基于高通量測序研究草莓根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性①

趙 帆, 趙密珍, 王 鈺, 關(guān) 玲, 龐夫花

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基于高通量測序研究草莓根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性①

趙 帆1,2, 趙密珍1*, 王 鈺2, 關(guān) 玲1, 龐夫花1

(1 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；2 安徽大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，合肥 230601)

研究草莓根際土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)，對健康草莓土壤生態(tài)系統(tǒng)的構(gòu)建和保持具有重要意義。以不同地區(qū)草莓根際土壤為研究樣本，利用Miseq平臺Illumina第二代高通量測序技術(shù)并結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)分析土壤細(xì)菌16S rRNA基因V4+V5區(qū)域和真菌ITS1+ITS2區(qū)域的豐富度和多樣性指數(shù)以及群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：從15個(gè)草莓根際土壤樣本中獲得4 554個(gè)細(xì)菌分類操作單元OTU和1 298個(gè)真菌OTU，草莓根際土壤的優(yōu)勢細(xì)菌門為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門，主要的優(yōu)勢細(xì)菌屬有16種；優(yōu)勢真菌門為子囊菌門、接合菌門和擔(dān)子菌門，主要的優(yōu)勢真菌屬有8種。冗余分析(RDA)顯示，全氮和pH對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響最大，共解釋了61% 的群落變化，各因子的貢獻(xiàn)率大小依次為土壤全氮>pH>有效磷>全鉀>全磷>有機(jī)質(zhì)>速效鉀>堿解氮；相關(guān)性分析也表明，土壤理化指標(biāo)均與不同優(yōu)勢菌門存在密切的相關(guān)關(guān)系。本研究結(jié)果加深了對草莓根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的認(rèn)識，為深入研究草莓根際微生物多樣性及功能與環(huán)境因子之間的關(guān)系提供了借鑒。

草莓；根際土壤；Illumina高通量測序；土壤微生物群落；土壤理化性質(zhì)

草莓(Duch.)屬薔薇科(Rosa-ceae)草莓屬植物，是一種營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的水果，因其色、香、味俱佳，深受消費(fèi)者青睞。草莓在同一地塊上連續(xù)種植兩年以上，地下病蟲害逐年加重，草莓長勢逐年變?nèi)?，表現(xiàn)為植株發(fā)育受阻，甚至死亡；果品質(zhì)量逐年變劣，產(chǎn)量逐年下降。特別是近年來設(shè)施農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，設(shè)施草莓栽培面積逐漸增加，草莓連作障礙發(fā)生越來越嚴(yán)重[1]，嚴(yán)重制約了草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，亟待解決。

土壤根際環(huán)境是一個(gè)特殊的生態(tài)系統(tǒng)，它與非根際土壤在生物學(xué)、化學(xué)等特性上具有顯著差異[2]。土壤根際環(huán)境受植物根系的影響，是有益微生物及有害微生物同宿主植物發(fā)生相互作用的一個(gè)區(qū)域，蘊(yùn)含著充足的微生物資源[3]。土壤微生物能促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的分解及土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，對維持土壤質(zhì)量及推動(dòng)土壤的健康發(fā)展具有十分重要的作用[4]。土壤微生物能夠影響土壤養(yǎng)分的吸收和轉(zhuǎn)化，微生物群落結(jié)構(gòu)的失衡是連作障礙的主要原因[5]。

傳統(tǒng)的土壤微生物研究方法如微生物平板培養(yǎng)法、生物標(biāo)記法、Biolog鑒定系統(tǒng)法等[6]會過低估計(jì)土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成，很難詳細(xì)描述出土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成方面的信息，也無法描述不同群體的生理差異。第二代測序Illumina MiSeq方法有效避免了通量低、操作復(fù)雜和準(zhǔn)確率低等缺陷[6-7]，具有操作簡單和成本較低的優(yōu)勢，并采用邊合成邊測序原理，結(jié)果可信度高。MiSeq高通量測序平臺，不僅實(shí)現(xiàn)了對多樣品的多個(gè)可變區(qū)同時(shí)測序，而且在測序速度和測序通量上都進(jìn)一步得到提升。目前此平臺在微生物多樣性群落結(jié)構(gòu)研究方面得到了廣泛的應(yīng)用[8-9]。

一些研究發(fā)現(xiàn)隨著草莓連作程度的加深，根際土壤中細(xì)菌數(shù)量逐漸降低，真菌數(shù)量逐漸增加，細(xì)菌和真菌的比值逐漸降低，土壤微生物由“細(xì)菌型”向“真菌型”轉(zhuǎn)變，說明土壤真菌與草莓連作的關(guān)系密切，其中病原真菌是草莓連作障礙因子之一，主要包括鐮刀菌屬、輪枝菌屬、絲核菌屬、腐霉屬、疫霉屬、擬盤多毛孢屬和炭疽菌屬致病真菌。國內(nèi)研究結(jié)果表明，草莓病原真菌以鐮刀菌和絲核菌為主[10]。草莓根際土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)目前還不清楚，本研究以不同地區(qū)草莓根際土壤為材料，采用高通量測序技術(shù)，探討不同地區(qū)草莓根際土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)，以期為草莓根際微生態(tài)環(huán)境研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年9—11月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草莓溫室大棚進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

