細(xì)菌源追蹤技術(shù)在楊家河水域枯水期的應(yīng)用

李正潔，程漢超

（山東省環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究設(shè)計(jì)院有限公司，濟(jì)南250012）

1 引言

本研究選取南四湖流域光府河支流楊家河段為研究對(duì)象。對(duì)研究對(duì)象枯水期進(jìn)行取樣和分析，研究水體中大腸桿菌種類與周邊污染物的關(guān)系。

2 樣品采集

已知源樣的采集：采樣選擇在光府河支流楊家河周邊的王橋村、孫橋村和南營村，在村內(nèi)采樣優(yōu)先采取污染貢獻(xiàn)率比較大的采樣點(diǎn)，如養(yǎng)鴨場(chǎng)和養(yǎng)豬場(chǎng)，然后依次安排，村內(nèi)采樣具體地點(diǎn)選擇隨機(jī)分散。

水樣的采集：在楊家河王橋段和楊家河橋段沿河流走向采集水樣，采集水樣20份。

3 實(shí)驗(yàn)部分

3.1 人和動(dòng)物糞便樣本中大腸桿菌的分離

糞便樣本直接劃線接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板36℃培養(yǎng)24h，每個(gè)樣本挑取3個(gè)深紫黑色、具有金屬光澤，且革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌的菌落，轉(zhuǎn)種于TSA上36℃培養(yǎng)24h，然后使用Vitek 2 Compact鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，凡鑒定為大腸桿菌陽性者，保存于磁珠凍存管中（-80℃）。

3.2 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFG E）分型試驗(yàn)

從檢測(cè)培養(yǎng)基上挑取單菌落，接種于TSA平板上培養(yǎng)，37℃孵育箱培養(yǎng)14h；用同一個(gè)接種針/環(huán)，穿刺或接種于小螺帽管中的TSA培養(yǎng)基，以保證必要時(shí)重復(fù)檢測(cè)同一個(gè)克隆。同時(shí)接種標(biāo)準(zhǔn)株H9812，依次進(jìn)行細(xì)菌包埋、細(xì)菌裂解、清洗膠塊、膠塊內(nèi)DNA的酶切、加樣、電泳、圖像獲取、圖像分析。

3.3 水中總大腸菌群的測(cè)定和大腸桿菌的分離

取10mL水樣接種到10mL雙料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，然后取1mL水樣接種到10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，另取1mL水樣注入9mL生理鹽水中，混勻后吸取1mL（即0.1 mL水樣）注入10mL單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，每一稀釋度5管。

將接種管置36℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，如計(jì)數(shù)產(chǎn)酸產(chǎn)氣管數(shù)，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣管分別接種到2個(gè)伊紅美藍(lán)瓊脂平板上36℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)，挑取符合深紫黑色、具有金屬光澤的菌落，紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落或淡紫紅色、中心較深的菌落作革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)，若革蘭氏染色陰性無芽胞桿菌的則進(jìn)一步接種單料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液36℃培養(yǎng)24h，復(fù)發(fā)酵。以上試驗(yàn)全部陽性者記錄為陽性管數(shù)，查MPN（最大可能數(shù)）檢索表，記錄100mL水樣中的總大腸菌群MPN值。

挑取上文所述伊紅美藍(lán)瓊脂平板生長的深紫黑色、具有金屬光澤，且革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌的菌落，轉(zhuǎn)種于TSA上36℃培養(yǎng)24h，每份水樣隨機(jī)挑取2支陽性發(fā)酵管對(duì)應(yīng)平板，挑取3個(gè)菌落，使用Vitek 2 Compact鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，凡鑒定為大腸桿菌陽性者保存于磁珠凍存管中（-80℃）。

3.4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFG E）分型試驗(yàn)

水中大腸桿菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型試驗(yàn)與人及動(dòng)物糞便樣本中大腸桿菌的分型試驗(yàn)操作程序相同。

4 結(jié)果和討論

4.1 樣本采集結(jié)果

枯水期采集水樣20份，采集人及動(dòng)物糞便樣本24份，具體采樣情況如表1所示。

表1 樣本采集情況

4.2 水中總大腸菌群的測(cè)定結(jié)果

枯水期水樣中檢測(cè)到總大腸菌群的存在，具體結(jié)果如表2所示，表明該流域水樣均受到了人或動(dòng)物糞便的污染。

4.3 枯水期PFG E分型結(jié)果

通過對(duì)枯水期水樣的分型結(jié)果進(jìn)行分析可知，枯水期楊家河水體的污染源為鴨源53.3%，豬源30.0%，人源1.7%，未知源的為15%。

表2 水體總大腸菌群測(cè)定結(jié)果

4.4 討論

本次試驗(yàn)人和動(dòng)物糞便選取楊家河周邊的王橋村、孫橋村和南營村，采集鴨糞便10份、豬糞便10份、人糞便4份。水樣采取選取洸府河支流楊家河王橋段和楊家河橋段，采集水樣20份。

通過PFGE分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

1）枯水期水樣中檢測(cè)到總大腸菌群的存在，每100ml水樣中總大腸菌群MPN值為在79～920，表明該流域水樣均受到了人或動(dòng)物糞便的污染?？菟?0個(gè)水樣中，僅3個(gè)水樣中總大腸菌群數(shù)滿足GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》II類標(biāo)準(zhǔn)（≤2000個(gè)/L）要求。14個(gè)水樣中的總大腸菌群超過了GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》II類標(biāo)準(zhǔn)（≤2000個(gè)/L）要求，但滿足III類標(biāo)準(zhǔn)要求，有4個(gè)水樣中總大腸菌群數(shù)達(dá)到9200個(gè)/L，接近于10000個(gè)/L標(biāo)準(zhǔn)。有3個(gè)水樣中總大腸菌群數(shù)量高達(dá)1.6×104個(gè)/L，僅滿足GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》IV類標(biāo)準(zhǔn)（≤2000個(gè)/L）要求。

2）枯水期的楊家河水體的污染源為鴨源53.3%，豬源30.0%，人源1.7%，未知源的為15%。

現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，楊家河段河流兩側(cè)有數(shù)家養(yǎng)豬場(chǎng)、養(yǎng)鴨場(chǎng)，養(yǎng)殖場(chǎng)存在糞便隨意堆放、污水直接排放的現(xiàn)象，沒有經(jīng)過統(tǒng)一收集和集中處理，尤其有2家養(yǎng)鴨場(chǎng)，距楊家河較近，糞便極易通過雨水進(jìn)入水體，污染環(huán)境，與PFGE分型結(jié)果中鴨源占比較高一致。

5 結(jié)論

利用細(xì)菌源追蹤技術(shù)對(duì)南四湖水域洸府河支流楊家河段水體細(xì)菌源進(jìn)行鑒別、評(píng)估，將非點(diǎn)源污染控制轉(zhuǎn)化為點(diǎn)源污染控制，為山東省水資源保護(hù)、監(jiān)督管理提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持，在山東省乃至全國的水資源保護(hù)中都將起到示范作用。