吡非尼酮藥物緩釋載體PTMAc-PEG-PTMAc水凝膠制備與體外實(shí)驗(yàn)

彭 蔚，楊揚(yáng)帆，林羨釵，王 濤，全大萍，吳開力，余敏斌

（中山大學(xué)1.中山眼科中心青光眼科，廣東廣州510060；2.化學(xué)學(xué)院，廣東廣州510275）

吡非尼酮（pirfenidone，PFD）是一種新型廣譜的抗炎抗纖維化的小分子化合物藥物，目前其口服制劑已經(jīng)在歐美、日本和印度上市，用于特發(fā)性肺纖維化、肝纖維化、腎纖維化等全身纖維化疾病的治療［1-3］。本課題組首次將PFD應(yīng)用于青光眼術(shù)后濾過道瘢痕化的防治研究。體外研究結(jié)果首先從形態(tài)學(xué)上證實(shí)了PFD抑制人Tenon′s囊成纖維細(xì)胞（human Tenon′s capsule fibroblasts，HTF）增殖的作用；而體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（兔眼），建立了青光眼濾過手術(shù)動(dòng)物模型，證實(shí)當(dāng)PFD滴眼液的濃度為0.5%時(shí)具有抑制濾過區(qū)瘢痕化的效果，同時(shí)，眼部毒性最小。這些前期研究結(jié)果提示PFD在眼科增殖性病變的防治將具有重大的應(yīng)用前景［4-5］。PFD滴眼液眼內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果顯示，PFD眼內(nèi)半衰期短，代謝快［6］。因此，改變PFD劑型以延長(zhǎng)其在眼內(nèi)停留時(shí)間，增加其生物利用度是目前亟需解決的問題。理想的藥物緩釋載體首先應(yīng)在靶組織維持有效藥物濃度，達(dá)到治療疾病的目的，其次要求載藥的材料具有良好的生物相容性和可降解性并且沒有毒副作用［7-9］。這是一門交叉學(xué)科，需要了解藥物本身和緩釋材料及相關(guān)給藥方式。吡非尼酮水溶性強(qiáng)，而水凝膠制劑最大的優(yōu)勢(shì)就是適合親水性的藥物。在現(xiàn)有的生物材料中，以PEG為單體的水凝膠具有生物相容性、非免疫原性和形態(tài)可控特性［10］。故本文選取PTMAc-PEG-PTMAc化學(xué)膠聯(lián)型三嵌段（PPP）水凝膠作為藥物緩釋載體，對(duì)其理化性質(zhì)、載藥性能以及水凝膠緩釋系統(tǒng)的體外釋藥和組織相容性等進(jìn)行了評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 試劑及設(shè)備

吡非尼酮（貨號(hào)：P2116-50mg），對(duì)氨基苯甲酸乙酯（貨號(hào)：112909-5g）二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma-Aldrich，USA.Cell Counting Kit-8（CCK-8）購自日本同仁公司。二硫蘇糖醇（DTT）購自Amersham公司。DMEM/F12培養(yǎng)基，小牛血清（FBS）購自Gibco公司。PBS緩沖溶液，分子生物學(xué)純凈水，2.5 g/L胰蛋白酶（含0.02%EDTA）均購自吉諾生物公司。甲醇（色譜純）乙腈（色譜純）購自Burdick&Jackson，USA。Elivision plus免疫組化試劑盒，液體DAB酶底物顯色試劑盒購自福州邁新生物公司。PPP高分子聚合物粉末由中山大學(xué)化工學(xué)院高分子實(shí)驗(yàn)室合成。無水乙醇，冰醋酸，甲醛溶液購自天津市大茂化學(xué)試劑廠，均為分析純。