試材為生長整齊一致的三葉一心期“紫金久紅”草莓苗。盆栽土壤分別采集于江蘇省4個(gè)地區(qū)草莓連作大棚0 ~ 20 cm土層，分別是溧水白馬(BM)、邳州港上(G)、東海石榴(S)、溧水傅家邊(FJB)，再從溧水白馬一個(gè)多年沒有開墾的農(nóng)田耕作層取土盆栽作為對照(CK)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將不同土壤與珍珠巖以3∶1的體積充分混勻裝盆。塑料盆直徑16 cm，深20 cm，每盆裝土1 500 g，每盆栽草莓1株，每種土壤栽種20盆。草莓苗于2016年9月10日定植，定植后早晚各澆一次水且適當(dāng)遮陰7 d，之后正常水、肥、光照管理，溫度維持在20 ~ 25 ℃，光周期約12 h (晝)/12 h (夜)。定植后50 d時(shí)(開花前)土壤取樣及測定分析。分析用土壤來自長勢較為一致的草莓根際土，采用抖土法獲取粘附在3株草莓根系表面上的根際土壤并充分混勻作為1個(gè)土樣，重復(fù)3次。所獲取的土壤一部分保存于?20 ℃冰箱用于土壤微生物分析，其余根際土壤風(fēng)干后過 100 目網(wǎng)篩用于土壤理化性質(zhì)的分析。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測定 采用硫酸消解，微量凱氏定氮法測定土壤全氮含量；采用氫氧化鈉熔融，硫酸鉬銻抗比色法測定土壤全磷含量；采用火焰光度計(jì)法測定土壤全鉀含量；采用堿解擴(kuò)散法測定土壤堿解氮含量；采用重鉻酸鉀容量法-稀釋熱法測定土壤有機(jī)質(zhì)含量；采用碳酸氫鈉浸提，鉬銻抗比色法測定有效磷含量；采用乙酸銨浸提，火焰光度計(jì)法測定速效鉀含量；土壤pH用無CO2蒸餾水(水土質(zhì)量比5∶1)浸提，pH計(jì)( METTLER TOLEDO)測定[11]。

1.3.2 土壤微生物基因組DNA的提取 提取試劑盒為Omega土壤微生物DNA提取試劑盒，土壤樣品0.5 g，按試劑盒的試驗(yàn)步驟進(jìn)行土壤微生物總DNA的提取，DNA樣品于?20 ℃保存待用。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及Illumina高通量測序 提取樣品總DNA后，根據(jù)設(shè)計(jì)得到細(xì)菌V4+V5 (F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′，R：5′-CCGTCAATT-CMTTTRAGTTT-3′)和真菌ITS1+ITS2 (F：5′-CTT-GGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′，R：5′-GCTGCGTT-CTTCATCGATGC-3′)合成的引物，合并引物接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：含15 mmol/L MgCl2的10×Buffer 10.0 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μl，10 μmol/L引物各5.0 μl，5 U/μl Taq酶1.0 μl，DNA模板4.0 μl，滅菌去離子水73.0 μl，總體積100 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增后，對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq PE250進(jìn)行測序，測序由南京集思慧遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.4 生物信息分析方法

1.4.1 數(shù)據(jù)過濾及質(zhì)量評估 數(shù)據(jù)過濾主要步驟：①去除平均質(zhì)量值低于20的長Reads；②去除Reads含N的堿基數(shù)超過3個(gè)的長Reads；③Reads長度范圍為220 ~ 500 nt。

1.4.2 序列優(yōu)化 利用Mothur軟件(version 1.34.4，http://www. mothur.org/)，進(jìn)行序列優(yōu)化，主要步驟[12]為：①對序列進(jìn)行篩選，去除模糊堿基數(shù)大于0、單堿基高重復(fù)區(qū)大于8、重疊區(qū)錯(cuò)配數(shù)大于0及長度大于97.5% 的序列(細(xì)菌)及重疊區(qū)長小于20 bp的序列(真菌)；②進(jìn)行去冗余處理。

1.4.3 OTU聚類分析 為便于下游物種多樣性分析，將Tags聚類為OTU (operational taxonomic units)。首先，將拼接的Tags中的Singletons (對應(yīng)Reads只有一條的序列)過濾掉，因?yàn)镾ingletons可能由于測序錯(cuò)誤造成，故將這部分序列去除，不加入聚類分析。進(jìn)而，利用Usearch在0.97相似度下進(jìn)行聚類，對聚類后的序列進(jìn)行嵌合體過濾后，得到用于物種分類的OTU，每個(gè)OTU被認(rèn)為可代表一個(gè)物種。

