大豆分離蛋白與pH值的構效關系研究

劉 靜，李淑秋，黃勁松，郭 軍

（1.宿州市食品藥品檢驗檢測中心，安徽宿州234000；2.池州學院材料與環(huán)境工程學院，安徽池州247000）

大豆分離蛋白(soybean protein isolate,SPI)是一種植物性蛋白[1]。主要成分為大豆伴球蛋白、大豆球蛋白。大豆蛋白在結構上同牛奶蛋白有著相似氨基酸組成，除蛋氨酸與甲硫氨酸的組成含量較低外，賴氨酸、亮氨酸、蘇氨酸等人體必需氨基酸含量都比較豐富，且不含膽固醇，對心腦血管疾病患者具有一定的食療功效，是一種適合各個年齡段人食用的健康食品[2-3]。在營養(yǎng)價值上，由于SPI與動物蛋白氨基酸的構成相近，因此SPI可替代動物蛋白，而且大豆蛋白擁有著動物蛋白無法替代的優(yōu)點，它不僅不含膽固醇，而且其特有的生理活性物質異黃酮還擁有著降低膽固醇的作用，所以SPI也被稱之為最具營養(yǎng)價值的植物蛋白[4]，因此SPI有著諸如“田中之肉”“綠色的牛乳”等眾多的評價。

SPI是一種擁有復雜四級結構的蛋白質[5-8]。SPI的氨基酸經(jīng)過弱酸弱堿偏移后會攜帶一定的電荷，而攜帶相同電荷的蛋白質之間又會發(fā)生互斥現(xiàn)象，致使SPI亞基的解離以及結構的展開[9]。但是SPI經(jīng)過極端的強酸強堿偏移處理后，可能導致二巰鍵發(fā)生斷裂或與巰基之間發(fā)生交換反應[10]，造成側鏈之間的相互作用減弱，蛋白分子柔性增加,球蛋白的三級結構和二級結構均發(fā)生一定改變,致使其部分性能發(fā)生變化。隨著最近幾年人們對SPI功能和營養(yǎng)作用的深入研究，SPI的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值被逐漸的發(fā)掘出來，SPI在食品加工領域的應用也越來越廣泛，但是同樣的也暴露出其在食品加工過程的缺陷，如其在未變性前具有很高的熱穩(wěn)定性，使其無法在普通的食品加工過程中發(fā)生蛋白結構的變化。但是在食品加工工業(yè)中，熱處理后的SPI會造成蛋白的過度變性和蛋白分子的疏水聚集，使其更易氧化，不易長期保存[11]。本課題的意義就是通過本實驗的結果和數(shù)據(jù)分析，為SPI在食品加工領域的應用提供參考，以彌補SPI在食品加工過程中的缺陷，促進大豆加工產(chǎn)業(yè)更好更快地向前發(fā)展。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

SPI；蒸餾水；磷酸氫二鈉：分析純；氯化鈉：分析純；氫氧化鈉（NaOH）；磷酸二氫鈉（NaH2PO4。2H2O）；鹽酸：分析純.以上試劑均購于國藥集團。

恒溫鼓風干燥箱（DHG-9053B5-Ⅲ）：上海新苗醫(yī)療機械制造有限公司；電子天平（FA2104N）：上海菁華儀器有限公司；傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS-10)：美國；PHS-25型數(shù)顯酸度計：上海天達儀器有限公司；玻璃儀器氣流烘干器：鄭州市上街華科儀器廠；紫外-可見分光光度計（U-3900）：日本日立高新技術公司；熒光分光光度計（RF-5301PC）：島津企業(yè)管理（中國）有限公司/島津（香港）有限公司；78-2型雙向磁力加熱攪拌器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 實驗步驟

