Pb、Cd和酸脅迫下楓香萌發(fā)種子的生理生化變化及其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

陳順鈺，趙雅曼，李宗勛，李啟艷，姜 云，侯曉龍，2，3*，蔡麗平，2，3

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福州 350002；2.海峽兩岸紅壤區(qū)水土保持協(xié)同創(chuàng)新中心，福州 350002；3.南方紅壤區(qū)水土保持國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002）

福建長汀是稀土資源儲量最多和稀土產(chǎn)業(yè)發(fā)展最早的縣，屬典型的離子型稀土礦區(qū)[1]。近年來隨稀土價格攀升，稀土礦開采加劇產(chǎn)生大面積廢棄地，不但使土壤結(jié)構(gòu)遭到破壞，引起植被破壞、水土流失，同時還造成土壤酸化、重金屬污染，成為當(dāng)前亟需解決的重大環(huán)境問題[2-3]。長汀重金屬污染主要為Pb、Cd，在廢棄堆浸池Pb含量達(dá)重度污染水平；在原地浸廢棄地、廢棄堆浸池、取土場的Cd含量分別為福建省土壤背景值的141、69、97倍，綜合潛在生態(tài)風(fēng)險指數(shù)均大于1200，污染程度達(dá)極重水平。長汀稀土礦開采主要是采用加入硫酸銨或草酸等強(qiáng)酸溶液浸提，將吸附在黏土礦物表面的稀土離子交換出來，因此導(dǎo)致長汀廢棄地土壤酸化，礦區(qū)生態(tài)環(huán)境惡化[1，4-6]。土壤酸化和重金屬污染成為限制稀土礦廢棄地的生態(tài)恢復(fù)的限制因子。其中植物修復(fù)技術(shù)具有安全、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注[7]。

大量研究表明，可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內(nèi)兩種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。當(dāng)植物受到外部環(huán)境脅迫時，可溶性糖在植物體內(nèi)迅速積累，以維持植物體與外部環(huán)境的相對滲透平衡?？扇苄缘鞍滓彩侵参镏匾纳砘钚晕镔|(zhì)，其含量變化與外部環(huán)境的變化密切相關(guān)，可溶性蛋白的升高，是植物在逆境下的一種防御機(jī)制[8-9]。如劉玉艷等[10]發(fā)現(xiàn)重金屬Cd、Pb、Ni脅迫降低了地膚（Kochia scoparia）種子可溶性蛋白含量，極顯著提高了可溶性糖含量。在種子萌發(fā)過程中，種子內(nèi)部淀粉酶催化貯藏淀粉水解，為后期植株幼苗的形態(tài)建成及生長發(fā)育提供主要的物質(zhì)和能量來源[10]。近年來，傅里葉紅外光譜分析技術(shù)在環(huán)境生物修復(fù)和重金屬污染對植物營養(yǎng)的影響等方面也有較多應(yīng)用[11]。另一方面，細(xì)胞壁的固定和液泡區(qū)室化在植物應(yīng)對重金屬的毒性方面起著相當(dāng)重要的作用。Weng B S等[12]研究證實(shí)了大部分Cd都儲存在秋茄樹[Kandeliaobovata（S.，L.）]的細(xì)胞壁中，細(xì)胞壁的固定作用是其抗Cd毒性的重要策略之一。

楓香（Liquidambar formosana Hance）系金縷梅科楓香樹屬的高大落葉喬木，分布于我國秦嶺及淮河以南，有“荒山先鋒”樹種之稱，其生長快、用途廣、適應(yīng)性強(qiáng)、生態(tài)效益好，已成為林種、樹種結(jié)構(gòu)調(diào)整的首選樹種，能在長汀稀土礦廢棄地正常生長[13-15]。目前已有學(xué)者就溫度和時間對楓香種子萌發(fā)的影響、楓香種子形狀特征進(jìn)行了研究[16-17]，然而，重金屬及酸脅迫對楓香種子萌發(fā)過程中的生理變化尚未見報道。鑒于此，研究不同Pb、Cd及酸脅迫對楓香種子萌發(fā)過程中可溶性蛋白、可溶性糖、還原糖含量，淀粉酶活性等的影響，通過傅里葉紅外光譜變化及對胚乳的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。探討重金屬Pb、Cd及酸脅迫條件下楓香種子萌發(fā)過程中內(nèi)含物的變化機(jī)制，旨在為該種子在酸性廢棄礦地和重金屬污染地萌發(fā)機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