1.5 數(shù)據(jù)分析

隨機(jī)選取相似度在97% 條件下的OTU生成稀釋曲線，并利用軟件Mothur計(jì)算豐富度指數(shù)Chao和Observed species指數(shù)，多樣性指數(shù)Simpson和Shannon?；赗DP和UNITE分類學(xué)數(shù)據(jù)庫對OTU進(jìn)行物種注釋，并用Excel和SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用Excel和R語言工具對樣品物種組成及相對豐度統(tǒng)計(jì)結(jié)果繪制柱狀圖和Veen圖。采用Canoco軟件進(jìn)行冗余分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

由表1可知，不同樣品土壤理化性質(zhì)表現(xiàn)出顯著差異。其中BM土壤全氮、全磷、有機(jī)質(zhì)、速效鉀和有效磷含量顯著高于其他樣品，S土壤全鉀和堿解氮含量顯著高于其他樣品，F(xiàn)JB 土壤pH偏低，屬于酸性。

2.2 土壤樣品測序深度評估

15個(gè)細(xì)菌樣品測序，雙端reads拼接后共產(chǎn)生623 498條Raw Tags，序列優(yōu)化后共得到566 667條Clean Tags，聚類后一共獲得4 554個(gè)OTU；15個(gè)真菌樣品測序，雙端reads拼接后共產(chǎn)生547 484條Raw Tags，序列優(yōu)化后共得到542 038條Clean Tags，聚類后一共獲得1 298個(gè)OTU。參照文獻(xiàn)[13]隨機(jī)抽取測序序列，將抽到的序列數(shù)與它們所能代表OTU的數(shù)目構(gòu)建曲線，在97% 相似性水平下聚類OTU并制作各樣品的稀釋曲線(圖1)，可知細(xì)菌和真菌曲線逐漸趨向平坦，說明測序數(shù)量合理。

表1 草莓根際土壤理化性質(zhì)

注：CK表示對照土壤，BM、S、FJB、G分別表示江蘇溧水白馬、東海石榴、溧水傅家邊、邳州港上草莓連作土壤；同列不同小寫字母表示不同土壤樣品間差異在<0.05水平顯著；下同。

圖1 土壤樣品細(xì)菌(A)、真菌(B)多樣品稀釋曲線

2.3 草莓根際土壤微生物群落豐富度和多樣性變化

Observed species指數(shù)和Chao指數(shù)可反映群落物種豐富度，由表2可知，BM以及S土壤細(xì)菌Observed species指數(shù)和Chao指數(shù)較高，相較于CK分別增加了10.80% 和14.50% 以及10.84% 和13.28%，但與CK無顯著性差異；FJB以及G土壤細(xì)菌Observed species指數(shù)相較于CK分別減少了24.04% 和21.61%，均有顯著性差異；Chao指數(shù)FJB與CK有顯著性差異，G與CK差異不顯著，BM、S和G分別與FJB有顯著性差異。BM以及S土壤真菌Observed species指數(shù)和Chao指數(shù)相較于CK分別增加了4.18% 和7.06% 以及7.41% 和8.35%，但與CK無顯著性差異；而FJB以及G土壤真菌Observed species指數(shù)和Chao指數(shù)較低，真菌Observed species指數(shù)相較于CK分別減少了40.74% 和40.88%，且有顯著性差異，真菌Chao指數(shù)相較于CK分別減少了37.32% 和38.51%，F(xiàn)JB與CK有顯著性差異，G與CK 無顯著性差異，BM和S分別與FJB和G有顯著性差異，F(xiàn)JB與G無顯著性差異。由此可見，土壤細(xì)菌和真菌群落物種豐富度的變化因區(qū)域的不同而存在較大差異。

Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)可反映群落物種多樣性。由表2可知，BM以及S土壤細(xì)菌Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)較高，相較于CK分別增加了3.12% 和5.34% 以及3.12% 和8.25%；FJB以及G土壤細(xì)菌Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)較低，F(xiàn)JB相較于CK其Simpson指數(shù)增加了1.04%，Shannon指數(shù)下降8.62%，G土壤相較于CK分別下降3.13% 和12.50%，但FJB、G與CK均無顯著性差異。BM土壤真菌Simpson指數(shù)最高，相較于CK增加了2.13%，S、FJB和G土壤真菌Simpson指數(shù)都低于CK，分別減少了4.26% 和3.19% 以及32.98%，S、FJB與CK 無顯著性差異，而G與CK 有顯著性差異；土壤真菌Shannon指數(shù)BM、S、FJB和G都低于CK，分別減少了1.72%、9.78%、17.67% 和42.53%，除G與CK有顯著性差異外，其他與CK 無顯著性差異，BM、S、FJB之間無顯著性差異，BM、S與G有顯著性差異。由此，可見土壤細(xì)菌群落物種多樣性的變化在不同區(qū)域間差異不顯著，而真菌群落物種多樣性存在差異。

