Ⅰ型登革病毒感染前后血管內皮細胞長鏈非編碼RNA表達譜分析

鄭寶嘉，江振友，司露露，郭前方，江麗芳，周俊梅，王 輝

（1.暨南大學基礎醫(yī)學院微生物與免疫學系教研室，廣東 廣州 510632；2.中山大學熱帶病防治研究教育部重點實驗室//中山醫(yī)學院微生物學教研室，廣東 廣州 510080）

登革病毒（Dengue virus，DENV）是一種有包膜的單正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬，主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊等蚊媒傳播。根據其抗原性的不同，分為DENV-1，DENV-2，DENV-3和DENV-4四個血清型。過去的20年內，在東南亞、美國中南部和南非地區(qū)，登革感染的數量呈持續(xù)上升的趨勢。據WHO報道，全球每年大約有高達8 000萬人感染登革病毒，24 000人死于登革感染，超過100個國家的30億人處于登革病毒感染的危險之中［1］。2014年廣東省和2016年云南省均發(fā)生了登革熱的暴發(fā)流行，其主要流行型別為DENV-1［2-3］。登革病毒感染可引起登革熱（Dengue fever，DF），嚴重時還可出現(xiàn)登革出血熱/登革休克綜合征（Dengue hemorrhagic fever/Dengue shock syndrome，DHF/DSS），表現(xiàn)為高熱、廣泛性出血、彌散性血管內凝血等癥狀，其主要病理改變?yōu)檠芡ㄍ感栽黾铀鸬难獫{滲漏和出血［4］，是登革病毒感染致死性高的嚴重并發(fā)癥。DHF/DSS的發(fā)病機理一直是人們研究登革病毒的重要方向，但至今尚未完全闡明。人類基因中只有約2%基因能夠編碼蛋白，其余為轉錄調控元件和非編碼RNA。根據長度不同，非編碼RNA可分為小非編碼RNA（small non-codingRNA，sncRNA）和長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）。LncRNA是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，占非編碼RNA的80%［5］。LncRNA可通過調節(jié)染色質重塑、控制基因轉錄、參與mRNA轉錄后、調節(jié)蛋白質功能、參與細胞間的信號傳導等發(fā)揮重要調控作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染可引起宿主細胞內lncRNA的表達異常，從而改變宿主正常功能，調控細胞增殖分化、凋亡及信號傳導，最終促進病毒感染［7］。據報道，人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、冠狀病毒、單純皰疹病毒、EB病毒、人類巨細胞病毒感染后，宿主細胞內lncRNA表達異常，與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［8-13］。近年來的登革疫情以DENV-1為主，而血管內皮細胞是登革病毒的主要靶細胞［14］，其功能改變與受損將直接或間接導致DHF/DSS的發(fā)生。本研究擬通過分析DENV-1感染人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）后lncRNA的差異表達，探索導致血管內皮細胞功能改變或受損的可能分子機制，為揭示DHF/DSS發(fā)病機制提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人原代臍靜脈血管內皮細胞、ECM內皮細胞培養(yǎng)基、纖連蛋白和胰酶購自美國sciencell公司，加入配備好的生長因子、雙抗和20%胎牛血清培養(yǎng)。C6/36細胞和Ⅰ型登革病毒FS01/01 2014病毒株由本實驗室長期保種。間接細胞免疫熒光登革病毒特異性抗原抗體購自上海艾搏抗公司，血管內皮細胞vWF抗原抗體購自Life technology公司，羊抗鼠熒光二抗購自Thermo Fish公司。使用Trizol法提取細胞RNA。逆轉錄試劑盒和TB Green RT-qPCR試劑盒購自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 人臍靜脈血管內皮細胞的復蘇傳代及免疫熒光鑒定 液氮中取出細胞凍存管，于37℃溫水中快速融解，待融解完全則吸取轉移至裝有3～6倍培養(yǎng)基的離心管，2 000×g，10 min離心后棄上清，吸取新的培養(yǎng)基吹打混勻，分裝到孵育有纖連蛋白的細胞瓶，在37℃、體積分數5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔日換新的培養(yǎng)基。待細胞豐度達到90%，則進行傳代：棄去培養(yǎng)基，用杜氏磷酸緩沖液（Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline，DPBS）洗細胞兩次，加入1～2 mL含0.5 g/L胰酶（含EDTA）消化2～3 min，在顯微鏡下觀察待細胞變圓，則倒掉胰酶，加入培養(yǎng)基吹打后1：2分裝。免疫熒光鑒定血管內皮細胞vWF因子：將無菌圓玻片置于24孔板底部，以5×105/孔的細胞鋪板，24 h后用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate Buffered Saline，PBS）洗一次再用40 g/L多聚甲醛固定，用PBS洗3次，加0.5%Triton X-100室溫通透20 min后用5%牛血清白蛋白在37℃封閉。加入1∶200稀釋的vWF抗原抗體，4℃過夜，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline with Tween-20，PBST）洗 3次后加1∶500稀釋的羊抗鼠熒光二抗孵育45 min，PBST洗5次，每次3 min，最后在載玻片上滴加含DAPI的抗熒光猝滅劑，取出細胞爬片倒置于載玻片上進行染核和封片，置熒光顯微鏡下觀察拍片。

