過氧化物還原酶3參與腎透明細(xì)胞癌發(fā)生與發(fā)展的分子機(jī)制

鄭丹琴，劉志磊，朱松杰，呂錦晶，章文韻，鄧海騰，周 韌

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，浙江杭州310058；2.杭州市臨安區(qū)人民醫(yī)院病理科，浙江杭州311300；3.清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京100038）

腎透明細(xì)胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）是泌尿系統(tǒng)常見的一種高度異質(zhì)性惡性腫瘤，是腎癌的主要類型（約80%）［1］。手術(shù)切除仍是目前較為常見的治療手段［2］，但是腎透明細(xì)胞癌的特點(diǎn)是很容易轉(zhuǎn)移，所以病人手術(shù)預(yù)后較差，死亡率較高［3］。目前缺乏ccRCC特異的腫瘤標(biāo)志物，也缺少針對(duì)ccRCC的靶向藥物。所以尋找ccRCC特異的腫瘤標(biāo)志物，揭開腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制及找到相關(guān)的治療靶點(diǎn)，仍是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［4］。硫氧還蛋白依賴的過氧化物還原酶3（thioredoxin-dependent peroxide reductase 3，PRDX3）是存在于線粒體中的過氧化物還原酶，線粒體DNA對(duì)于代謝產(chǎn)生的活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS）更敏感，也更容易受到損傷。PRDX3能清除線粒體中90%的過氧化氫。目前已發(fā)現(xiàn)PRDX3在肝細(xì)胞癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌等癌組織中高表達(dá)［5-8］，而在膀胱癌、腎癌、胰腺癌組織中下調(diào)表達(dá)［9］。PRDX3在不同的類型的腫瘤組織中表達(dá)量差異的原因，有待通過進(jìn)一步研究揭示。本研究收集16例ccRCC癌及癌旁組織樣本，發(fā)現(xiàn)其中14例ccRCC癌組織中PRDX3的表達(dá)量顯著低于癌旁正常組織。推測(cè)PRDX3可能參與了腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程，并且腎透明細(xì)胞癌中PRDX3的表達(dá)可能受到了抑制。本研究在786-O人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系中過表達(dá)了PRDX3基因，使其表達(dá)量與正常組織表達(dá)量一致，也構(gòu)建了PRDX3敲低表達(dá)的細(xì)胞系。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PRDX3的細(xì)胞系細(xì)胞生長(zhǎng)明顯變慢；但敲低表達(dá)PRDX3后，兩組細(xì)胞生長(zhǎng)速率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異。提示提高PRDX3的表達(dá)量可能在某種程度上抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多因素且多階段的復(fù)雜過程。PRDX3參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，可能是與其他蛋白共同作用實(shí)現(xiàn)。本研究pull-down了與PRDX3相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)過氧化物酶 1（peroxiredoxin 1，PRDX1）通過二硫鍵與PRDX3相互作用。推測(cè)二者相互作用可能共同影響了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PRDX3抗體購(gòu)自Abcam公司，兔源二抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；內(nèi)參β-ɑctin抗體購(gòu)自Abmart公司；人786-O細(xì)胞系、慢病毒質(zhì)粒等來自本實(shí)驗(yàn)室保藏；使用RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Wisent公司、胎牛血清FBS購(gòu)自四季青公司，雙抗青霉素/鏈霉素購(gòu)自Sigma公司；CCK-8試劑購(gòu)自Dojindo公司；抗flag beads購(gòu)自sigma公司；qPCR試劑購(gòu)自Vazyme公司；PCR引物由Invitrogen公司合成；點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自天根公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Q Exactive質(zhì)譜儀（Thermofisher），熒光定量PCR儀（LC480，Roche），流式細(xì)胞分析儀（BD Calibur）。