楓香種子采購自江西省九江縣林木種苗公司，存儲于4℃冰箱。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)稀土礦廢棄地土壤酸化及重金屬污染程度，設(shè) 置 pH 值 及 Pb、Cd 濃 度[1，18-19]，pH 調(diào) 節(jié) 采 用CH3COOH，分別為3.5、4.5、5.5、CK（去離子水對照）。Pb脅迫采用分析純（CH3COO）2Pb配制，濃度為0（去離子水對照）、250、500、1000 mg·L-1（文中以CK、Pb-250、Pb-500、Pb-1000表示）的Pb溶液；Cd脅迫采用分析純（CH3COO）2Cd·3H2O配制，濃度分別為：0（以去離子水對照）、25、50、100 mg·L-1（文中以CK、Cd-25、Cd-50、Cd-100表示）。

1.3 試驗(yàn)條件及過程

用0.3%的KMnO4溶液消毒浸泡30 min后，超純水沖洗5遍，選用籽粒飽滿的楓香種子，用于脅迫試驗(yàn)。將經(jīng)過高溫滅菌處理的直徑為9 cm的玻璃培養(yǎng)皿編號，每個培養(yǎng)皿鋪有兩張濾紙，并分別加入5 mL各濃度的Cd、Pb和酸脅迫溶液，使濾紙濕潤并浸沒了種子體積的1/3，每皿均勻擺放100粒種子，每種處理3個重復(fù)。于溫度25℃、空氣相對濕度70%、14 h/10 h（光照/黑暗）、光強(qiáng)100%的人工氣候箱中培養(yǎng)（RXZ-160A智能型人工氣候箱，寧波江南儀器廠）。每2 d更換一次濾紙，每日稱重法添加少量純水，保持濾紙濕潤。

1.4 測定指標(biāo)與方法

取發(fā)芽第0、4、7 d和10 d的發(fā)芽種子及發(fā)芽結(jié)束后的未萌發(fā)種子，參考王學(xué)奎[20]的方法采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法測定還原糖含量；可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法；可溶性糖測定用蒽酮比色法；α-淀粉酶活性、β-淀粉酶活性測定采用DNS法，淀粉酶的活性以每分鐘每克樣品水解淀粉釋放出的麥芽糖毫克數(shù)表示（mg·g-1·min-1）。取發(fā)芽結(jié)束后未萌發(fā)種子，Pb-1000、Cd-100、CK處理的發(fā)芽種子，參照廖卓毅等[21]的方法對楓香種子胚乳細(xì)胞的結(jié)構(gòu)進(jìn)行透射電鏡觀察（TEM）并拍照（JEM-100CX，上海秉新生物科技有限公司）。放大倍數(shù)為1900、2900、4800倍和6800倍。傅里葉紅外光譜儀（型號：VERTEX 70，德國 Bruker公司，光譜范圍 4000～400 cm-1，分辨率4 cm-1），掃描次數(shù)32次，測定樣品的光譜信息。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0的單因子方差分析（One-way ANOVA）和多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Tukey-HSD法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。FTIR分析[22]根據(jù)楓香發(fā)芽種子吸收峰的吸光度值的特點(diǎn)篩選出多個比較典型的吸收峰，并記錄不同波數(shù)的吸光度。原始數(shù)據(jù)采用Origin 9.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb、Cd和酸脅迫對楓香種子萌發(fā)中可溶性蛋白的影響

圖1 酸、Pb、Cd脅迫對楓香種子可溶性蛋白含量的影響Figure 1 Effects of acid，Pb，Cd stresses on soluble protein content in Liquidambar formosana seed germination process

如圖1所示隨萌發(fā)時間的延長，可溶性蛋白整體均呈下降趨勢，且同處理下各萌發(fā)時段之間差異顯著（除Pb-500外）。其中隨pH值減?。▓D1a），第4 d可溶性蛋白含量先增后減，第7 d則相反。第10 d時pH-3.5處理顯著低于CK（P＜0.05）?？扇苄缘鞍缀侩S萌發(fā)時間的增加仍呈整體下降趨勢，脅迫組在萌發(fā)后期（10 d）略有提高。Pb脅迫下（圖1b）萌發(fā)初期（4 d）各脅迫組之間差異顯著（P＜0.05），呈先增后減再增趨勢，Pb-1000時達(dá)最大值，相比CK提高了9.78%。未萌發(fā)種子可溶性蛋白含量與發(fā)芽第4 d的變化規(guī)律相反，各組間差異同樣顯著。發(fā)芽第7 d時Pb-500及Pb-1000處理下可溶性蛋白含量顯著高于CK（P＜0.05），可見可溶性蛋白含量的升高是楓香種子在高濃度Pb脅迫下的防御機(jī)制之一。而發(fā)芽第7 d的Cd-25、Cd-50則顯著低于CK，其余萌發(fā)時間段內(nèi)可溶性蛋白含量與CK相比均無顯著差異。