1.2.2 C6/36細胞的培養(yǎng)及Ⅰ型登革病毒的擴增用含80 mmol/L胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)C6/36，待細胞鋪滿細胞瓶底后1∶2或1∶3分裝，隔日感染病毒。擴增病毒：傳代24 h后可感染病毒，設置對照組和病毒組，對照組加2 mL的含20 mmol/L胎牛血清的細胞維持液，病毒組加100 μL的病毒原液和400 μL的維持液，放在37℃，體積分數5%CO2的培養(yǎng)箱吸附2 h后，棄感染上清，補充維持液，放回培養(yǎng)箱，每日觀察。待細胞病變達++～+++時，收取細胞懸液，儲存于-80℃冰箱，取100 μL做病毒TCID50的測定。

1.2.3 Ⅰ型登革病毒感染血管內皮細胞的鑒定及測序 將無菌圓玻片放入24孔板內，HUVEC以5×105/mL每孔鋪板，置37℃、體積分數5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后，加入已稀釋好的病毒原液感染細胞，吸附2 h后棄病毒上清液，加入維持液后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后做間接免疫熒光鑒定病毒感染。免疫熒光的步驟如上所述。實驗室采用不同MOI的病毒液感染細胞24、48、72 h后分別進行檢測，發(fā)現(xiàn)病毒載量與感染量和感染時間成正相關，當MOI=10時，24與48 h細胞內的病毒載量無顯著差異，同時考慮HUVEC繁殖較快，因此采用MOI=10的病毒劑量，感染HUVEC，24 h后送去深圳華大基因公司進行高通量測序。

1.2.4 lncRNA的表達差異分析、GO、KEGG和共表達網絡分析 取6個樣本，分別為對照組和實驗組，在華大基因lluminaHiSeq平臺進行測序，檢測出的轉錄本用CPC、txCdsPredict和CNCI軟件比對pfam蛋白數據庫，比對上則為mRNA，否則是lncRNA。然后使用RSEM計算基因和轉錄本的表達量。用差異分析軟件DEGseq進行組間差異分析（顯著差異基因的過濾條件：Fold Change≥2.00且FDR≤0.001）。為了更好地了解差異表達基因的功能，對組裝得到的新mRNA和已知的mRNA進行基因注釋。為了確定組間的顯著差異靶基因在哪些GO功能模塊和哪些通路上更為集中，進行GO和KEGG富集分析。因為目的于找尋致HUVEC功能改變或受損的關鍵靶基因和調控的lncRNAs，在GO的biological process中選取所有與細胞損傷和血管生成有關的條目中，對出示的靶基因和lncRNAs進行整合，以Pearson相關系數衡量lncRNA和mRNA之間的相關性，從而構建mRNA-lncRNA（Pearson≥0.8）共表達網絡分析圖。

1.2.5 RT-qPCR驗證測序結果 將HUVEC細胞懸液鋪六孔板，以Ⅰ型登革病毒FS01/01病毒MOI=10感染HUVEC，對照組和病毒感染組分別做三孔，24 h后進行RT-qPCR實驗。引物由上海捷瑞生物公司和廣州永慧公司設計和合成，內參為GAPDH?？俁NA提取采用Trizol-氯仿-異丙醇提取法。使用Takara的PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒進行逆轉錄，反應體系為：4 μL 5×PrimeScript RT Master Mix，2 μL RNA，補水至20 μL；反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 sec，4 ℃ forever；Takara的TB Green RT-qPCR反應體系為：12.5 μL TB Green Premix ExTɑpⅡ，1 μL PCR上游引物，1 μL PCR下游引物，2 μL cDNA模板量，補水至25 μL；反應條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，GOTO 39。