表2 草莓根際土壤細(xì)菌和真菌群落豐富度和多樣性指數(shù)

2.4 草莓根際土壤微生物群落門類組成

從門的分類水平看，草莓根際土壤樣本中主要檢測出細(xì)菌10個(gè)門，分屬變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門、疣微菌門、藍(lán)藻門、浮霉菌門。其中，變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門為草莓根際土壤的優(yōu)勢菌種(表3)，草莓根際土壤樣本中變形菌門的相對豐度為23.51% ~ 35.46%，厚壁菌門的相對豐度為11.51% ~ 29.17%，放線菌門的相對豐度為8.48% ~ 16.48%，酸桿菌門的相對豐度為6.4% ~ 15.14%，綠彎菌門的相對豐度為5.88% ~ 10.39%。在優(yōu)勢菌種中，BM、S和FJB土壤放線菌門的相對豐度高于G和CK土壤，且FJB與CK差異顯著，BM、S、FJB和G土壤酸桿菌門的相對豐度都低于CK，且FJB與CK差異顯著。由此可見，草莓連作后土壤中細(xì)菌群落組成發(fā)生了變化。

測序結(jié)果表明，從草莓根際土壤中鑒定得到的真菌主要來自5個(gè)門，包括子囊菌門、接合菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門和球囊菌門 (表3)。其中，子囊菌門、接合菌門和擔(dān)子菌門為草莓根際土壤的優(yōu)勢菌種(表3)，草莓根際土壤樣本中子囊菌門的相對豐度為52.39% ~ 87.67%，接合菌門的相對豐度為1.88% ~ 7.79%，擔(dān)子菌門的相對豐度為3.06% ~ 18.23%。子囊菌門相對豐度最高的為FJB(87.67%)，依次為G(85.02%)、S(66.79%)、CK(60.35%)、BM(52.39%)，擔(dān)子菌門的相對豐度BM、S、FJB和G都小于CK。說明草莓連作后土壤中真菌群落組成發(fā)生了變化。

在屬水平上，不同土壤樣品細(xì)菌優(yōu)勢類群差異明顯。其中CK土壤優(yōu)勢類群為乳球菌屬(1.74%)、芽孢桿菌屬(12.60%)和(1.11%)；BM土壤優(yōu)勢類群為(3.44%)、中慢生根瘤菌屬(1.71%)、芽孢桿菌屬(6.58%)、乳桿菌屬(2.19%)、鏈霉菌屬(2.23%)、(2.81%)和豐佑菌屬(1.29%)；S土壤優(yōu)勢類群為芽孢桿菌屬(7.04%)、鏈霉菌屬 (3.21%)、(1.36%)、(1.04%)、芽單胞菌屬(2.1%)和豐佑菌屬 (1.14%)；FJB土壤優(yōu)勢類群為伯克氏菌屬 (7.68%)、(1.83%)、芽孢桿菌屬(11.78%)、乳球菌屬(2.44%)、鏈霉菌屬(5.60%)、(1.29%)和芽單胞菌屬(2.24%)；G土壤優(yōu)勢類群為伯克氏菌屬(1.28%)、芽孢桿菌屬(19.65%)、乳球菌屬(3.29%)、(2.68%)和鏈霉菌屬(1.53%)。

對已確定分類地位至屬的真菌分析表明，不同土壤樣品真菌優(yōu)勢類群差異也明顯(表3)。其中CK土壤優(yōu)勢類群為被孢霉屬(5.25%)；BM土壤優(yōu)勢類群為青霉菌屬(6.8%)、曲霉屬(4.45%)、(6.13%)、(3.62%)、被孢霉屬(7.26%)和(2.72%)；S土壤優(yōu)勢類群為青霉菌屬(18.04%)、曲霉屬(2.36%)、鐮刀菌屬(1.85%)、被孢霉屬(7.41%)和鬼傘屬(1.5%)；FJB土壤優(yōu)勢類群為青霉菌屬(28.52%)、曲霉屬(13.87%)、支頂孢屬(1.47%)、鐮刀菌屬(1.1%)和被孢霉屬(2.63%)；G土壤優(yōu)勢類群為青霉菌屬(1.86%)、曲霉屬(2.16%)、(1.44%)和支頂孢屬(1.18%)。

表3 草莓根際土壤微生物在門和屬水平上的豐度變化(%)

