TBBPA和HBCD基本能滿足分析需要。

2.3 凈化方法的優(yōu)化

2.3.1吸附填料的選擇QuEChERS法的常用凈化劑為C18、PSA及石墨化炭黑(GCB)等吸附填料[23-24]。C18主要去除脂肪等弱極性的干擾物；PSA主要去除極性物質(zhì)、有機(jī)酸、碳水化合物及少量色素；GCB主要去除色素成分，但同時(shí)也對(duì)苯環(huán)官能團(tuán)具有較強(qiáng)的吸附能力。因此本研究比較了PSA、C18以及PSA+C18組合對(duì)TBBPA和HBCD凈化回收率的影響。結(jié)果表明，PSA和PSA+C18均能完全吸附TBBPA，C18對(duì)TBBPA的回收率則為(86.6±7.2)%。對(duì)于HBCD，使用PSA時(shí)，α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD的回收率分別為(84.9±2.8)%、(79.0±2.8)%和(78.4±0.83)%；使用PSA+C18時(shí)，各單體的回收率分別為(88.3±4.9)%、(79.8±2.6)%和(84.1±2.8)%；而使用C18時(shí)，各單體的回收率可達(dá)到80%～100%。綜上，C18凈化對(duì)TBBPA、α-HBCD、γ-HBCD的回收率顯著高于PSA(p<0.5)，而PSA對(duì)β-HBCD的回收率無顯著影響。因此,本研究選用C18作為凈化劑。

2.3.2C18用量的選擇考察了C18用量(25、50、100 mg)對(duì)TBBPA和HBCD凈化回收率的影響(圖3)。結(jié)果顯示，25、50、100 mg C18對(duì)TBBPA和HBCD各單體凈化的回收率均可達(dá)到81%～116%；其中50 mg 和100 mg的C18對(duì)β-HBCD凈化的回收率顯著高于25 mg C18(p<0.05);而C18不同用量對(duì)TBBPA、α-HBCD和γ-HBCD的凈化回收率則無顯著差異(p>0.05)；進(jìn)一步增加C18用量對(duì)凈化效果并無明顯改善，因此本研究選用50 mg C18進(jìn)行凈化。

2.3.3與GPC凈化方法的比較對(duì)比了QuEChERS法和GPC法對(duì)樣品中TBBPA和HBCD的凈化效果。GPC法參照文獻(xiàn)[25-27]方法并做了優(yōu)化：先將GPC柱中溶劑放出至填料露出液面，上樣后用70mL正己烷-二氯甲烷(1 ∶ 1)淋洗，最后用50 mL正己烷-二氯甲烷(1 ∶ 1)洗脫。結(jié)果表明，采用QuEChERS法對(duì)TBBPA的回收率為(118±7.5)%，GPC法的回收率為(110±11.2)%；對(duì)于HBCD各單體，QuEChERS法的回收率為(102±1.6)%～(120±2.3)%，GPC法則為(113±10.6)%～(123±12.5)%。兩種方法無顯著差異(p>0.05)，但由于GPC法涉及樣品轉(zhuǎn)移、旋蒸濃縮、氮吹濃縮等步驟，過程相對(duì)繁瑣，因此本研究選擇QuEChERS方法凈化。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect，ME)可通過ME=(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液所作曲線的斜率/無基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液所作曲線的斜率-1)×100% 進(jìn)行評(píng)價(jià)，ME為負(fù)值表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，正值表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，其絕對(duì)值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)[20-21，24,28]。當(dāng)|ME|<20% 時(shí)，為弱基質(zhì)效應(yīng)，可忽略；20%≤|ME|≤50% 時(shí)，為中等程度基質(zhì)效應(yīng)；|ME|>50% 時(shí)，為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，需對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行補(bǔ)償[29]。本研究采用空白魚肉樣品制備的萃取液和乙腈溶劑分別配制待測(cè)物的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和無基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線，質(zhì)量濃度分別為0.5、1、5、25、50、100、200、300、500 μg/L，用于評(píng)價(jià)本方法的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，TBBPA、α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD的ME分別為-0.30%、-34.5%、-2.17%和-7.37%，表現(xiàn)為弱到中等的基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，用空白魚肉樣品提取液配成0.5、1、5、25、50、100、200、300、500 μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用本方法進(jìn)行分析，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(X，μg /L)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(Y)為縱坐標(biāo)繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，TBBPA和HBCD各單體在0.5～500 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r>0.998)。分別以目標(biāo)物母離子的3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)確定方法檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得到TBBPA、α-HBCD、β-HBCD和γ-HBCD的LOD分別為0.08、0.07、0.04、0.16 μg/kg；LOQ分別為0.25、0.25、0.12、0.55 μg/kg。

2.6 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

選用魚、蝦和貝肉3種空白樣品，對(duì)TBBPA和HBCD進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)水平為5、20、50 μg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)測(cè)定6次，采用內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明，TBBPA和HBCD的回收率為74.0%～121%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為 0.20%～23%(表2)。

表2 TBBPA和HBCD的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Average recoveries and relative standard deviations of TBBPA and HBCD(n=6)

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用該方法對(duì)清遠(yuǎn)采集的鯉魚、日本沼蝦和田螺3種淡水生物體中TBBPA和HBCD含量進(jìn)行分析(表3)。結(jié)果表明，上述樣品中TBBPA的含量為26.0～370 ng/g(干重，下同)，α-、β-和γ-HBCD的含量分別為8.64～38.3 ng/g、2.01～22.9 ng/g和3.70～16.2 ng/g。

表3 實(shí)際樣品中TBBPA和HBCD的分析結(jié)果(ng/g，干重)Table 3 Contents of TBBPA and HBCD in real samples(ng/g dry weight)

3 結(jié) 論

本文建立了快速分析水產(chǎn)品中TBBPA和HBCD含量的QuEChERS/UPLC-MS/MS方法，檢出限為 0.04～0.16 μg/kg，定量下限為0.12～0.55 μg/kg，實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率為74.0%～121%，RSD為 0.20%～23%。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，可滿足批量水產(chǎn)品中TBBPA和HBCD的定量分析需求。