2.2 Pb、Cd和酸脅迫對楓香種子萌發(fā)中可溶性糖的影響

圖2 酸、Pb、Cd脅迫對楓香種子可溶性糖含量的影響Figure 2 Effects of acid，Pb，Cd stresses on soluble sugar content in Liquidambar formosana seed germination process

如圖2所示，相同處理下楓香種子萌發(fā)過程中第0 d（干種子）的可溶性糖含量顯著高于其余萌發(fā)階段（P＜0.05），且未萌發(fā)種子的可溶性糖均是最低含量（圖2a）。Cd脅迫第10 d時可溶性糖含量先減后增，Cd-25顯著低于CK。發(fā)芽第4 d時隨pH值減小，可溶性糖含量呈先增后減再增趨勢，與第4 d Pb脅迫變化趨勢一致，其中 pH-3.5、pH-5.5、Pb-250和Pb-1000顯著高于 CK（P＜0.05），相比 CK 分別提高了25.28%、22.56%、16.12%、26.82%。Pb脅迫第7 d時可溶性糖含量呈下降趨勢，第10 d時則呈先降后增變化，CK均顯著高于脅迫組（P＜0.05）。

2.3 Pb、Cd和酸脅迫對楓香種子萌發(fā)中還原糖的影響

圖3 酸、Pb、Cd脅迫對楓香種子還原糖含量的影響Figure 3 Effects of acid，Pb，Cd stresses on reducing sugar content in Liquidambar formosana seed germination process

楓香種子在萌發(fā)初期還原糖含量較低，在萌發(fā)過程中還原糖含量總體呈上升趨勢，說明種子中的儲藏物質(zhì)發(fā)生水解形成還原性糖類（圖3），萌發(fā)中期（7 d）pH-5.5的還原糖含量和萌發(fā)后期（10 d）pH-4.5的還原糖含量均顯著高于CK，分別比CK提高了62.19%、97.22%。Pb脅迫初期（4 d）及后期（10 d）Pb-250處理下還原糖含量均高于CK，其中第10 d達(dá)到顯著水平（P＜0.05），呈多項(xiàng)式變化規(guī)律且波動范圍大。Cd脅迫時，Cd-25處理在整個萌發(fā)進(jìn)程中還原糖含量均高于CK（P＜0.05），可見Cd-25處理能促進(jìn)楓香種子萌發(fā)過程中營養(yǎng)物質(zhì)的水解，使還原糖含量高于CK。未萌發(fā)種子還原糖含量整體較低。

2.4 楓香種子FTIR譜變化對Pb、Cd和酸脅迫的響應(yīng)

圖4 酸脅迫下楓香種子傅里葉紅外光譜圖、特征峰變化譜圖Figure 4 Effect of acid stress on FTIR spectra and band height changes of Liquidambar formosana seed

傅里葉變換紅外光譜（FTIR）是一種基于化合物中官能團(tuán)和極性鍵振動的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)。圖4～圖6為不同酸、Pb和Cd處理?xiàng)飨惴N子各主要化學(xué)成分的綜合反應(yīng)，可以依據(jù)其所含化學(xué)成分的官能團(tuán)特征信息，找到相應(yīng)紅外光譜吸收峰的歸屬。其中3 410.55 cm-1處附近的峰是分子間氫鍵O-H自由羥基的伸縮振動峰，主要來自于纖維素、半纖維素、多糖等碳水化合物。隨著酸脅迫的增強(qiáng)，吸收峰移向高頻3 428.87 cm-1，同時峰形變寬（圖4）。2 926.497 cm-1附近是羧酸O-H與甲基飽和C-H鍵的伸縮振動重疊峰，主要來自于碳水化合物、維生素和各種生物膜及細(xì)胞壁的組織等成分。2 855.142 cm-1處是CH2對稱伸縮振動，來自長鏈烷基。不同處理下，楓香種子的光譜在1 746.225～1 162.885 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)差異較大，特征峰的數(shù)量和相對吸光度值變化幅度均最為劇烈。1 746.225～1 652.723 cm-1波數(shù)主要為氨基酸蛋白質(zhì)類C=O鍵伸縮振動，為酰胺Ⅰ帶，1 652.723～1 541.835 cm-1是-NH彎曲振動，為酰胺Ⅱ帶[16]。1 162.885 cm-1波數(shù)是蛋白質(zhì)分子氨基酸殘基、纖維素糖苷中C-O鍵的伸縮振動。720.294 2 cm-1是強(qiáng)特征性的脂肪族吸收峰，峰弱且寬。