續(xù)表

微生物分類水平 門屬CKBMSFJBG 細(xì)菌芽單胞菌門小計(jì)5.50 ± 0.90 b4.63 ± 0.47 b8.31 ± 0.55 a5.08 ± 0.60 b3.98 ± 1.33 b 芽單胞菌屬0.98 ± 0.15 b0.70 ± 0.07 bc2.10 ± 0.17 a2.24 ± 0.38 a0.60 ± 0.18 bc 擬桿菌門小計(jì)5.80 ± 1.26 a5.17 ± 0.12 a4.18 ± 0.56 ab2.76 ± 0.47 b3.59 ± 0.73 ab 黃桿菌屬0.26 ± 0.10 a0.23 ± 0.08 a0.71 ± 0.33 a0.56 ± 0.29 a0.52 ± 0.28 a Flavisolibacter0.51 ± 0.24 a0.15 ± 0.02 b0.13 ± 0.01 b0.28 ± 0.03 ab0.12 ± 0.05 b Niastella0.08 ± 0.03 abc0.16 ± 0.05 a0.05 ± 0.01 bc0.12 ± 0.02 ab0.07 ± 0.02 abc Ohtaekwangia0.14 ± 0.03 b0.21 ± 0.02 a0.03 ± 0.01 c0.00 ± 0.00 c0.04 ± 0.02 c Chitinophaga0.28 ± 0.18 a0.00 ± 0.00 b0.03 ± 0.00 b0.03 ± 0.01 b0.07 ± 0.04 ab 浮霉菌門小計(jì)4.64 ± 0.88 a4.55 ± 0.51 a3.86 ± 0.25 a3.96 ± 0.33 a3.09 ± 0.92 a 小梨形菌屬0.85 ± 0.28 a0.39 ± 0.03 ab0.44 ± 0.03 ab0.64 ± 0.09 ab0.38 ± 0.16 ab 浮霉?fàn)罹鷮?.62 ± 0.15 a0.74 ± 0.08 a0.61 ± 0.03 a0.17 ± 0.01 b0.48 ± 0.13 a 如出芽菌屬0.66 ± 0.16 a0.50 ± 0.04 a0.21 ± 0.03 b0.17 ± 0.04 b0.11 ± 0.05 b Pir4 lineage0.16 ± 0.05 bc0.33 ± 0.05 a0.16 ± 0.01 bc0.01 ±0 .01 d0.19 ± 0.06 b Singulisphaera0.13 ± 0.03 b0.08±0.02 b0.13 ± 0.01 b0.29 ± 0.04 a0.09 ± 0.04 b 藍(lán)藻門小計(jì)1.95 ± 1.14 ab1.42 ± 0.29 b1.07 ± 0.21 b3.14 ± 0.83 ab7.07 ± 3.68 a 鞘絲藻屬0.03±0.02 a0.00 ± 0.00 a0.04 ± 0.02a0.00 ± 0.00 a0.02 ± 0.00 a 微鞘藻屬0.01 ± 0.00 a0.04 ± 0.04 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.01 ± 0.00 a 念珠藻屬0.00 ± 0.00 b0.03 ± 0.01 a0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b 席藻屬0.00 ± 0.00 a0.03 ± 0.02 a0.01 ± 0.01 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a Chlorogloeopsis0.00 ± 0.00 b0.04 ± 0.02 a0.00 ± 0.00 b0.00±0.00 b0.00 ± 0.00 b Persicaria minor0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.01 ± 0.00 a0.01 ± 0.01 a 疣微菌門小計(jì)0.74 ± 0.06 b1.37 ± 0.07 a1.24 ± 0.19 ab0.80 ± 0.04 b0.71 ± 0.13 b 豐佑菌屬0.64 ± 0.02 b1.29 ± 0.07 a1.14 ± 0.21 ab0.74 ± 0.04 ab0.57 ± 0.10 b 交替球菌屬0.00 ± 0.00 c0.06 ± 0.01 ab0.02 ± 0.01 bc0.02 ± 0.00 bc0.07 ± 0.03 a 紫紅球菌屬0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a 疣微菌屬0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a 真菌子囊菌門小計(jì)60.35±7.15b52.39±0.73b66.79 ± 4.83b87.67 ± 1.11 a85.02 ± 5.33 a 青霉菌屬0.83 ± 0.38 b6.80 ± 0.45 b18.04 ± 1.84 ab28.52 ± 4.92 a1.86 ± 0.27 b 曲霉屬0.95 ± 0.25 c4.45 ± 0.65 bc2.36 ± 0.77 bc13.87 ± 2.83 a2.16 ± 0.87 bc Mycothermus0.00 ± 0.0 0 c6.13 ± 1.00 a0.11 ± 0.02 bc0.00 ± 0.00 c1.44 ± 0.44 b 支頂孢屬0.59 ± 0.31 a0.30 ± 0.03 a0.70 ± 0.24 a1.47 ± 0.27 a1.18 ± 0.53 a 鐮刀菌屬0.81 ± 0.37 ab0.21 ± 0.07b1.85 ± 0.86 a1.10 ± 0.22 ab0.13 ± 0.09 b Westerdykella0.06 ± 0.01 b3.62 ± 0.90 a0.04 ± 0.02 b0.04 ± 0.02 b0.03 ± 0.02 b 接合菌門小計(jì)5.25 ± 1.51 ab7.79 ± 1.38 a7.41 ± 2.15 a2.64 ± 0.39 b1.88 ± 0.66 b 被孢霉屬5.25 ± 1.51 abc7.26 ± 1.18 ab7.41 ± 2.15 a2.63 ± 0.38 cd0.58 ± 0.29 d 毛霉菌屬0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a 擔(dān)子菌門小計(jì)18.23 ± 9.61a15.47 ± 5.73 a7.20 ± 2.34 a3.06 ± 0.77 a5.32 ± 1.72 a Phylloporus0.90 ± 0.29 a2.72 ± 2.48 a0.17 ± 0.09 a0.07 ± 0.05 a0.33 ± 0.17 a 隱球菌屬0.11 ± 0.10 b0. ± ±0.26 b0.22 ± 0.04 b0.23 ± 0.11 b0.67 ± 0.44 b Pseudozyma0.85 ± 0.69 a0.19 ± 0.06 a0.63 ± 0.20 a0.51 ± 0.03 a0.26 ± 0.11 a 鬼傘屬0.01 ± 0.01 a0.02 ± 0.01 a1.50 ± 1.49 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a 馬拉色氏霉菌屬0.04 ± 0.02 b0.01 ± 0.00 b0.01 ± 0.00 b0.01 ± 0.00 b0.03 ± 0.03 b Bjerkandera0.08 ± 0.07 a0.05 ± 0.03 a0.07 ± 0.02 a0.30 ± 0.27 a0.02 ± 0.01 a 壺菌門小計(jì)2.10 ± 0.69 b6.16 ± 2.29 a0.30 ± 0.11 b0.04 ± 0.02 b1.07 ± 0.34 b Spizellomyces0.00 ± 0.00 b0.39 ± 0.16 a0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b Pateramyces0.01 ± 0.00 b0.24 ± 0.06 a0.07 ± 0.06 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b Rhizophlyctis0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.01 ± 0.01 a0.01 ± 0.01 a0.00 ± 0.00 a 根生壺菌屬0.02 ± 0.02 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a0.00 ± 0.00 a 球囊菌門小計(jì)0.08 ± 0.02 ab0.19 ± 0.10 a0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b Paraglomus0.00 ± 0.00 b0.19 ± 0.10 a0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b 球囊霉屬0.07 ± 0.01 a0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b0.00 ± 0.00 b 其他小計(jì)13.99 ± 3.8018.00 ± 2.0518.30 ± 1.926.59 ± 0.466.71 ± 2.72

