重組蛋白PTD-HSP27進入細胞保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞抗氧化損傷

吳怡凝，陳夢婷，沙霄媛，劉 蓮，鐘敬祥

（1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，廣東廣州510630；2.廣東省婦幼保健院眼科，廣東廣州511400）

青光眼是全球第二位致盲性眼病，最主要的病理表現(xiàn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（retinal ganglion cells，RGC）的大量死亡和及其軸突的丟失。眼內(nèi)壓（intraocular pressure，IOP）升高是青光眼的主要危險因素，同時影響視功能的其他伴隨因素也起著重要作用，包括活性氧族（reactive oxygen species，ROS）引起的氧化損傷［1］、谷氨酸水平的增高［2］、一氧化氮代謝的改變［3］和特異基因突變［4］。所以，青光眼是一種復(fù)雜的多病因引起的慢性退行性疾病。在細胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時，熱休克蛋白27（heat shock protein 27，HSP27）的表達水平增高，并過多種途徑發(fā)揮其細胞保護作用，包括作為分子伴侶的作用，直接干擾Caspase激活，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)細胞骨架等［5］。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域（protein transduction domain，PTD）能夠穿透生物膜，介導(dǎo)各種分子跨膜進入細胞質(zhì)，并增高細胞內(nèi)水平，促進與靶點的相互作用，因此常被用于各種物質(zhì)（包括蛋白質(zhì)，多肽，核苷酸，siRNA，脂質(zhì)體等）向細胞和體內(nèi)模型的轉(zhuǎn)運［6-7］。本研究驗證帶有穿膜肽的重組蛋白PTD-HSP27能否有效通過RGC-5細胞膜進入細胞內(nèi)；應(yīng)用氯化鈷（cobalt chloride，CoCl2）構(gòu)建RGC氧化應(yīng)激損傷模型，明確帶有穿膜肽的重組蛋白PTD-HSP27在小鼠RGC-5細胞氧化應(yīng)激損傷中的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小鼠RGC-5細胞株（購于ATCC細胞庫）；重組蛋白PTD-HSP27（本課題組制備［8］）；熒光素蛋白標(biāo)記試劑盒（Herobio中國）；CoCl2（II）六水合物（Sigma美國）；RIPA裂解液（Beyotime中國）；CCK-8試劑盒（同仁日本）；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（凱基中國）；MMP檢測試劑盒（JC-1）（BD美國）；Caspase-3兔單克隆抗體、α-Turbulin兔單克隆抗體、Bcl-2兔單克隆抗體、Bax兔單克隆抗體（Cell Signaling Technology美國）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 RGC-5細胞的培養(yǎng) 小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞株RGC-5培養(yǎng)于100 mL/L胎牛血清和1%雙抗（青/鏈霉素）的DMEM/F12培養(yǎng)基，37℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 重組蛋白PTD-HSP27穿膜能力檢測 RGC-5細胞常規(guī)培養(yǎng)于六孔板中，當(dāng)融合度達六孔板底面積80%左右時，更換為含PTD-HSP27-FITC重組蛋白標(biāo)記液的無血清培養(yǎng)基孵育2 h，設(shè)立含F(xiàn)ITC熒光染料的陰性對照組；PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次10 min；40 g/L多聚甲醛溶液固定細胞30 min；PBS緩沖液沖洗細胞3次，每次10 min；倒置熒光顯微鏡下觀察，并攝像分析。

1.2.3 重組蛋白PTD-HSP27穿膜效率檢測 RGC-5細胞常規(guī)培養(yǎng)于六孔板中，當(dāng)融合度達六孔板底面積80%左右時，更換為含PTD-HSP27-FITC重組蛋白標(biāo)記液的培養(yǎng)基孵育2 h，孵育完成后培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗3次，吸干，加入RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min，收集細胞裂解液。以RIPA為空白對照，用分光光度計檢測細胞裂解液對495 nm的吸光度（A495nm）。按以下算式計算PTD-HSP27穿模效率：進入細胞的標(biāo)記蛋白量=A495nm/蛋白標(biāo)記效率；蛋白標(biāo)記效率（進入細胞的標(biāo)記蛋白量/每孔標(biāo)記蛋白總量）=3.053×A495nm/（A280nm-0.225×A495nm）。