瑞士Mettler公司AL204電子天平；AnKe TGL-16B離心機(jī)產(chǎn)自上海安亭科學(xué)儀器廠；離心濃縮儀RVC2-18產(chǎn)自CHRIST公司；Millipore公司的Milli-Q超純水系統(tǒng)；日本島津公司UV-1601型分光光度計(jì)；超凈工作臺(tái)，電熱式恒溫箱均購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。美國(guó)Sheldon公司CO2培養(yǎng)箱；電熱恒溫水浴箱產(chǎn)自上海一恒科技有限公司；KS-150型超聲波粉碎機(jī)產(chǎn)自寧波科生儀器廠；北京六一儀器廠調(diào)速多用震蕩器。掃描電鏡JSM-6380LA型產(chǎn)自日本株式會(huì)社。Topon公司倒置生物顯微鏡。佳能數(shù)碼照相機(jī)。各種型號(hào)細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，離心管，凍存管以及細(xì)胞計(jì)數(shù)板均購自Corning公司。0.22 μm微孔濾器購自Millipore公司。磁力攪拌器購自IKA公司。

1.2 化學(xué)交聯(lián)法制備PPP水凝膠

以聚乙二醇（PEG）為引發(fā)劑，1，8-二氮雜雙環(huán)［5.4.0］十一碳-7-烯（DBU）為催化劑，室溫下引發(fā)三亞甲基環(huán)碳酸酯（TMC）與1，3二亞甲基碳酸酯單體（Ac）開環(huán)共聚，制備了含側(cè)雙鍵的兩親性三嵌段聚醚酯PTAE粉末（嵌段比例 PEG∶Ac∶TMC 約1∶5∶11.8，分子質(zhì)量約為 22 ku）［10］。精密稱取40 mg PTAE粉末，放置于2 mL Eppendorf管中，精密量取460 μL 0.1 mol/L PBS緩沖溶液混勻，將其放置于37℃恒溫箱約30 min后，白色粉末溶解均勻成均質(zhì)透明流動(dòng)黏稠溶液狀態(tài)；配制40 μL 20%二巰基乙醇（DTT）溶液。所有溶液均經(jīng)過過濾消毒。取6.25 μL上述DTT溶液加入1 mL 5%PPP溶液中，mPTAE∶mDTT=40∶1.25。37 ℃環(huán)境下靜置約30 min。采用倒管法［11］觀察已經(jīng)呈現(xiàn)凝膠狀態(tài)。水凝膠體積分?jǐn)?shù)可配置5%～8%。

1.3 PPP水凝膠溶脹實(shí)驗(yàn)

配制5%、6%、7%和8%的PPP水凝膠各500 μL，方法同上。冷凍干燥后稱重將其放置于裝有10 mL 0.1 mol/L PBS緩沖溶液（pH 7.4，37℃）的離心管中。每天固定時(shí)間點(diǎn)取出水凝膠，在濾紙上吸干多余水分后稱重。重復(fù)至第14天直至水凝膠重量不再增加。重復(fù)3次，取平均值。溶脹率計(jì)算公式如下：Q=（mS-mD）/mD（Q代表溶脹率，mS代表溶脹狀態(tài)水凝膠的質(zhì)量，mD代表凍干狀態(tài)水凝膠的質(zhì)量）。

1.4 水凝膠體外藥物釋放試驗(yàn)

用1 mg/mL上述藥物溶液配制5%、6%、7%和8%的PPP水凝膠溶液各500 μL，用2 mg/mL藥物溶液配制5%的PPP水凝膠溶液250 μL、500 μL各一管，待其成水凝膠狀態(tài)后，放入500 μL溫浴37℃PBS緩沖溶液（pH=7.4）作為釋放介質(zhì)，將所有Eppendorf管放置于37℃恒溫?fù)u床箱中（轉(zhuǎn)速：100 r/min，r=5 cm）；在12 h、1 d、2 d、……14 d這15個(gè)時(shí)間點(diǎn)將釋放介質(zhì)全部取出更換新的PBS緩沖溶液；每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出的釋放介質(zhì)稀釋5倍，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)為312 nm的吸光度值，從而計(jì)算藥物濃度。依次計(jì)算出每次釋放的藥量及累積釋放藥量所占總藥量的百分比。繪制藥物累積釋放曲線；所有釋放實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 人眼Tenon′s囊成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)與免疫組化鑒定