2.5 草莓根際土壤微生物類群分析

在97% 的相似度下，得到了每個(gè)樣品的OTU個(gè)數(shù)，CK、BM、S、G、FJB土壤分別獲得1 858、2 058、2 064、1 627和1 410個(gè)細(xì)菌OTU以及350、368、380、219和208個(gè)真菌OTU。Venn圖能夠反映組間或樣品之間共有和特有OTU數(shù)目，能夠直觀地表現(xiàn)出組間或樣品間OTU的重疊情況。從圖2中可以看出，不同地區(qū)之間共有806個(gè)細(xì)菌OTU以及107個(gè)真菌OTU，CK、BM、S、G、FJB土壤各自獨(dú)有202、274、147、386、190個(gè)細(xì)菌OTU以及206、172、141、76、71個(gè)真菌OTU。

圖2 草莓根際土壤細(xì)菌(A)、真菌(B) Venn圖

2.6 土壤理化性質(zhì)對微生物群落的影響

為了解土壤理化因子對土壤微生物群落的影響，在門水平上對土壤微生物群落進(jìn)行冗余分析(RDA)(圖3)。RDA分析的前兩個(gè)軸總共解釋了78.8% 的群落變化，第一個(gè)軸解釋了55.0%，第二個(gè)軸解釋了23.8%。土壤全氮對土壤微生物群落的影響最顯著，解釋了41% 的群落變化；其次是土壤pH，解釋了20% 的群落變化，所有理化因子總共解釋了90% 的群落變化，影響的順序?yàn)橥寥廊?pH>有效磷>全鉀>全磷>有機(jī)質(zhì)>速效鉀>堿解氮。