圖4～圖6中種子吸光度最高的波數(shù)為2 926.497、2 855.142、1 746.225、1 162.885、720.294 2 cm-1表明干種子內(nèi)總糖、含油脂化合物、蛋白質(zhì)、維生素、脂肪等各有機(jī)質(zhì)含量達(dá)最大值。種子萌發(fā)后，隨酸脅迫（圖4）的增強(qiáng)特征峰變化值整體呈下降趨勢，pH-3.5處理組峰值略有提升。H+濃度升高，小分子有機(jī)物質(zhì)（碳水化合物）、多糖組分上含有的主要基團(tuán)為-OH和COO-與H+結(jié)合，含量減少。為了降低H+的毒害，刺激發(fā)芽種子內(nèi)其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化為富含O-H的小分子有機(jī)物，其含量在pH-3.5略有增加。

圖5 Pb脅迫下楓香種子傅里葉紅外光譜圖、特征峰變化譜圖Figure 5 Effect of lead stress on FTIR Spectra and band height changes of Liquidambar formosana seed

圖5 中Pb-250處理下2 926.497 cm-1對應(yīng)的吸光度大于CK，飽和C-H的伸縮振動，刺激膜脂和細(xì)胞壁果膠中常見的酯類化合物合成。在3 410.55、2855.142 cm-1波數(shù)附近Pb-500處理下吸光度大于CK，同時峰形變窄，由此可見Pb-500處理利于纖維素、半纖維素、多糖等碳水化合物的合成。這說明高濃度的Pb促進(jìn)了多糖、纖維素、半纖維素等有機(jī)物的分泌和運(yùn)輸，楓香種子則通過滲透作用來增強(qiáng)對Pb的抗逆性。Pb-1000時各波數(shù)吸收峰值再次下降，但吸光度變化幅度不大。

Cd-25脅迫組在 2 926.497、2 855.142、720.294 2 cm-1等波數(shù)處的吸光度均大于CK，該峰的吸光度上升，可能通過提高所含的自由羥基數(shù)量參與結(jié)合重金屬離子；分泌有機(jī)酸螯合Cr2+及分泌氨基酸、多肽類物質(zhì)、蛋白質(zhì)及醇、酯基、醚基或酚類等化合物，減少Cr2+的毒害。當(dāng) Cr2+濃度大于 50 mg·L-1時，峰值又呈下降趨勢，原因是高Cr2+脅迫抑制了楓香種子分泌碳水化合物、有機(jī)酸、氨基酸、多肽類物質(zhì)和蛋白質(zhì)。說明低濃度Cd處理對楓香種子萌發(fā)過程中多糖、蛋白質(zhì)、纖維素等有機(jī)質(zhì)合成均有促進(jìn)作用。

圖6 Cd脅迫下楓香種子傅里葉紅外光譜圖、特征峰變化譜圖Figure 6 Effect of Cd stress on FTIR spectra and band height changes of Liquidambar formosana seed

表1 Pb、Cd和酸脅迫下楓香種子α-淀粉酶活性（mg·g-1·min-1）Table 1 Activity of α-amylase in Liquidambar formosana seeds under Pb，Cd and acid stress（mg·g-1·min-1）