人眼Tenon′s囊組織取材自接受斜視手術(shù)的患者，平均年齡為15歲。每位患者及家屬均簽署知情同意書。剪取球結(jié)膜下患者Tenon囊組織約5 mm×5 mm。用顯微剪將組織剪碎至約1 mm×1 mm左右的小塊并均勻，種植于25 cm2培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶倒置放入CO2培養(yǎng)箱中。24 h后，將培養(yǎng)瓶正置向瓶底注入適量DMEM/F12培養(yǎng)基（內(nèi)含10%FBS及青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL）。10%FBS的培養(yǎng)液，隔日倒置顯微鏡觀察，原代接種后第2～3天換液1次。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合后1∶2或1∶3傳代。經(jīng)過免疫組化細(xì)胞為成纖維細(xì)胞而非上皮細(xì)胞。取3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 觀察PPP水凝膠中細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)

用5 mg/mL的吡非尼酮溶液配制5%PPP載藥水凝膠方法同前。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人眼Tenon′s囊成纖維細(xì)胞（HTF）來評(píng)價(jià)水凝膠的體外細(xì)胞毒性。在2塊12孔板里各選三孔預(yù)先放置好相應(yīng)載藥和空載的PPP水凝膠20 μL，其中載藥水凝膠含藥量為95 μg。待其成膠后，呈現(xiàn)一圓形邊界，部分遮蓋12孔板底部。將消化下來的HTF細(xì)胞，將計(jì)數(shù)每孔約106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液滴于水凝膠的上面和旁邊；另選兩孔細(xì)胞鋪板后24 h HTF細(xì)胞貼壁后再放入20 μL前述PPP水凝膠（空載和載藥）。將其放置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 h。每48 h換一次培養(yǎng)基。每天固定時(shí)間點(diǎn)放于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況。

1.7 細(xì)胞活力與細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)（CCK-8檢測(cè)試劑盒）

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期眼HTF細(xì)胞，取96孔板4塊板編號(hào)A、B、C、D。向各孔中加入100 μL細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)每孔104個(gè)細(xì)胞，在37℃下CO2培養(yǎng)箱中過夜預(yù)培養(yǎng)24 h，血清饑餓24 h，使其各孔細(xì)胞生長(zhǎng)速度平衡。每塊細(xì)胞培養(yǎng)板分6組，每組4個(gè)復(fù)孔。分別為空白組：培養(yǎng)基；對(duì)照組：培養(yǎng)基+細(xì)胞；試驗(yàn)組（GEL 組：21 μL空載水凝膠+培養(yǎng)基+細(xì)胞；100 μg PFD組：100 μg PFD+培養(yǎng)基+細(xì)胞；100 μg PFD+GEL組：21 μL載藥100 μg PFD水凝膠+培養(yǎng)基+細(xì)胞；200 μg PFD+GEL組：21 μL載藥200 μg PFD水凝膠+培養(yǎng)基+細(xì)胞）。A、B、C、D 4塊板分別在4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)（24、48、72、96 h），更換培養(yǎng)基，加入 110 μL（含培養(yǎng)基 100 μL 和10 μL CCK-8溶液）；C、D兩塊板在48 h更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；再次將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱孵育大約30～60 min，酶標(biāo)儀測(cè)定450和600 nm的吸光度（A值）。各孔A值取其差值。取4個(gè)復(fù)孔平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。對(duì)照組與其余5組的比較，1 mg/mL藥物溶液組（含藥量100 μg）與其余各載藥水凝膠組（載藥量分別為100、200 μg）比較。細(xì)胞活力=（A試驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%，試驗(yàn)組為空載水凝膠。細(xì)胞增殖抑制率=（A試驗(yàn)組-A空白組）/（A對(duì)照組-A空白組）×100%，試驗(yàn)組為載藥水凝膠組和藥物溶液組。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。計(jì)量資料多樣本均數(shù)經(jīng)Levene方差齊性檢驗(yàn)，組間均數(shù)比較采用方差分析（ANOVA）。不同濃度載藥水凝膠和藥物溶液比較采用LSD（Least Significant Difference）法多重兩兩比較分析。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPP水凝膠成膠實(shí)驗(yàn)

將PTAE配制成相應(yīng)濃度（5%～10%）的溶液。500 μL PTAE水溶液分別放置于2個(gè)Eppendorf管中，1號(hào)管加入相應(yīng)量的交聯(lián)劑DTT，2號(hào)管未加交聯(lián)劑，37℃環(huán)境下靜置約30 min，1管已成凝膠狀態(tài)，2管仍然呈水溶液狀態(tài)。PPP水凝膠成膠條件穩(wěn)定（圖1）。