1.2.1 SPI的制備 大豆原料使用蘇豆18號(2017年收)，大豆先粉碎，去殼，豆粉用正己烷/乙醇(9.5:1,V/V)真空脫脂，洗滌兩次。脫脂豆粉溶解于水中(料液比1:10,W/W),2mol/L的氫氧化鈉調pH 8.0。溶液攪拌2h以使蛋白充分溶解，在13500g離心力下離心，時間30min,溫度4℃。上清液用2mol/L鹽酸調整到pH 4.5，3300g離心力下離心，時間20min,溫度4℃。沉淀用去離子水洗滌兩次(料液比1:5,W/W)，8000g離心力下離心，時間10min,溫度4℃。去離子水溶解沉淀(料液比1:5,W/W)，2mol/L的氫氧化鈉調pH 7.0，零下20℃真空凍干，凱氏定氮,牛血清蛋白為標品(西格瑪試劑公司，上海)，蛋白質含量95%(W/W),

1.2.2 SPI的偏移處理 用電子分析天平稱取9.10g大豆分離蛋白倒入大燒杯中，用量筒向其中加入300ml的蒸餾水，然后將燒杯放在雙向磁力加熱攪拌器上攪拌20min,測其蛋白含量為28mg/ml，將其稀釋至22mg/ml,然后取上清液5ml分別滴入試管中，然后向不同的試管中滴入不同分量的鹽酸或氫氧化鈉，然后在數(shù)顯酸度計的幫助下調節(jié)試管中溶液的pH值，使其形成一定的pH梯度，然后用2mol/L的氯化鈉溶液將試管中的蛋白濃度稀釋到20mg/ml,留做備用。

1.2.3 色氨酸的熒光分析 將熒光分光光度計（RF-5301PC）預熱30min，設置激發(fā)波長為295nm,狹縫寬設為5nm,掃描速度設置為10nm/s，然后將用0.01mol/L pH=6.2磷酸鹽緩沖液將上面制得的20mg/ml大豆蛋白溶液稀釋到1mg/ml，然后將其放置在機器中進行測量，以pH=6.2，0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液為空白對照，可以得到300-580nm的發(fā)射光譜。

1.2.4 紫外吸收光譜分析 將紫外-可見分光光度計（U-3900）打開后預熱30min，然后設置掃描速度為10nm/s，間隔時間為0.25s，寬度設置為1.0nm，最小間隔度為0.2nm，然后將用0.01mol/L pH=6.2磷酸鹽緩沖液將上面制得的20mg/ml稀釋到1mg/ml的SPI溶液放置在機器中測量，以pH=6.2,0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液為空白對照可以得到190-500nm之間的紫外吸收光譜圖。

1.2.5 紅外實驗 將pH偏移處理后的SPI烘干，取1mg SPI粉末放入研缽中，然后按樣品與溴化鉀粉末為1:100的比例取出一定質量的溴化鉀粉末放入研缽中，將二者混合均勻后在干燥燈的照射下研磨，然后放在液壓機中壓片壓制成半透明的薄片，將薄片放置在機器中在32cm-1分辨率下掃描，然后將數(shù)據(jù)導入Origin 6.0軟件中得到400-4000cm-1波數(shù)范圍之間的掃描紅外光譜。

2 結果與分析

2.1 大豆蛋白的熒光表征分析

表1 pH偏移處理對SPI內源熒光指數(shù)的影響

SPI經(jīng)過極端pH溶液處理后，SPI的熒光強度和波長變化如表1所示。從中可以看出SPI的熒光強度增強。以295nm的激發(fā)波長激發(fā)SPI色氨酸殘基[12]，通過表1可以看到SPI經(jīng)過酸堿處理前后，熒光強度和對應的最大吸收波長的變化。SPI在經(jīng)過不同酸性處理，不同的反應時間后，其熒光強度先增大然后減小（由410nm增加到543nm再減小到268nm），其最大吸收波長也發(fā)生了很大改變（由處理前的最大吸收波長350nm變?yōu)?56nm），同時也出現(xiàn)了最小吸收波長為268nm；SPI在經(jīng)過不同堿性處理后，經(jīng)過不同的反應時間后，其熒光強度不斷增大（由410nm增加到522nm），其最大吸收波長也發(fā)生了很小的波動（由處理前的最大吸收波長350nm變?yōu)?52nm，同時也出現(xiàn)了最小吸收波長為347nm），這種改變因為SPI在堿性環(huán)境中其寡聚體結構或亞基發(fā)生解聚導致的。這些改變的發(fā)生是由于包裹在SPI內部的一些疏水側鏈，經(jīng)過酸堿處理后，疏水環(huán)境從非極性轉變成極性，SPI的三級結構也發(fā)生改變，這種改變是一種動態(tài)的改變。