1.3 統(tǒng)計學處理

RT-qPCR實驗中每組3個樣本，每個單獨重復3次實驗，數據以表示，應用SPSS 20.0軟件進行數據分析，數據呈正態(tài)分布的進行兩獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布實行秩和檢驗。若P＜0.05，則認為兩組差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人臍靜脈血管內皮細胞的培養(yǎng)及鑒定

鏡下形態(tài)顯示（倒置顯微鏡，10×），HUVECs細胞呈飽滿的橢圓或梭形，致密排列鋪滿單層。間接免疫熒光結果顯示，細胞內vWF抗原呈陽性，綠色熒光火焰似的均勻分布在胞漿內，說明所培養(yǎng)的細胞是人臍靜脈血管內皮細胞（圖1）。

2.2 Ⅰ型登革病毒感染人臍靜脈血管內皮細胞

DENV-1感染HUVEC 24 h后做間接免疫熒光實驗（正置熒光顯微鏡，10×），結果顯示，與沒有感染病毒的HUVEC對照組對比，DENV-1特異性抗原的綠色熒光散在分布在胞漿，表明DENV-1能感染HUVEC（圖2）。

圖1 人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）的培養(yǎng)鑒定Fig.1 Identification of HUVEC

圖2 DENV-1感染HUVEC后24 h DENV-1特異性抗原的免疫熒光檢測Fig.2 Fluorescence staining detection of DENV-1-specific antigen in HUVEC infected with DENV-1 for 24 hours

2.3 lncRNA和mRNA組間差異表達分析

測序結果顯示，病毒組與對照組之間的lncRNA和mRNA的表達差異。運用DEGseq軟件分析，設置Fold Change≥2且FDR≤0.01為顯著差異基因的過濾條件，圖3中的X軸是對照組樣本基因的表達量對數，Y軸是病毒組樣本表達量對數，藍色代表下調的基因，橙色代表上調的基因，褐色是非顯著差異基因。圖3的A圖為差異表達的lncRNA，B圖為差異表達的mRNA。此次測序共篩選到2 623個顯著差異表達的lncRNA和5 335個顯著差異表達mRNA表達。其中，有1 441個lncRNA和2 746個mRNA表達上調，1 182個lncRNA和2 589個mRNA表達下調。列舉排名前10的lncRNA于表1。

圖3 組間顯著差異表達的lncRNA和mRNAFig.3 Significantly differentialexpressed lncRNA and mRNA between groups

表1 排名前10的上調或下調的顯著差異表達的已知lncRNATable 1 Top 10 up or down significant differentially expressed know_lncRNA

2.4 GO、KEGG富集分析

通過GO富集分析lncRNA調控的mRNA所在的生物學功能、途徑和細胞定位，以及KEGG富集分析所在的信號通路。結果顯示，GO富集分析（圖4A）中，差異表達的靶基因的功能更多與應激反應（ontology：biological process，GO：0050896），細胞內（ontology：cellular component，GO：0005622），抗原結合（ontology：molecular fuction，GO：0003823）等有關。KEGG富集分析（圖4B）發(fā)現(xiàn)，排名靠前的lncRNA調控的靶基因主要參與自身免疫反應、免疫排斥、抗原加工與提呈、細胞粘附、Ⅰ型糖尿病、病毒性心肌炎和單純皰疹感染等相關通路。