為了解環(huán)境因子與土壤微生物群落的關(guān)系，對土壤中的優(yōu)勢菌群(門水平)和土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)分析(表4)。結(jié)果表明：除變形菌門、放線菌門和酸桿菌門與所有理化指標(biāo)相關(guān)性均不顯著外，其他優(yōu)勢菌群都與土壤化學(xué)性質(zhì)存在顯著相關(guān)性。厚壁菌門與全氮、全磷、速效鉀和有效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)，與有機(jī)質(zhì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01)；綠彎菌門與全氮含量呈顯著正相關(guān)(<0.05)，與全磷、堿解氮和有效磷含量呈極顯著正相關(guān)(<0.01)；子囊菌門與堿解氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)，與全氮、全磷、速效鉀、有效磷含量及pH呈極顯著負(fù)相關(guān)(<0.01)；擔(dān)子菌門與全鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)(<0.05)，與全氮、速效鉀含量及pH呈極顯著正相關(guān)(<0.01)；除了全鉀含量，接合菌門與其他土壤理化因子均呈顯著正相關(guān)(<0.05)。

(圖中AN、AP、AK、TN、TP、TK、SOM分別表示土壤堿解氮、有效磷、速效鉀、全氮、全磷、全鉀、有機(jī)質(zhì))

3 討論

3.1 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征

表4 土壤優(yōu)勢菌群(門水平)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

注：*表示在<0.05水平上顯著相關(guān)，**表示在<0.01 水平上顯著相關(guān)。

土壤微生物群落是土壤生態(tài)功能的基礎(chǔ)，通過參與土壤有機(jī)質(zhì)分解和礦化等過程影響著土壤養(yǎng)分的循環(huán)并調(diào)節(jié)和指示土壤功能[14]。土壤中存在大量的微生物，其中細(xì)菌的種類和數(shù)量最多[15]，細(xì)菌在有機(jī)物質(zhì)的形成和分解、土壤營養(yǎng)元素的循環(huán)、肥力的保持和提高、植物的生長發(fā)育及病蟲害防治、生態(tài)環(huán)境的改善等方面均起著極其重要的作用[16]。測序結(jié)果表明變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門為草莓根際土壤細(xì)菌的優(yōu)勢菌種，其中變形菌門的相對豐度最高，為23.51% ~ 35.46%。目前已在擬南芥[17]、玉米[18]、枸杞[19]根際中發(fā)現(xiàn)變形細(xì)菌的富集分布，可見變形細(xì)菌能夠適應(yīng)多種植物根際微環(huán)境。酸桿菌門作為優(yōu)勢菌種的相對豐度為6.4% ~ 15.14%，與柳春林等[20]和Peralta等[21]研究結(jié)果一致。酸桿菌門能夠降解復(fù)雜的木質(zhì)素[22]和纖維素[23]從而為土壤提供養(yǎng)分，殘留的草莓植株經(jīng)過酸桿菌門的分解為土壤微生物提供了充足的能源[24]。通過對優(yōu)勢菌種的分析，溧水白馬、邳州港上、東海石榴、溧水傅家邊4個(gè)區(qū)域的酸桿菌門的相對豐度都低于對照，這說明草莓連作會影響酸桿菌門細(xì)菌的生長發(fā)育，從而影響土壤養(yǎng)分。

土壤真菌是土壤微生物的重要成員，并與其他微生物一起推動(dòng)著整個(gè)陸地生態(tài)系統(tǒng)的能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán)，維持著生態(tài)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)[25]，是生態(tài)系統(tǒng)中極其重要的組成部分。測序結(jié)果表明，從草莓根際土壤中鑒定得到的真菌主要來自5個(gè)門，包括子囊菌門、接合菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門和球囊菌門。其中，子囊菌門、接合菌門和擔(dān)子菌門為草莓根際土壤的優(yōu)勢菌種。子囊菌和擔(dān)子菌是土壤中重要的分解者[26]，子囊菌門大多數(shù)為腐生菌，可以分解很多難降解的有機(jī)質(zhì)，如木質(zhì)素和角質(zhì)素，在養(yǎng)分循環(huán)中擔(dān)任著重要角色[27]。測序結(jié)果還表明，鐮刀菌屬的相對豐度為0.13% ~ 1.85%，而鐮刀菌屬能夠侵染包括草莓的多種植物(糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、油料作物、藥用植物及觀賞植物)，致使植物發(fā)生萎焉、穗腐、根腐等各種類型的腐爛病，導(dǎo)致嚴(yán)重的減產(chǎn)，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[28]。

3.2 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性受多種因素的影響，外因包括氣候條件、植被類型、土壤類型和人類活動(dòng)等，另一些是內(nèi)因，主要是與土壤微生物生長密切相關(guān)的土壤有機(jī)質(zhì)組成以及土壤養(yǎng)分等[29]。土壤微生物群落多樣性分析(表2)表明，土壤細(xì)菌群落物種多樣性的變化在不同區(qū)域間以及與對照間差異都不顯著，而真菌群落物種多樣性在區(qū)域間以及與對照間存在差異，這說明土壤真菌群落多樣性比細(xì)菌群落多樣性更受植物及其耕作方式等的影響。土壤微生物群落與土壤理化因子的冗余分析(圖3)表明，土壤全氮對微生物群落的影響最顯著，這與Liu等[30]的研究結(jié)果是一致的。氮肥影響了土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)組成，隨著氮肥濃度的增加，富養(yǎng)性的分類群落變形菌門豐度增加[31]。其次，pH對微生物群落的影響最顯著。土壤pH是影響微生物群落結(jié)構(gòu)組成最重要的因素之一[32]。土壤其他理化因子對微生物群落結(jié)構(gòu)都有重要的影響，說明土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境關(guān)系密切。