1.2.4 CoCl2誘導(dǎo)RGC-5細胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立 用含不同濃度CoCl2的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)細胞，CoCl2終濃度分別為0、50、100、200、400和800 μmol/L；CCK-8檢測：RGC-5細胞經(jīng)各濃度CoCl2處理24 h后，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，然后用酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光度（A450nm）；IC50計算：按以下公式計算RGC-5細胞的存活率，SPSS 19.0軟件繪制成圖表，細胞存活率為50%時的濃度即為IC50；以CoCl2對RGC-5細胞干預(yù)24 h的IC50作為構(gòu)建CoCl2誘導(dǎo)RGC-5細胞氧化應(yīng)激損傷模型的作用濃度。細胞存活率（%）=［（As-Ab）/（Ac-Ab）］×100%［As：實驗孔（含有細胞的培養(yǎng)基、CoCl2）Ac：對照孔（含有細胞的培養(yǎng)基、不含CoCl2）Ab：空白孔（不含細胞和CoCl2的培養(yǎng)基）］。

1.2.5 PTD-HSP27在CoCl2誘導(dǎo)RGC-5細胞損傷中最佳干預(yù)濃度的篩選 用含PTD-HSP27的完全培養(yǎng)基常規(guī)條件培養(yǎng)細胞2 h，PTD-HSP27終濃度分別為0、0.125、0.25、0.5和1 μmol/L，每組設(shè)5個復(fù)孔；棄去原培養(yǎng)基，更換為含200 μmol/L CoCl2的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入10 μL的CCK-8，37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光度（A450nm）。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡種板 取對數(shù)生長期的RGC-5細胞，經(jīng)胰酶消化離心后用培養(yǎng)基重懸，顯微鏡下計數(shù)，以5×104/孔接種于6孔板，實驗分為3組：正常對照組、CoCl2損傷組、PTDHSP27+CoCl2處理組，培養(yǎng)過夜；干預(yù)：細胞過夜貼壁后，進行相關(guān)干預(yù)，CoCl2損傷組：加入200 μmol/L的CoCl2培養(yǎng)24 h；PTD-HSP27+CoCl2處理組：加入0.5 μmol/L的 PTD-HSP27培養(yǎng)2 h后，以200 μmol/L的CoCl2培養(yǎng)24 h；收集細胞：收集漂浮在培養(yǎng)基上的細胞，用胰酶消化并收集貼壁細胞，PBS洗滌細胞一次，600 ×g離心5min；染色：加入250 μL的Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC，5 μL Propidium Idodide，混勻，室溫下避光反應(yīng)15 min；流式細胞儀分析：用流式細胞儀檢測，通過FITC通道（FL1）檢測Annexin V-FITC的綠色熒光，F(xiàn)L3通道檢測PI的紅色熒光。

1.2.7 蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測蛋白表達 用蛋白裂解液裂解細胞，得裂解液后離心取上清，用BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品加入5×SDS-PAGE上清緩沖液混勻后沸水變性10 min，冷卻后-20℃保存。SDS-PAGE電泳：配膠-上樣-轉(zhuǎn)膜-封閉-一抗孵育-二抗孵育-洗膜-顯影（在膜上加入ECL發(fā)光液于暗室使用膠片曝光顯影，用掃描儀掃描膠片灰度）-定量分析（以α-Turbulin為內(nèi)參，用image J軟件定量分析目的蛋白條帶灰度值）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）或中位數(shù)P50（P25，P75）描述，對實驗數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，當(dāng)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布及方差齊性時，則多組計量資料的比較采用完全隨機設(shè)計多個樣本比較的秩和檢驗即Kruskal-WallisH檢驗，多重比較用Tamhane′s T2檢驗，P＜0.05時為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白PTD-HSP27的穿膜能力

FITC是常用的蛋白標(biāo)記熒光探針，可發(fā)出綠色可見光。用FITC對重組蛋白PTD-HSP27進行標(biāo)記后，用含PTD-HSP27-FITC的無血清培養(yǎng)基孵育RGC-5細胞2 h，熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)綠色熒光。結(jié)果顯示（圖1），陰性對照組（圖1A）中的細胞內(nèi)沒有顯著的熒光信號，而PTDHSP27-FITC組（圖1B）在細胞內(nèi)可見有明顯綠色熒光，表明重組蛋白PTD-HSP27能夠順利通過細胞膜進入細胞。

2.2 重組蛋白PTD-HSP27的穿膜效率

按照1.2.3的方法計算，得到重組蛋白PTDHSP27的標(biāo)記效率為（10.24±0.53）A495nm/mg；重組蛋白PTD-HSP27-FITC進入RGC-5細胞的效率為（47.29±2.33）%，證明 PTD-HSP27能有效穿過RGC-5細胞膜進入細胞內(nèi)。

2.3 構(gòu)建CoCl2誘導(dǎo)RGC-5細胞氧化應(yīng)激損傷模型

為模擬青光眼RGC的損傷，我們用低氧誘導(dǎo)劑CoCl2體外誘導(dǎo)RGC-5細胞缺氧，構(gòu)建RGC-5細胞氧化應(yīng)激損傷模型。不同濃度梯度（50、100、200、400、600、800 μmol/L）的 CoCl2體 外 干 預(yù)RGC-5細胞24 h后，CCK-8法檢測檢測細胞存活率。結(jié)果如圖2所示，CoCl2呈濃度依賴性的抑制RGC-5細胞存活率（P＜0.01），經(jīng)計算，其IC50為196.21 μmol/L，因此后續(xù)試驗以200 μmol/L的CoCl2干預(yù)RGC-5細胞24 h，作為構(gòu)建細胞損傷模型的最佳條件。