圖4 GO和KEGG富集分析Fig.4 GO and KEGG rich analysis

2.5 共表達網絡分析

在GO富集分析biological process部分中選取與細胞損傷和血管生成有關的所有條目中的靶基因和lncRNAs進行整合，構建mRNA-lncRNA（Pearson≥0.8）共表達網絡分析圖（圖5），目的是找出與細胞功能改變、細胞損傷和通透性改變相關的重要靶基因和lncRNA。紅色代表表達上調的靶基因lncRNA，綠色代表下調的靶基因和lncRNA，圓狀為靶基因，三角狀為lncRNA，形狀的大小變化表示lncRNA調控的靶基因表達倍數的大小，實線表示靶基因與lncRNA的表達成正相關，虛線為負相關。一個lncRNA可調控一個或多個靶基因，一個靶基因可由一個或多個lncRNA所調控，基于共表達網絡圖中，DENV-1感染HUVEC后，宿主細胞差異表達的lncRNA主要調控以下幾方面：抗原呈遞、限制病毒復制（MHCΙ、SP100、B2M）；干擾素產生（IRF7、HERC5、TREX1、Mx1）；細胞凋亡（IL15RA、XAF1、IFITM3、IFI6）；細胞粘附和血管通透性（IFITM3、BST2、VEGFA）。從測序結果中選3個lncRNA和1個mRNA進行RT-qPCR驗證測序，結果顯示lncRNA：NONHSAT207308（n=6，t=-0.937，P=0.001）、NONHSAT149597（n=6，t=-12.077，P＜0.001）表達下調；lncRNA：NONHSAT077292（n=6，t=3.703，P=0.021）及預測靶基因SP100（n=6，Z=-1.993，P=0.046）表達上調，差異有統(tǒng)計學意義，與測序結果相符（圖6）。

3 討論

長鏈非編碼RNA（lncRNA）長度大，大部分經剪切加工有poly A尾似mRNA的結構，但不具有完整的開放閱讀編碼框或者開放閱讀編碼框短于50～100 nt，編碼蛋白的可能性低［15］。最初被認為是基因組轉錄的“噪音”或RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，沒有生物學功能，而后研究發(fā)現(xiàn)lncRNA可參與覆蓋表觀遺傳調控、轉錄調控、轉錄后調控和蛋白翻譯調控等各個基因調控層面［16-18］。病毒感染方面，有限編碼能力的病毒通過調控宿主細胞內lncRNA的表達，可促進病毒感染［19］。

圖5 LncRNA-mRNA共表達網絡圖Fig.5 LncRNA-mRNA co-expression network plot

圖6 RT-qPCR驗證測序數據Fig.6 Verification of sequencing data by RT-qPCR

登革感染是世界性衛(wèi)生問題，感染輕者出現(xiàn)自限性的登革熱，重者則發(fā)展到登革出血熱/登革休克綜合征（Dengue hemorrhagic fever/Dengue shock syndrome，DHF/DSS），嚴重危及生命。至今，發(fā)現(xiàn)登革病毒感染致DHF/DSS的發(fā)病機制包括抗體依賴增強作用、免疫細胞激活和細胞因子產生、細胞凋亡和血小板破壞，初次登革感染后血清型交叉反應的T細胞殺傷作用等［20］，但還未完全闡明。血管內皮細胞是登革病毒的宿主細胞，感染會導致細胞功能改變及受損，直接或間接會導致DHF/DSS的發(fā)生。近年來，我國主要的流行病毒株為I型登革病毒，所以我們以血管內皮細胞為感染對象，意在發(fā)現(xiàn)DENV-1致DHF/DSS的潛在分子發(fā)病機制，為今后DHF/DSS的預防和控制提供思路。本研究分析發(fā)現(xiàn)I型登革病毒感染血管內皮細胞后，細胞內的lncRNA出現(xiàn)表達差異，可造成血管內皮細胞功能改變或損傷，與DHF/DSS發(fā)生發(fā)展有直接或間接的影響。

通過高通量測序，以設置Fold Change≥2且FDR≤0.01為顯著差異基因的過濾條件，篩選出的有2 623個lncRNA和5 335個mRNA表達顯著差異，其中上調的lncRNA和mRNA分別有1 141個和2 746個，下調的lncRNA和mRNA依次有1 182個和2 589個，其中包含371個此次測序出的新的lncRNA，說明I型登革病毒感染血管內皮細胞，可致細胞內lncRNA和mRNA表達差異，且有新的lncRNA轉錄產生。GO和KEGG是目前基因分類最為完善的兩個數據庫，為了確定組間的顯著差異靶基因在哪些GO功能模塊和哪些通路上更為集中，進行了GO和KEGG富集分析。GO分析中，顯著差異的靶基因富集在應激反應、對化學物質刺激或壓力反應，信號轉導等生物過程，提示DENV-1感染HUVEC后，這些顯著差異的靶基因能促進分子與分子之間結合（分子與受體），活化下游分子，傳導信號，激活一系列以抵抗病毒感染的應激反應或誘導細胞功能變化的信號通路。例如，在GO的分子功能板塊，顯著差異表達的lncRNA富集于參與抗原結合、蛋白結合和血小板源生長因子受體結合功能；而在生物過程板塊，差異表達的lncRNA更趨向于影響I型干擾素的形成、調控介導細胞因子活化的通路和抗原呈遞過程。在KEGG富集分析中，排名靠前的顯著差異的靶基因主要富集于自身免疫反應、免疫排斥、抗原加工與提呈、Ⅰ型糖尿病、病毒性心肌炎、單純皰疹感染相關通路上。自身免疫反應與免疫排斥反應是機體自身抗原發(fā)生的免疫反應，均有可能造成自身細胞或組織的免疫病理損傷。