1.3 樣本收集

收集2015年5月至2016年3月期間在我院進(jìn)行腎切除術(shù)后的組織樣本，術(shù)后病理結(jié)果證實(shí)為腎透明細(xì)胞癌的腎癌。癌和癌旁組織用PBS緩沖液沖洗后，一部分組織凍存于液氮中，另一部分用甲醛固定后用于免疫組化染色?；颊咝g(shù)前均未經(jīng)過放療和化療，本研究收集16例腎透明細(xì)胞癌及癌旁組織樣本，患者年齡為48～72歲，其中男性9例，女性7例。本項(xiàng)研究標(biāo)本的收集均經(jīng)本院倫理委員會(huì)的認(rèn)可，并經(jīng)患者同意。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建

1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)人786-O細(xì)胞，將攜帶有PRDX3基因的質(zhì)粒和三種輔助質(zhì)粒，通過慢病毒感染的方式，轉(zhuǎn)入786-O細(xì)胞，使PRDX3基因插入細(xì)胞基因組中。用流式細(xì)胞儀篩選GFP陽(yáng)性細(xì)胞，挑選單克隆，接種96孔板，兩周內(nèi)熒光顯微鏡觀察，并將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)移至6孔板擴(kuò)大培養(yǎng)，根據(jù)表達(dá)量挑選合適的PRDX3過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株。同時(shí)構(gòu)建空載質(zhì)粒的細(xì)胞系，標(biāo)記為786O-PRDX3（+）和786O-PRDX3（-）。同理，根據(jù)GenBank中PRDX3的mRNA序列設(shè)計(jì)發(fā)卡結(jié)構(gòu)和選取無意義shRNA序列（表1），構(gòu)建PRDX3敲低表達(dá)細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞系，標(biāo)記為786O-PRDX3KN和786OPRDX3NCi。

表1 PRDX3及陰性對(duì)照的shRNA序列Table 1 shRNA sequence of PRDX3 and control

1.5 過表達(dá)和敲低表達(dá)細(xì)胞系的驗(yàn)證

實(shí)時(shí)定量PCR和western blot驗(yàn)證PRDX3的表達(dá)情況。qPCR特異性引物和β-ɑctin內(nèi)參引物見表 2（http：//pga.mgh.harvard.edu/primerbank/），提取786O-PRDX3（+）、786O-PRDX3（-）、786O-PRDX3KN、786O-PRDX3NCi和野生型細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，配制qPCR反應(yīng)體系，用Light Cycler?480 II（Roche）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)的樣品需同時(shí)做3個(gè)重復(fù)孔。

裂解上述五種細(xì)胞，取等量（10 μg）蛋白上樣SDS-PAGE，采用半干轉(zhuǎn)三明治夾心法將蛋白從SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h，用PRDX3抗體（1∶500）4 ℃ 孵育過夜，洗膜后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔二抗，室溫孵育1 h，再次洗膜，加入ECL顯色液，用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光條帶。腎透明細(xì)胞癌組織樣品的western blot試驗(yàn)操作同上，上樣量為20 μg。

1.6 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定（CCK-8法）

786O-PRDX3（+）、786O-PRDX3（-）、786OPRDX3KN、786O-PRDX3NCi和野生型5種細(xì)胞以每孔1 000個(gè)細(xì)胞量均勻鋪96孔板，時(shí)間梯度設(shè)置為12、24、48、60、72、96、108 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每孔加入7 μL CCK-8試劑，450 nm處測(cè)定OD數(shù)值。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔和1個(gè)空白孔，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

表2 PRDX3及β-actin的qPCR引物Table 2 qPCR primers of PRDX3 and β-actin

1.7 相互作用蛋白pull-down試驗(yàn)

重組PRDX3蛋白的C端融合有flag標(biāo)簽，用抗flag的beads進(jìn)行pull-down，尋找與PRDX3相互作用的蛋白。上述五種細(xì)胞系裂解，BCA法測(cè)定蛋白濃度，按照5 mg總蛋白用40 μL beads的比例，等質(zhì)量等體積與beads孵育，4℃過夜孵育。裂解液沖洗beads 3次后，加入等量的洗脫緩沖液，洗脫beads上吸附的蛋白。進(jìn)行SDS-PAGE電泳或western blot檢測(cè)。