圖1 PTD-HSP27對RGC-5細胞的穿膜能力檢測Fig.1 Transmembrane ability detection of PTD-HSP27 on RGC-5 cells

圖2 CoCl2濃度依賴性的降低RGC-5細胞存活率Fig.2 Cobalt chloride concentration-dependent reduction of RGC-5 cell survival rate

2.4 PTD-HSP27對CoCl2誘導(dǎo)RGC-5細胞損傷的最佳作用濃度篩選

CCK-8法檢測細胞存活率，結(jié)果（圖3）顯示與陰性對照組相比，0.125 μmol/L的PTD-HSP27對細胞存活率并無影響，當(dāng)PTD-HSP27濃度為0.25 μmol/L時能提高細胞存活率（P＜0.05，圖3），0.5和1 μmol/L的PTD-HSP27能更顯著提高細胞存活率（P＜0.05，圖3），而0.5與1 μmol/L兩組間的細胞存活率沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，圖3）。因此，選取0.5 μmol/L為后續(xù)實驗的PTD-HSP27作用濃度。

圖3 PTD-HSP27對CoCl2所誘導(dǎo)RGC-5細胞損傷的保護作用Fig.3 Protective effect of PTD-HSP27 on RGC-5 cell injury induced by cobalt chloride

2.5 PTD-HSP27抑制CoCl2誘導(dǎo)的RGC-5細胞凋亡

通過Annexin V-FITC/PI染色后進行流式細胞儀檢測，結(jié)果（圖4）顯示，CoCl2處理后早期凋亡細胞比例為27.40%（24.00%，32.55%），比空白對照組0.83%（0.65%，1.06%）明顯增高，而經(jīng)PTDHSP27孵育2 h后再進行CoCl2處理，則可將早期細胞凋亡比例降至8.53%（8.41%，10.37%）。所以，PTD-HSP27能顯著抑制CoCl2引起的RGC-5細胞早期凋亡（P＜0.05，圖4）。如圖4C所示，與空白對照組1.64%（1.60%，1.84%）相比，CoCl2損傷24 h后能顯著提高晚期凋亡細胞比例14.25%（14.24%，17.13%），而經(jīng)PTD-HSP27預(yù)處理2 h，CoCl2損傷所致的晚期細胞凋亡比例為14.74%（14.55%，17.65%），并無明顯差異（P＞0.05，圖4）。當(dāng)綜合分析凋亡細胞時，CoCl2可誘導(dǎo)44.53%（38.24%，46.80%）的RGC-5細胞凋亡，而PTDHSP27預(yù)處理組為23.15%（23.08%，28.02%），所以PTD-HSP27可顯著抑制CoCl2所誘導(dǎo)的RGC-5細胞凋亡（P＜0.05，圖4）。

2.6 PTD-HSP27對CoCl2誘導(dǎo)RGC-5細胞損傷后凋亡相關(guān)蛋白水平的影響

圖4 PTD-HSP27抑制CoCl2所致RGC-5細胞凋亡Fig.4 PTD-HSP27 inhibits apoptosis of RGC-5 cells induced by cobalt chloride

Western blotting檢測PTD-HSP27預(yù)處理后，凋亡相關(guān)蛋白表達水平的變化。結(jié)果顯示（圖5），與空白對照組相比，CoCl2能抑制RGC-5細胞Bcl-2的的表達，并激活Bax的表達，進而顯著提高Bcl-2/Bax的表達比例。同時，CoCl2還能激活Caspase-3，從而引起細胞凋亡。而當(dāng)用PTDHSP27孵育細胞，能有效提高Bcl-2的表達，并抑制Bax，同時抑制Caspase-3的激活（P＜0.05，圖5）。所以，PTD-HSP27主要通過抑制Bcl-2/Bax的表達比例，抑制Caspase-3的激活，進而在CoCl2誘導(dǎo)的RGC-5細胞氧化應(yīng)激損傷中發(fā)揮細胞保護作用。