因為我們較為關注哪些差異靶基因可能影響血管內皮細胞功能改變或損傷從而導致血管通透性增加，所以在GO富集結果中選取相關生物過程條目構建lncRNA-mRNA共表達網絡圖。發(fā)現(xiàn)導致血管內皮細胞損傷的主要關鍵靶基因可能位于抗原加工呈遞、細胞凋亡、Ⅰ和Ⅱ干擾素信號通路、細胞粘附等生物過程中。測序結果顯示lncRNA調控的IRF7、IFI6等基因高表達能促進Ⅰ型、Ⅱ型干擾素的產生，在一定程度上能干擾病毒復制，保護宿主；但另一方面，其可釋放促炎癥因子，例如IFN-γ、TNF-α、IL-1等，可介導血管內皮細胞發(fā)生滲漏。在抗原加工與提呈反應中，lncRNAs調控MHC-Ι的加速抗原加工和呈遞，供CD4+T細胞的TCR識別，活化效應性T細胞，可直接殺傷靶細胞導致血管內皮細胞損傷死亡；另外，BST2、CAMs等關于細胞粘附的靶基因也表達差異，細胞粘附作用增強，可誘導驅使白細胞和血小板粘附聚集，激活的免疫細胞聚集后又可釋放多種炎癥介質，引起局部炎癥反應，誘發(fā)內皮細胞功能改變和損傷［21］。

讓我們更為注意的是，發(fā)現(xiàn)差異表達的lncRNA參與調控多個與凋亡有關的基因或信號通路。在表達倍數前10的lncRNA中，發(fā)現(xiàn)下調倍數高的NONHSAT088940.2（表4）調控靶基因NM_001256192和NM_001162429表達上調，通過NCBI注釋為程序性死亡6相互作用蛋白（Programmed cell death 6 interacting protein ，PDCD6IP），共表達網絡中也出現(xiàn)與凋亡相關的靶基因如IL-15RA、XAFA、IFITM3、IFI6等高表達，此外p38MAPK信號通路、P13K-AKT信號通路、JAK-STAT信號通路的激活，一方面可分泌大量的炎性因子，可趨化招募其他免疫細胞聚集后殺傷靶細胞；一方面又可誘導細胞凋亡，其都會導致細胞功能改變、受損和死亡，細胞通透性增加，可發(fā)展為血漿滲漏、出血，影響DHF/DSS的發(fā)生發(fā)展。

KEGG分析出差異表達的靶基因也富集于內吞作用和吞噬體的形成，有文獻報道Ⅱ、Ⅲ型登革病毒進入血管內皮細胞（ECV304）與網絡蛋白介導的內吞途徑有關［22-23］，細胞質膜的內吞作用形成小泡（caveolae），可穿透細胞送出某些大分子物質，其過程也可引起細胞通透性的改變［24］，由此可見lncRNAs調控介導Ⅰ型登革病毒利用內吞方式來完成對血管內皮細胞的入侵、脫殼和復制增殖，且一定程度導致細胞通透性發(fā)生變化。有趣的是，測序后發(fā)現(xiàn)有些靶基因富集于病毒致癌性的通路（ko：05203）上，類似EB、HBV、HPV感染會有致癌的可能，但是登革病毒感染是否具有致癌作用，需進一步實驗研究。

總之，Ⅰ型登革病毒感染血管內皮細胞后，細胞內lncRNAs表達差異，其調控作用可介導調控細胞凋亡和其他間接因素，例如細胞粘附、細胞因子和炎性因子的分泌，干擾素和其他信號通路的激活，誘導血管內皮細胞功能改變或受損死亡，細胞通透性增加及發(fā)生滲漏，與DHF/DSS有著密切的聯(lián)系。