2.2 SPI的紅外表征分析

圖1 不同pH值SPI紅外光譜圖

上圖1為不同pH偏移處理后得到的SPI紅外光譜圖，從圖中我們通過與自然狀態(tài)下的SPI紅外光譜圖進行對比發(fā)現(xiàn)，在極端酸性條件下處理的SPI的紅外特征吸收峰的變化主要體現(xiàn)為兩點：一種1579cm-1處的N-H面內彎曲振動（酰胺Ⅱ譜帶）；另一種是1116 cm-1處的C-N伸縮（酰胺Ⅲ譜帶振動）。這兩處的透光率與未處理的SPI相比明顯減弱，這種現(xiàn)象的發(fā)生是由于SPI在強酸性條件下，其空間結構發(fā)生變化，部分肽鍵發(fā)生水解，使更多的-NH2被暴露出來造成的；而在堿性條件下，SPI的紅外光譜中紅外特征吸收峰的變化，主要體現(xiàn)為1612cm-1處的N-H面內彎曲振動（酰胺Ⅱ譜帶）的透光率減弱，造成這種現(xiàn)象的原因是由于肽鍵和酰胺鍵發(fā)生一定程度的水解，使更多的-NH2被暴露出來并在反應中被消耗，同時伴隨著在水解反應中釋放出來的活性基團參與到分子之間的交聯(lián)反應中造成的[13]。

2.3 SPI的紫外表征分析

從圖2可知，SPI經(jīng)過極端處理后的紫外光譜圖，而且從圖中我們看出在209nm附近有著強烈的吸收峰。首先，通過觀察極端酸性條件的SPI與自然狀態(tài)下的大豆蛋白的紫外光譜圖能夠發(fā)現(xiàn)，SPI在pH=1環(huán)境中隨著處理時間的增加其最大吸收波長明顯減弱(由209nm減小到196nm),其吸光度也明顯減弱(由3.501減小到2.845)，這種現(xiàn)象的發(fā)生是因為在極端酸性條件下SPI的肽鍵發(fā)生水解，SPI的結構發(fā)生變化，導致二硫鍵發(fā)生斷裂或二硫鍵與巰基發(fā)生交換反應造成的。而在強堿性條件下，通過觀察極端堿性條件的SPI與自然狀態(tài)下的SPI的紫外光譜圖能夠發(fā)現(xiàn)，其最大吸收波長與吸光度同自然狀態(tài)下的SPI最大吸收波長和吸光度相比幾乎沒有改變，λmax為209nm，由文獻可知，209nm處的峰代表α-螺旋構象[14]，表明α-螺旋構象有助于穩(wěn)定蛋白結構，使得二級結構大部分保留，蛋白處于熔球態(tài)[15]，也即介穩(wěn)態(tài)。

圖2 不同pH值SPI紫外外光譜圖

3 結論

通過對熒光光譜分析、紫外光譜分析、紅外光譜分析，發(fā)現(xiàn)SPI經(jīng)過極端酸堿處理后，SPI的部分肽鍵和肽鏈發(fā)生分子結構展開，內部巰基生成的速度較快，蛋白亞基發(fā)生解離，聚集造成SPI二級結構和三級結構發(fā)生變化形成熔球態(tài)。