乳粉檢測中亞硝酸鹽提取方法的優(yōu)化

李永娟，黃 珂，張 晶，孫文毅*

（河北省食品安全重點實驗室，國家市場監(jiān)管重點實驗室（特殊食品監(jiān)管技術），特殊食品安全與健康河北省工程研究中心，河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050227）

嬰幼兒食品一直是社會關注的熱點，乳粉作為嬰幼兒的主要食物來源，其安全性備受關注，亞硝酸鹽是該類食品的重要污染物指標之一[1]。較低水平的亞硝酸鹽就會對新生嬰兒產(chǎn)生影響，高水平的亞硝酸鹽則會導致高鐵血紅蛋白癥，嚴重時甚至導致死亡[2-3]。

目前，亞硝酸鹽的檢測方法主要有光譜法、色譜法、電化學分析法等[4-7]，亞硝酸鹽的提取效果直接影響檢測結果。本實驗室常采用GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[8]（以下簡稱國標）中的分光光度法測定乳粉的亞硝酸鹽含量。前期實驗過程中發(fā)現(xiàn)按照國標中的提取方法進行乳粉樣品亞硝酸鹽測定時存在空白實驗吸光度較大、回收率低、精密度差的問題。國標方法中沸水浴加熱過程乳粉會形成黏糊狀，導致亞硝酸鹽提取不充分，從而影響檢測結果平行性。核黃素和胡蘿卜素等會使乳粉呈現(xiàn)淡黃色，導致乳粉經(jīng)提取過濾后濾液略帶黃色，檢測過程中亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后，再與加入的鹽酸萘乙二胺偶合產(chǎn)生紫紅色的染料，推測乳粉樣品濾液的顏色影響了顯色效果，導致回收率較低。為了解決上述問題，本研究主要通過比較不同放置時間的實驗用水對空白實驗的影響以及優(yōu)化提取方法改善國標方法中因加熱產(chǎn)生的提取不充分導致的平行性差的問題，選擇合適的脫色劑吸附乳粉中的色素得到無色透明溶液，探索適用于乳粉中亞硝酸鹽的測定方法，以期為乳粉中亞硝酸鹽的準確測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：超市隨機購買乳粉樣品4 份，分別命名為A、B、C、D；過期乳粉樣品2 份，分別命名為E、F。

亞硝酸鈉（基準試劑）、鹽酸萘乙二胺（分析純）、活性炭（分析純） 天津科密歐化學試劑有限公司；對氨基苯磺酸（分析純） 天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外-可見光雙光分光光度計 日本島津儀器有限公司；AB204電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；KX-1990QT超聲波清洗器 北京科璽時代科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

亞硝酸鈉標準溶液（200 μg/mL，以亞硝酸鈉計）：準確稱取0.100 0 g于115 ℃干燥至恒質(zhì)量的亞硝酸鈉基準試劑，加水溶解，移入500 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。

亞硝酸鈉標準使用液（5.0 μg/mL）：臨用前，吸取2.50 mL亞硝酸鈉標準溶液，置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度。

1.3.2 加熱提取法

稱取試樣10 g（精確至0.001 g），置于150 mL具塞錐形瓶中，加12.5 mL 50 g/L飽和硼砂溶液，加入70 ℃左右的水約150 mL，混勻，于沸水浴中加熱15 min，取出置冷水浴中冷卻，并放置至室溫。定量轉移上述提取液至200 mL容量瓶中，加入5 mL 106 g/L亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，再加入5 mL 220 g/L乙酸鋅溶液，以沉淀蛋白質(zhì)。加水至刻度，搖勻，放置30 min，除去上層脂肪，上清液用濾紙過濾，棄去初濾液30 mL，濾液備用。

1.3.3 超聲提取法

稱取試樣10 g（精確至0.001 g），置于150 mL具塞錐形瓶中，加12.5 mL 50 g/L飽和硼砂溶液，加入70 ℃左右的水約150 mL，混勻。將溶解后的試樣在室溫條件下超聲提取30 min，轉移上述提取液至200 mL容量瓶中。以下操作同加熱提取法。

懸臂式掘進機可視化輔助截割系統(tǒng)總體方案，如圖3所示。包括掘進機工作面建模及軌跡規(guī)劃模塊、傳感器、信息采集處理模塊、數(shù)據(jù)解算模塊、圖像顯示模塊以及存儲模塊。