植物種類對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)也有重要影響，相關(guān)研究表明植株根系分泌物對根際微生物群落結(jié)構(gòu)組成具有選擇塑造作用，不同植物的根際微生物群落結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特性和代表性[33]。草莓的根系分泌物中含有乳酸、琥珀酸、己二酸、苯甲酸和對羥基苯甲酸，其中苯甲酸對根重具有明顯的抑制作用，對草莓生長抑制作用最強(qiáng)[34]?；形镔|(zhì)可以單獨(dú)對草莓植株造成危害，也可與其他病原復(fù)合作用于草莓，同時(shí)能夠促進(jìn)連作土壤中病原菌菌絲生長、孢子萌發(fā)及侵染，加重連作草莓根部病害，最終導(dǎo)致了草莓連作病害的發(fā)生[35]。近年來越來越多的學(xué)者認(rèn)為，根系分泌物生態(tài)效應(yīng)的間接作用以及土壤微生物區(qū)系紊亂是導(dǎo)致植物連作障礙發(fā)生的主要因素[36]。這可能是由于在根系分泌物特定組分的介導(dǎo)下，某些類群的微生物(如土傳病原菌)大量繁殖，同時(shí)抑制其他有益微生物(如假單胞菌等拮抗菌)的生長，進(jìn)而改變了植物根系分泌物的組分和數(shù)量，為趨化性病原微生物提供更多的碳源和能源，形成惡性循環(huán)，最終造成植物生長發(fā)育不良[37]。

4 結(jié)論

1) 草莓根際土壤的優(yōu)勢細(xì)菌門為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、酸桿菌門和綠彎菌門，主要的優(yōu)勢細(xì)菌屬有16種；優(yōu)勢真菌門為子囊菌門、接合菌門和擔(dān)子菌門，主要的優(yōu)勢真菌屬有8種。

2) 微生物群落結(jié)構(gòu)受多種土壤環(huán)境因子的影響，本研究中土壤全氮和pH對微生物群落的影響最顯著。

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Microbial Community Structures and Diversities in Strawberry Rhizosphere Soils Based on High-throughput Sequencing

ZHAO Fan1,2, ZHAO Mizhen1*, WANG Yu2, GUAN Ling1, PANG Fuhua1

(1 Institute of Pomology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences & Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014, China; 2 College of Resources and Environment Engineering, Anhui University, Hefei 230601, China)

It is important for constructing and maintaining a healthy soil ecosystem to explore microbial community composition and structure in strawberry rhizosphere soil. Strawberry rhizosphere soils in different places were collected and used as study targets, the 16S rRNA genes of V4+V5 regions of soil bacteria and of ITS1+ITS2 regions of soil fungi were sequenced and analyzed by Illumina high-throughput sequencing technology on Miseq platform combined with related bioinformatics analysis to explore the changes of abundances, diversities and structures of soil bacteria and fungi. Results showed that a total of 4 554 bacterial operational taxonomic units (OTUs) and 1 298 fungal OTUs were obtained from 15 strawberry rhizosphere soil samples. At phylum level, dominant bacteria were Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Acidobacteria and Chloroflexi, dominant fungi were Ascomycota, Zygomycota and Basidiomycota. At genera level, there were 16 genera of dominant bacteria and 8 genera of dominant fungi. Redundancy analysis (RDA) showed that total nitrogen and pH had the greatest effect on soil microbial community structure, explaining 61% of the community changes. The order of contribution rate was total nitrogen > pH > available phosphorus > total potassium > total phosphorus > organic matter > available potassium > alkali-hydrolyzable nitrogen. Correlation analysis also showed that soil physiochemical characteristics were significantly correlated with different dominant microbial community. This study deepens the understanding on microbial community in strawberry rhizosphere and provides references for the relation between microbial composition and diversity with environmental factors.

Strawberry; Rhizosphere soil; Illumina high-throughput sequencing; Soil microbial community; Soil physiochemical characteristics

江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)示范類項(xiàng)目(BE2016369)和江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項(xiàng)目(SXGC[2017]261)資助。

通訊作者(njzhaomz@163.com)

趙帆(1993—)，男，江蘇南京人，碩士研究生，主要從事農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)研究。E-mail: 843003818@qq.com

S663.9

A

10.13758/j.cnki.tr.2019.01.008