2.2 PPP水凝膠掃面電鏡結(jié)果

掃描電鏡下，水凝膠呈現(xiàn)三維立體網(wǎng)孔狀構(gòu)型，圖A～D分別代表5%～8%濃度的PPP水凝膠。5%水凝膠網(wǎng)孔直徑較大（箭頭所示），約100～200 μm。隨水凝膠材料濃度增加網(wǎng)孔孔徑大小逐漸減小，8%水凝膠網(wǎng)孔直徑約為30～50 μm（圖2）。

圖1 PPP成膠過程圖Fig.1 Sol-gel transition of the PPP

2.3 PPP水凝膠溶脹實(shí)驗(yàn)

水凝膠在1%PBS溶液中有溶脹特性，隨時(shí)間延長(zhǎng)，水凝膠質(zhì)量增加，體積增大（圖3）。5%、6%、7%、8%四個(gè)濃度水凝膠溶脹率分別為39、37、33和29。溶脹率隨凝膠濃度的增大，而逐漸降低。

2.4 PPP載藥水凝膠體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)

載藥量相同，繪制5%、6%、7%、8%4個(gè)濃度水凝膠藥物釋放曲線（圖4）。從圖中不難看出，載藥水凝膠體外藥物釋放均經(jīng)歷了兩個(gè)階段，第一階段（前4 d）藥物突釋階段，第一階段（第5～14天）藥物緩慢釋放，逐漸達(dá)到平衡。4個(gè)濃度水凝膠，5%濃度藥物釋放比例更高釋放更加充分。而改變載藥濃度或載藥水凝膠體積，繪制5%載藥水凝膠藥物釋放曲線?？梢娫黾虞d藥量和減少載藥水凝膠的體積，累積藥物釋放百分比增加，藥物釋放將更充分（圖5）。

2.5 人眼Tenon′s囊成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)與免疫鑒定

組織塊法原代培養(yǎng)人眼Tenon′s囊成纖維細(xì)胞，取3～6代傳代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過免疫組化鑒定HTF角蛋白染色陰性，波形蛋白染色陽性，符合成纖維細(xì)胞（圖6）。

圖2 四個(gè)濃度PPP水凝膠掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of cross-linking PPP hydrogels with various concentrations

圖3 PPP水凝膠溶脹實(shí)驗(yàn)Fig.3 The swelling behavior of PPP triblock copolymer hydrogels

圖4 不同濃度PPP水凝膠的體外釋放曲線圖Fig.4 In vitro release curves of PPP hydrogels in different concentrations as a function with time

圖5 不同載藥濃度不同水凝膠體積PPP水凝膠體外釋放曲線圖Fig.5 In vitro release curves of PPP hydrogels with different drug loaded concentrations and different volume of hydrogels

2.6 PPP水凝膠對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

將傳代成纖維細(xì)胞懸液加入含有水凝膠（空載和載藥）的培養(yǎng)皿，觀察水凝膠周圍細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，水凝膠和細(xì)胞之間有明顯分界線。水凝膠區(qū)域沒有細(xì)胞生長(zhǎng)。水凝膠周圍生長(zhǎng)形態(tài)正常。隨著觀察時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)密集，數(shù)量增多。至第9天，邊界上的細(xì)胞突破邊界進(jìn)入水凝膠區(qū)域生長(zhǎng)。左邊空載水凝膠（A1～A5）細(xì)胞較右側(cè)載藥水凝膠（B1～B5）生長(zhǎng)密集（圖7）。而在水凝膠上方及下方的細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮狀態(tài)，48 h后細(xì)胞逐漸展開。與水凝膠周圍的細(xì)胞相比，上方和下方的細(xì)胞生長(zhǎng)稀疏緩慢（圖8）。

圖6 人眼Tenon′s囊成纖維細(xì)胞的免疫組化鑒定Fig.6 Immunohistochemical identification of human Tenon′s cystic fibroblasts

圖7 PPP水凝膠中細(xì)胞隨時(shí)間生長(zhǎng)形態(tài)變化Fig.7 The morphology of HTF contact with PPP hydrogel as function with time