2.5 Pb、Cd和酸脅迫對楓香種子淀粉酶活性的影響

2.5.1 Pb、Cd和酸脅迫對楓香種子α-淀粉酶活性的影響

淀粉是種子的主要儲藏物質(zhì)，種子萌發(fā)的過程中在淀粉酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)樾》肿犹穷?，為幼苗生長提供能量和物質(zhì)合成碳架。因此，淀粉酶活力大小與種子的萌發(fā)關(guān)系密切。由表1可知隨Pb濃度的增加，楓香種子α-淀粉酶活性均在Pb-500時達(dá)最大值。α-淀粉酶在萌發(fā)過程中由糊粉層細(xì)胞合成并轉(zhuǎn)運(yùn)到胚乳參與淀粉的降解，隨時間的延長快速上升，各Pb脅迫濃度下均在發(fā)芽第7 d時達(dá)最大值，后期活性下降。Cd脅迫下發(fā)芽初期（4 d）Cd-25處理組α-淀粉酶活性顯著低于CK，發(fā)芽中后期（7、10 d）則顯著高于CK（P＜0.05）。酸脅迫萌發(fā)過程中，α-淀粉酶活性呈先增后減趨勢，均在第7 d達(dá)最大值。隨pH值減小，發(fā)芽初期（4 d）α-淀粉酶活性并無顯著差異（P＞0.05），第7 d時pH-3.5處理組顯著大于CK，第10 d時同樣呈先增后減趨勢，脅迫處理均大于CK組。

2.5.2 Pb、Cd和酸脅迫對楓香種子β-淀粉酶活性的影響

β-淀粉酶可以以酶原的形式存在于干種子中，且酶活性在萌發(fā)過程中快速上升。由表2可知，Pb脅迫下發(fā)芽初中期（4、7 d）β-淀粉酶活性呈多項(xiàng)式變化-增加-降低-增加趨勢，Pb-1000顯著大于CK（P＜0.05）。隨時間的延長除CK外各Pb脅迫組均呈先增后減趨勢。Cd處理下，萌發(fā)過程中除Cd-50外均呈先增后減再增變化。第4 d時Cd-25處理顯著大于CK，而第10 d時卻顯著低于CK，說明萌發(fā)初期低濃度的Cd的脅迫促進(jìn)楓香種子β-淀粉酶活性的增加，到后期卻轉(zhuǎn)為抑制。隨pH值減小，第4 d時酸脅迫組β-淀粉酶含量均顯著高于CK，第7 d時pH-4.5、pH-5.5處理均顯著高于CK（P＜0.05）。

2.6 楓香種子胚乳透射電鏡觀察

未經(jīng)脅迫處理的楓香種子胚乳細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)如圖7（a～d）所示，胚乳細(xì)胞的細(xì)胞壁邊緣規(guī)則平整，輪廓清晰，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)濃厚，線粒體及其嵴結(jié)構(gòu)清晰，液泡內(nèi)分布著聚積成較大塊狀的高電子致密物質(zhì)，其主要成分是脂蛋白，脂蛋白的數(shù)量較多，體積也較大，并有少量淀粉粒堆積，細(xì)胞代謝旺盛。圖7（e～h）中Pb脅迫下楓香種子胚乳細(xì)胞的細(xì)胞核向細(xì)胞壁靠攏，使細(xì)胞核一側(cè)凹陷、變形，排布在細(xì)胞核周圍的線粒體內(nèi)部空泡化呈解體癥狀，脊突排列無序，被膜出現(xiàn)破裂，細(xì)胞中出現(xiàn)少量的黑色沙粒狀的高電子致密物質(zhì)，細(xì)胞壁與細(xì)胞膜出現(xiàn)嚴(yán)重質(zhì)壁分離現(xiàn)象且細(xì)胞間隙有黑色顆粒沉淀，可能是大量Pb2+沉積的結(jié)果。Cd脅迫下（圖7 i～l）細(xì)胞壁及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)模糊、嚴(yán)重斷裂，細(xì)胞質(zhì)體中較多的類囊體出現(xiàn)解體，線粒體也開始降解，形狀變得較為模糊，細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)中有聚集的黑斑，推測是Cd2+沉積。在未萌發(fā)的種子中細(xì)胞內(nèi)的膜系統(tǒng)空泡化嚴(yán)重，各細(xì)胞器出現(xiàn)不可逆的損傷（圖7m～p），并伴有大量脂滴，有研究認(rèn)為：在種子成熟過程中，胚乳內(nèi)脂類物質(zhì)迅速增加可能是導(dǎo)致該種子萌發(fā)困難的主要原因[18]，細(xì)胞核核膜、核質(zhì)、核仁出現(xiàn)不同程度的破壞，其中核仁逐漸消失，降解產(chǎn)物與核質(zhì)中已被破壞的染色體凝聚成為染色較深的纖維狀顆粒。