1.3.4 超聲脫色法

稱取試樣10 g（精確至0.001 g）、活性炭1 g置于150 mL具塞錐形瓶中，加入12.5 mL 50 g/L飽和硼砂溶液，加入70 ℃左右的水約150 mL，混勻。將上述溶液在室溫條件下超聲脫色提取30 min，定量轉移上述提取液至200 mL容量瓶中。以下操作同加熱提取法。

1.3.5 亞硝酸鹽的測定

分別吸取40.0 mL上述濾液于50 mL帶塞比色管中，另吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL亞硝酸鈉標準使用液（相當于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、12.5 μg亞硝酸鈉），分別置于50 mL帶塞比色管中。于標準管及試樣管中分別加入2 mL 4 g/L對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5 min后各加入1 mL 2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min，用1 cm比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點，于538 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線查得相應的質(zhì)量，樣品中亞硝酸鹽的含量按式（1）計算。

式中：X為試樣中亞硝酸鈉的含量/（mg/kg）；m0為測定用樣液中亞硝酸鈉的質(zhì)量/μg；V0為試樣處理液總體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g；V為測定用樣液體積/mL。

1.3.6 空白實驗吸光度的測定

取實驗用水放置0、3、5、7、14 d，分別采用加熱提取法、超聲提取法及超聲脫色法3 種提取方法做空白實驗，測定空白實驗的吸光度大小。

采用超聲脫色法進行20 次空白實驗，方法檢出限按式（2）計算。

式中：CL為方法的檢出限/（mg/kg）；Sb為空白值標準偏差/（mg/kg）；b為標準曲線的斜率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 亞硝酸鹽標準工作曲線

參照國標方法進行標準曲線的繪制，所得標準曲線方程為y=0.014 6x＋0.001 0（R2=0.999 9），符合實驗要求。

2.2 不同放置時間實驗用水對空白實驗吸光度的影響

由圖1可知，放置不同時間的實驗用水及采用不同的提取方法對空白實驗吸光度大小的影響不顯著。吸光度為0.015～0.018時，相當于亞硝酸鈉的含量為0.958～1.164 μg，在測定乳粉樣品時亞硝酸鈉基本未檢出，空白對其影響就比較大[9]。在趙秋伶等[10]的研究中也出現(xiàn)空白實驗吸光度高于樣品的現(xiàn)象，用超純水未能解決。對“千滾水”和“隔夜水”中亞硝酸鹽含量進行測定時發(fā)現(xiàn)，反復煮沸或長時間放置水中的亞硝酸鹽含量會輕微上升[11]。如果放置保存不當，水中的細菌會將硝酸鹽轉化為亞硝酸鹽[12]，當長時間加熱時水分蒸發(fā)，會導致亞硝酸鹽的含量升高。為防止放置過程中引起的水質(zhì)變化，建議使用新鮮實驗用水。

圖1 不同放置時間實驗用水空白實驗吸光度Fig.1 Absorbance of experimental water at different storage times

2.3 不同提取方法濾液顏色的比較

分別采用3 種方法對乳粉中亞硝酸鹽進行提取，觀察其所得濾液顏色。經(jīng)加熱提取或超聲提取后濾液有明顯的黃色，經(jīng)活性炭脫色提取后濾液呈無色狀態(tài)。活性炭屬于非極性吸附劑，表面具有很多微孔，可以吸附樣品中的色素[13]，在測定深色食品中亞硝酸鹽含量時加入活性炭可以有效消除色素的干擾[14]。前2 種方法濾液明顯偏黃，添加活性炭后濾液為無色透明狀，說明活性炭可以有效起到脫除乳粉濾液顏色的效果。

2.4 不同提取方法回收率的比較

對6 種乳粉分別采用3 種方法測定其含量，同時進行加標回收率實驗，加標量為5.00 mg/kg，比較不同提取方法對結果的影響。

由表1可知，按照國標方法（加熱提取法）檢測的加標回收率結果低于其他2 種方法。任雪梅等[15]在對嬰幼兒谷類輔助食品亞硝酸鹽的研究中發(fā)現(xiàn)，按照國標法處理會產(chǎn)生淀粉糊化，導致黏度增大，包裹住亞硝酸鹽而降低提取效果，本研究結果與之一致。同瑞婷等[16]采用室溫超聲法代替國標中加熱煮沸提取，提高了米粉中亞硝酸鹽的檢測效率和準確度。超聲提取法可以提高乳粉中亞硝酸鹽的回收率，尚未達到GB/T 27404—2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[17]中的要求。采用物理超聲方式提取可有效提高回收效果[18-19]，但并未達到完全理想的狀態(tài)，推測可能由于乳粉基質(zhì)較復雜，過濾后濾液偏黃影響了顯色結果，可以通過降低稱樣量[20]、增加沉淀劑用量[21]或者選取合適的脫色劑[22]除去濾液的顏色。