2.7 PPP水凝膠CCK-8細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

空載水凝膠中培養(yǎng)的HTF細(xì)胞活力在24、48、72、96 h這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別為85.7%、93.0%、82.0%、81.6%（圖9）。兩組不同載藥濃度（1 mg/mL和2 mg/mL）載藥水凝膠在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率分別為25.8%、21.8%、55.4%、25.6%以及44.6%、35.9%、55.5%、31.4%。而1 mg/mL PFD溶液在這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖抑制率分別為28.9%、29.7%、7.8%、7.7%。24與48 h時(shí)間點(diǎn)，藥物溶液組細(xì)胞增殖抑制較同等藥量的載藥1 mg/mL PFD載藥水凝膠強(qiáng)，較2 mg/mL PFD載藥水凝膠弱。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，72與96 h時(shí)間點(diǎn)，載藥水凝膠組細(xì)胞增制率明顯超越藥物溶液組?？梢娸d藥水凝膠的細(xì)胞增殖抑制率存在時(shí)間依賴性和劑量依賴性（圖10）。

3 討論

眼用水凝膠劑型分為生物黏附型凝膠和原位凝膠［11-14］，其中生物黏附型水凝膠是一類具有黏附性的高分子材料，一般含有大量親水基團(tuán)，能增加藥物制劑的黏度，易與淚液混合，從而延長(zhǎng)藥物滯留時(shí)間，提高生物利用度。本文選取兩親性的PPP化學(xué)交聯(lián)三嵌段水凝膠作為吡非尼酮的藥物緩釋系統(tǒng)。它能最大程度解決吡非尼酮的載藥問題。PPP水凝膠需要DTT作為交聯(lián)劑通過大約30 min化學(xué)交聯(lián)形成的水凝膠，常溫下呈現(xiàn)透明均質(zhì)凝膠狀態(tài)，具有很好的賦形性。經(jīng)過反復(fù)摸索，低于5%水凝膠成膠時(shí)間明顯延長(zhǎng)甚至不能成膠，高于8%凝膠成型不規(guī)則并且不均勻。故取5%～8%的濃度，水凝膠賦形性比較穩(wěn)定。

凍干狀態(tài)用掃描電鏡觀察其截面的構(gòu)型，可見PPP水凝膠呈現(xiàn)三維立體網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，隨水凝膠濃度逐漸高。高分子材料交聯(lián)更緊密，網(wǎng)孔內(nèi)徑逐漸變小。水凝膠網(wǎng)孔狀三維立體構(gòu)型可以保留大量水分。PPP水凝膠體外溶脹實(shí)驗(yàn)顯示由于poloxamer和PEG的親水性基團(tuán)水合作用其在PBS溶液中會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷吸收水分，體積和質(zhì)量會(huì)逐漸增大，最終達(dá)到平衡狀態(tài)，隨著水凝膠材料濃度增大，溶脹率逐漸降低，吸收水分能力也逐漸下降。水凝膠的立體網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)和溶脹特性是其藥物緩釋重要機(jī)制［12］。

本實(shí)驗(yàn)用直接接觸法（非透析膜法）［15］對(duì)不同藥物濃度、不同高分子水凝膠材料濃度（水凝膠濃度）以及不同水凝膠體積的兩種水凝膠進(jìn)行體外藥物釋放試驗(yàn)，測(cè)試時(shí)間均為14 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水凝膠材料濃度越大，固定時(shí)間段藥物累積釋放比例越低；同時(shí)減少一半水凝膠體積，在相同體積釋放介質(zhì)中藥物累積釋放比例將明顯增加；而將載藥濃度增加一倍，相同體積釋放介質(zhì)下藥物累積釋放比例將減小，但由于藥物濃度增加了一倍，藥物累積釋放量仍然較大。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，凝膠材料濃度是影響載藥水凝膠的藥物釋放一個(gè)重要影響因素。水凝膠濃度越高，水凝膠結(jié)構(gòu)越緊密，網(wǎng)孔越小，釋放藥物就越緩慢。載藥濃度是另一個(gè)重要影響因素，載藥濃度越高，固定時(shí)間段內(nèi)藥物累積釋放比例越低。第3個(gè)影響因素就是水凝膠體積，水凝膠體積越少，釋放介質(zhì)容積相對(duì)增大，固定時(shí)間內(nèi)藥物累積釋放的比例就越高。從PPP載藥水凝膠體外釋放曲線來看，藥物的體外釋放經(jīng)過兩個(gè)階段，第一階段，時(shí)長(zhǎng)約4 d，經(jīng)歷了一段藥物突釋，繼之第二階段便是藥物緩慢釋放。研究者推測(cè)水凝膠釋放存在兩種釋放機(jī)制，其一是藥物擴(kuò)散，其二則是水凝膠溶脹降解。突釋效應(yīng)是水凝膠材料作為藥物緩釋載體的顯著特點(diǎn)［16-17］。本文細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所用載藥水凝膠均取5%的凝膠濃度，是因?yàn)橥渌z濃度比較，5%載藥水凝膠藥物累積釋放比例相對(duì)較高，藥物累積釋放充分。