表2 Pb、Cd和酸脅迫下楓香種子β-淀粉酶活性（mg·g-1·min-1）Table 2 Activity of β-amylase in Liquidambar formosana seeds under Pb，Cd and acid stress（mg·g-1·min-1）

圖7 不同處理下楓香種子胚乳細(xì)胞透射電鏡圖Figure 7 Ultrastructure of endosperm cells of Isachne globosa in the different control treatments

3 討論

種子萌發(fā)是植物個體發(fā)育的最初階段，而萌發(fā)所需要的物質(zhì)和能量來源于淀粉和貯存蛋白等貯存物質(zhì)的氧化分解和能量的釋放。丁婉等[23]發(fā)現(xiàn)白三葉（Trifolium repens L.）種子的總糖含量在Zn脅迫下降低，同時萌發(fā)種子還原糖的含量會增高，以此來適應(yīng)重金屬Zn的脅迫；Zn脅迫對α-淀粉酶活性有促進(jìn)作用。植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，其含量的變化一定程度上反映了植物體內(nèi)各種代謝活動的強(qiáng)弱[24]。劉玉艷等[10]發(fā)現(xiàn)Cd、Pb、Ni處理后，萌發(fā)初期降低地膚（Kochia scoparia）種子中的可溶性蛋白含量，隨著處理時間的延長，處理的蛋白質(zhì)含量逐漸高于CK；除了短期Cd處理可溶性糖含量極顯著降低外，其余各處理均極顯著提高了地膚萌發(fā)種子中的可溶性糖含量。本研究中3種脅迫條件下，隨萌發(fā)時間的延長可溶性蛋白含量、可溶性糖含量均減少，還原糖則增加，α-淀粉酶活性及β-淀粉酶活性均呈先增后減趨勢。其中隨Pb濃度的增加，萌發(fā)初中期（4、7 d）高濃度的Pb脅迫促進(jìn)了可溶性蛋白含量及β-淀粉酶活性降低，α-淀粉酶活性則在Pb-500時達(dá)最大值。第4 d的可溶性糖含量增加，第7 d則相反。發(fā)芽后期（10 d）還原糖含量整體較大，其中低濃度Pb-250處理下還原糖含量達(dá)最大值。說明楓香種子不同萌發(fā)時段內(nèi)對Pb脅迫的響應(yīng)表現(xiàn)為滲透物質(zhì)之間相互協(xié)調(diào)，發(fā)芽初中期可溶性蛋白含量、及淀粉酶活性增加以保證前期Pb脅迫下種子的萌發(fā)。重金屬Pb、Cd處理下后期還原糖含量均先增后減再增，造成這種現(xiàn)象的原因可能為，一是在種子萌發(fā)初期，由于大量的多糖在各種酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為還原糖，使種子中還原糖含量增加；二是由于種子萌發(fā)迅速，大量的還原糖被利用，而高濃度的Pb、Cd處理的種子萌發(fā)緩慢，消耗還原糖較少，造成還原糖的積累。Cd脅迫條件下滲透物質(zhì)變化規(guī)律與Pb脅迫不同，發(fā)芽初期除淀粉酶活性外均無顯著變化，第7 d的可溶性蛋白和還原糖及第10 d的可溶性糖含量均有顯著的先減后增變化?？梢婋S脅迫加深，萌發(fā)中后期對Cd的響應(yīng)逐漸加強(qiáng)。酸脅迫下，各萌發(fā)階段可溶性蛋白含量均呈下降趨勢。萌發(fā)初中期可溶性糖、還原糖及β-淀粉酶活性均在pH-5.5時達(dá)最大值，萌發(fā)后期α-淀粉酶活性和還原糖含量則在pH-4.5時達(dá)最大值。表明一定程度的弱酸（pH-5.5、pH-4.5）能促進(jìn)楓香種子萌發(fā)過程中滲透物質(zhì)的合成。