表1 不同提取方法回收率比較Table 1 Comparison of recoveries of different extraction methods

利用分光光度法測定吸光度時，對于有顏色或者渾濁的樣液必須先進行脫色和澄清處理，否則將會影響實驗結果[23]。丁小禮等[24]對深色肉制品中亞硝酸鹽含量進行測定時，提出預處理后有顏色的樣品必須進行脫色處理。國標第三法測定蔬菜中硝酸鹽時，用活性炭作為脫色劑去除色素的干擾。測定調(diào)味醬中亞硝酸鹽時，陳銀珊[25]在國家標準方法的基礎上，加入活性炭消除色素影響后檢測結果更加精確。研究表明，活性炭的用量、脫色溫度、脫色時間[26-28]等都會影響活性炭的吸附效果。本研究中采用室溫超聲提取乳粉中的亞硝酸鹽并經(jīng)1 g活性炭脫色30 min后，回收率較前2 種方法明顯提高，與亢美娟等[29]研究結果一致。同樣，在對醬腌菜中亞硝酸鹽的測定中，活性炭消除了黃色色素的干擾，檢出率提高2 倍左右[30]。

2.5 超聲脫色法準確度的分析

選取乳粉樣品E，采用超聲提取并添加1 g活性炭脫色法測定加標回收率6 次，研究其回收效果及精密度。由表2可知，對乳粉樣品E采用優(yōu)化后的方法處理，不同加標量水平的回收率均在90%以上，符合實驗室質(zhì)量控制要求[16]。

表2 超聲脫色法準確度測定結果Table 2 Accuracy of ultrasonic decolorization method

2.6 乳粉中亞硝酸鹽定量分析質(zhì)控樣品的測定

選取中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心乳粉中亞硝酸鹽定量分析質(zhì)控樣品，采用超聲脫色提取法測定6 次。質(zhì)控樣品的特性值為29.82 mg/kg，特性值區(qū)間為21.30～38.34 mg/kg。由表3可知，按照優(yōu)化后的實驗方法對乳粉質(zhì)控樣品進行測定，結果均在特性值附近，6 組數(shù)據(jù)的相對標準偏差為0.45%，表明該方法適用于乳粉中亞硝酸鹽含量的測定，具有較高的準確性和精確性。

表3 乳粉中亞硝酸鹽定量分析質(zhì)控樣品的測定結果Table 3 Measured results of quality control samples for analysis of nitrite in milk powder

2.7 超聲脫色法的方法檢出限

按照GB/T 27404—2008[17]的要求，測定超聲脫色法的方法檢出限。測定結果如下：20 次空白值的平均值為0.942?mg/kg，20 次空白值的標準偏差Sb=0.001 93?mg/kg，標準曲線斜率b=0.014 6，方法檢出限CL=0.4 mg/kg，小于GB 5009.33—2016分光光度法中的檢出限（0.5 mg/kg）。

3 結 論

針對乳粉中亞硝酸鹽測定時空白實驗吸光度、濾液顏色及回收率等問題，優(yōu)化了一種提高其提取效果的方法。本實驗室貯存條件下，不同存放時間的實驗用水對空白實驗吸光度影響不大。向稱量后的乳粉樣品中加入1 g活性炭，經(jīng)室溫超聲提取30 min即可吸附乳粉中的色素，消除濾液顏色的干擾，使測定結果準確、可靠。本方法采用室溫超聲提取法代替國標方法中沸水浴加熱方法，過程簡單、操作性強?；钚蕴坑糜谌榉蹣悠返拿撋幚硎强尚械?，為乳粉中亞硝酸鹽的測定提供了一種更加準確、可靠的提取方法。國標測定食品中亞硝酸鹽的含量未提及色素的消除，建議國標方法中增加對有色物質(zhì)的脫色處理。