圖8 不同方位PPP水凝膠細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.8 The growth state of HTF incubated with PPP hydrogelin different orientations

圖9 PPP水凝膠中細(xì)胞活力Fig.9 The in vitro cell viability of HTFsincubated with PPP hydrogel

圖10 載藥PPP水凝膠細(xì)胞增殖抑制率Fig.10 The inhibition rate of cell proliferation in drug loaded PPP hydrogel

選取5%PPP載藥水凝膠的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)［18］，通過觀察水凝膠（包括空載水凝膠和載藥水凝膠）對(duì)HTF生長(zhǎng)狀態(tài)的影響結(jié)果顯示，PPP水凝膠周圍細(xì)胞呈現(xiàn)正常形態(tài)，同時(shí)，水凝膠具有明顯抑制細(xì)胞黏附的作用，而抑制細(xì)胞黏附正是青光眼術(shù)后局部抗疤痕化難得的特性［13］。

另外，我們還觀察到，空載水凝膠邊界細(xì)胞生長(zhǎng)較載藥水凝膠細(xì)胞數(shù)量更多，細(xì)胞生長(zhǎng)密集。這從另一個(gè)方面說明載藥水凝膠的釋藥性能以及吡非尼酮能抑制HTF增殖作用。為了進(jìn)一步了解水凝膠材料對(duì)細(xì)胞活力的影響以及載藥水凝膠細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)，本研究又進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)。PPP水凝膠中培養(yǎng)的HTFs細(xì)胞活力在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均達(dá)80%以上，可能與其引起抑制細(xì)胞黏附、影響細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖有關(guān)。而從載藥水凝膠對(duì)HTF的增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，與對(duì)照組比較，吡非尼酮藥物溶液組、載藥水凝膠組均顯示明顯細(xì)胞增殖抑制。24與48 h時(shí)間點(diǎn)，吡非尼酮藥物溶液組細(xì)胞增殖抑制率較同等藥量載藥水凝膠組高，較雙倍藥量載藥水凝膠增殖抑制率更低，但隨著時(shí)間延長(zhǎng)，經(jīng)過48 h更換培養(yǎng)液后，72與96 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)載藥水凝膠組細(xì)胞增殖抑制率明顯較吡非尼酮藥物溶液組更高。這提示：其一，載藥水凝膠細(xì)胞增殖抑制呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性，即隨時(shí)間延長(zhǎng)劑量增加，抑制率得以提高；其二，48 h后更換培養(yǎng)基，載藥水凝膠留在細(xì)胞培養(yǎng)板上，72與96 h仍然有藥物釋放出來，這從另一個(gè)方面體現(xiàn)出載藥水凝膠的藥物緩釋性能。

PPP水凝膠是一種化學(xué)交聯(lián)的兩親性水凝膠。作為吡非尼酮藥物緩釋系統(tǒng)能最大程度解決載藥率問題［15，19-20］。體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)表明，PPP水凝膠有良好的藥物緩釋效應(yīng)。PPP水凝膠由于PEG的相對(duì)惰性，對(duì)HTF細(xì)胞有抑制黏附作用，這一特性正是青光眼術(shù)后抗疤痕化所需要的。載藥水凝膠對(duì)HTF的增殖抑制呈現(xiàn)時(shí)間依賴性和劑量依賴性并且較藥物溶液明顯長(zhǎng)效。