傅里葉紅外光譜技術(shù)（FTIR）是研究植物生長發(fā)育的一項(xiàng)重要且方便快捷的技術(shù)，不僅能夠基于化合物中官能團(tuán)和極性鍵的振動進(jìn)行定量分析，還可以幫助判斷分子中含有何種官能團(tuán)，更重要的是從不同樣品的紅外光譜差異反映其在植物化學(xué)組成上的差異程度[22]。目前國內(nèi)學(xué)者已經(jīng)應(yīng)用FTIR技術(shù)研究植物對重金屬的耐性機(jī)制[25]。如李新等[22]應(yīng)用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)研究了黃豆[Glycine max（Linn.）Merr]生理特性，通過增加糖類和氨基酸等有機(jī)物含量來響應(yīng)Cr6+脅迫。王成等[25]通過FTIR技術(shù)揭示了構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera L.）試管苗葉片通過合成更多的纖維素、蛋白質(zhì)、羧酸以及部分酯類有機(jī)物來響應(yīng)Cd脅迫。本研究中也發(fā)現(xiàn)Pb-250處理刺激膜脂和細(xì)胞壁果膠中常見的酯類化合物合成，Pb-500處理利于纖維素、半纖維素、多糖等碳水化合物的合成，以此來增強(qiáng)對Pb的抗逆性。低濃度Cd處理對楓香種子萌發(fā)過程中多糖、蛋白質(zhì)、纖維素等有機(jī)質(zhì)均有促進(jìn)作用。這與前人研究結(jié)論一致[22，25]。不同的是隨酸脅迫的增強(qiáng)特征峰變化值整體呈下降趨勢，而pH-3.5處理組峰值略有提升。為了降低H+的毒害，刺激發(fā)芽種子內(nèi)其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化為富含O-H的小分子有機(jī)物與H+結(jié)合，使其含量略有增加。

碳水化合物、半纖維素、蛋白質(zhì)、脂肪和油脂是胚乳的主要貯藏物質(zhì)。高濃度Pb、Cd脅迫下楓香種子胚乳細(xì)胞均受到不同程度的損傷，其中細(xì)胞核凹陷、變形，線粒體內(nèi)部空泡化呈解體癥狀，脊突排列無序，被膜出現(xiàn)破裂，細(xì)胞中出現(xiàn)少量的黑色沙粒狀的高電子致密物質(zhì)。細(xì)胞壁及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)模糊、嚴(yán)重斷裂。這與徐義昆等[26]通過對Pb脅迫下的香蒲（Typha ori?entalis Presl）細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察的結(jié)論和陳麗鵑等[27]對煙草（Nicotiana tabacum L.）在Cd脅迫下的各細(xì)胞器變化以及通過掃描電鏡觀察小麥（Triticum aesti?vum Linn.）種子微波輻射前后胚乳微觀結(jié)構(gòu)[28]研究成果類似。細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)中有聚集的黑斑，推測是Pb2+、Cd2+沉積，這對提高楓香對抗Pb、Cd毒害具有重要意義，其各細(xì)胞器沉積的Pb、Cd含量還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

（1）楓香種子對重金屬Pb、Cd存在不同的階段性響應(yīng)，發(fā)芽第4、7 d可溶性糖、可溶性蛋白含量及淀粉酶活性增加，對Pb的抗逆性起主導(dǎo)作用，保證了前期Pb脅迫下種子的萌發(fā)。Cd處理發(fā)芽第7 d可溶性蛋白增加，而發(fā)芽第10 d則是可溶性糖含量升高。相比Cd脅迫楓香種子對Pb脅迫的響應(yīng)更快速。

（2）大部分Pb2+、Cd2+沉積在楓香種子胚乳細(xì)胞的細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞區(qū)室化作用顯著。

（3）Pb-250處理刺激膜脂和細(xì)胞壁果膠中常見的酯類化合物合成，Pb-500、Cd-25處理利于纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)、多糖等有機(jī)質(zhì)的合成，以此來增強(qiáng)對Pb、Cd的抗逆性。

（4）酸脅迫降低了可溶性蛋白含量，一定程度的弱酸（pH-5.5、pH-4.5）卻能提高楓香種子萌發(fā)過程中可溶性糖、還原糖含量及淀粉酶活性。為了降低H+的毒害，刺激發(fā)芽種子內(nèi)其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化為富含O-H的小分子有機(jī)物，特征峰峰值在pH-3.5略有增加。綜上，楓香可在重金屬及酸污染的長汀稀土礦廢棄地正常生長，其種子通過滲透物質(zhì)相互協(xié)調(diào)及細(xì)胞區(qū)室化作用對Pb、Cd和酸脅迫有積極的響應(yīng)。