3 討論

青光眼是全球第二大不可逆性致盲眼病，其最重要的病理變化是RGC及其軸突的病理性丟失，從而引起視野進行性缺損［9］。在引起青光眼的危險因素中，病理性眼壓升高是其中最重要的因素之一，也是目前青光眼手術(shù)及藥物治療的主要靶點［10］。RGC對體內(nèi)和體外病理環(huán)境中的氧化應(yīng)激都非常敏感，所以氧化應(yīng)激損傷被認為是造成青光眼RGC損傷和凋亡的主要原因［11］。由于RGC及其神經(jīng)纖維的損傷和死亡是青光眼進展的最主要的病理表現(xiàn)，所以近些年有很多學(xué)者嘗試通過開發(fā)神經(jīng)保護劑來阻止視神經(jīng)節(jié)細胞的死亡，進而達到治療青光眼的目的［12］。

CoCl2是一種實驗中常用的缺氧誘導(dǎo)劑［13］。我們通過CoCl2誘導(dǎo)RGC-5細胞缺氧損傷，模擬青光眼中RGC的氧化應(yīng)激損傷。結(jié)果證明CoCl2能濃度依賴性的抑制RGC-5細胞的增殖活力，并計算出CoCl2對RGC-5干預(yù)24 h的IC50，用作后續(xù)實驗的處理條件。同時，CoCl2能顯著改變RGC-5細胞的形態(tài)，促進細胞皺縮，破碎和凋亡。CoCl2對RGC-5細胞的增殖抑制和促凋亡作用和之前的研究的結(jié)果相似［14］，證明以CoCl2誘導(dǎo) RGC-5細胞損傷，模擬青光眼中RGC損傷的細胞模型是可行的。

HSP27屬于小熱休克蛋白家族，當(dāng)細胞發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時，HSP27表達水平增高，并發(fā)揮其細胞保護作用［15］。Whitlock等［16］發(fā)現(xiàn)CoCl2干預(yù)RGC-5細胞后能通過激活HIF-1上調(diào)HSP27的表達水平，并且在大鼠的體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)，CoCl2干預(yù)后能上調(diào)HSP27而發(fā)揮對視網(wǎng)膜缺血損傷的保護作用。本課題組在前期研究中已證實外源性PTDHSP27可以保護人晶狀體上皮細胞抵抗凋亡［8］，為研究外源性PTD-HSP27能否穿透RGC-5細胞膜進入細胞內(nèi)并對CoCl2所致RGC-5細胞損傷有保護作用，我們用PTD-HSP27孵育RGC-5細胞后，用CoCl2損傷細胞24 h，最后檢測其細胞活性，結(jié)果顯示PTD-HSP27能有效進入RGC-5細胞并顯著抑制CoCl2所致RGC-5細胞損傷，發(fā)揮細胞保護作用。另外，流式細胞計數(shù)法檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，PTD-HSP27主要通過減少細胞早期凋亡，而發(fā)揮其抗凋亡作用。結(jié)果證明，外源性的PTDHSP27和內(nèi)源性的HSP27一樣，能有效保護細胞，抑制氧化應(yīng)激損傷。

圖5 PTD-HSP27對CoCl2誘導(dǎo)RGC-5細胞損傷的凋亡相關(guān)蛋白表達的影響Fig.5 Effect of PTD-HSP27 on the expression of apoptosis-related proteins in RGC-5 cells induced by cobalt chloride

Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，如Bcl-2和Bax，是調(diào)控線粒體依賴凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白。Bax可以通過調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放而改變線粒體膜通透性，引起MMP的下降及細胞色素C釋放，線粒體釋放的細胞色素C可激活Caspase-9，引起細胞凋亡，而Bcl-2可通過與Bax的競爭性結(jié)合而抑制其活性［17］。而Caspase-3是執(zhí)行細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，負責(zé)許多關(guān)鍵蛋白的水解。據(jù)文獻報道，HSP27能通過直接抑制Caspase的激活而抑制細胞凋亡［18］，或通過直接與細胞色素C作用而抑制Pro-Caspase-9的激活，進而抑制凋亡復(fù)合體的形成和功能［19］，并且與Pro-Caspase-3直接作用而抑制Caspase-3的活性［20］。Havasi等［21］的研究發(fā)現(xiàn)，HSP27能抑制Bax的活化，進而抑制Bax誘導(dǎo)的線粒體損傷和細胞凋亡。在我們的實驗中，PTD-HSP27能顯著改善CoCl2引起的Bcl-2/Bax比例的下降，并抑制Caspase-3的活性。所以，我們認為PTD-HSP27主要通過提高Bcl-2/Bax的表達比例，從而抑制Caspase-3的激活，發(fā)揮其細胞保護作用。

綜上所述，本研究以HSP27為切入點，研究證明外源性PTD-HSP27對氧化應(yīng)激損傷的RGC具有保護作用，為青光眼的視神經(jīng)保護治療提供新的方法和思路，為今后臨床的青光眼治療提供了新的可行性依據(jù)。但外源性PTD-HSP27能否成為青光眼診治療中的一種RGC保護劑，需要實現(xiàn)從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，仍需進一步研究。