將SDS-PAGE膠對(duì)應(yīng)50 ku左右的條帶切下，并進(jìn)行脫色及酶切操作，用于二硫鍵鑒定的樣品，全過程不使用DTT還原，質(zhì)譜級(jí)胰蛋白酶溶液（50∶1）37℃酶切過夜。萃取出酶切后的肽段，濃縮后進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜分析。

1.8 質(zhì)譜分析

Q Exactive質(zhì)譜儀采用軟件Xcalibur 2.1.2以data-dependent acquisition模式進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。Orbitrap中的全掃描范圍為400～ 1 800 m/z（75，000分辨率）后，母離子經(jīng)32%的HCD能量值碎裂后，進(jìn)行20次二級(jí)MS/MS掃描。母離子選擇的質(zhì)量窗口為2.0 m/z。觸發(fā)MS/MS的閾值為8.0×103。動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為20 s。質(zhì)譜掃描產(chǎn)出的MS/MS譜圖，通過使用Proteome Discoverer軟件（version 2.0）搜索uniprot人數(shù)據(jù)庫(kù)（version 20171220）。

1.9 二硫鍵分析

同2.4準(zhǔn)備樣品，SDS-PAGE膠、細(xì)胞裂解液、上樣緩沖液均不含還原劑，樣本處理方式分為與非變性上樣緩沖液混合直接上樣。運(yùn)行SDSPAGE，切膠、酶切與質(zhì)譜鑒定。pLink軟件搜索自建數(shù)據(jù)庫(kù)（PRDX1/PRDX3sequences）。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS軟件（18.0）和Graph-Pad Prism 5軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，生長(zhǎng)曲線各時(shí)間點(diǎn)的組間比較采用多時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)量的方差分析，本研究中試驗(yàn)均重復(fù)3次，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎透明細(xì)胞癌組織中PRDX3的表達(dá)驗(yàn)證

在收集的16例腎透明細(xì)胞癌組織與對(duì)應(yīng)的癌旁組織中檢測(cè)了PRDX3的表達(dá)情況。圖1A為16例樣本的western blot檢測(cè)結(jié)果，圖1B為灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果，以癌旁組織表達(dá)量作為對(duì)照，進(jìn)行歸一化。16例腎癌樣本中，有14例樣品PRDX3下調(diào)表達(dá)，2例上調(diào)表達(dá)。其中差異1.35倍以上的有12例，下調(diào)均值為1.78倍。此外，本研究通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)16例腎癌及癌旁樣本進(jìn)行了定量分析，其中PRDX3的表達(dá)與western blot結(jié)果基本一致，同樣以下調(diào)1.35倍作為cutoff值，16例樣本中有12例下調(diào)表達(dá)，下調(diào)均值為1.89倍（表3）。

圖1 腫瘤組織樣本中PRDX3的表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 validation of PRDX3expression in tumor tissues

2.2 PRDX3過表達(dá)和敲低表達(dá)細(xì)胞系的驗(yàn)證

本研究在786-O細(xì)胞系中通過慢病毒表達(dá)載體感染細(xì)胞，篩選多株單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，采用qPCR和western blot的方法驗(yàn)證了所挑選的單克隆細(xì)胞系中PRDX3的表達(dá)情況。根據(jù)表達(dá)量挑選1株單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，使其表達(dá)量與組織水平差異表達(dá)倍數(shù)接近（1.78倍）。圖2A、B為qPCR和western blot驗(yàn)證PRDX3在mRNA和蛋白水平的過表達(dá)情況，與786O-PRDX3（-）相比，786O-PRDX3（+）分別過表達(dá)約2.1倍和1.8倍。圖2C、D為qPCR和western blot驗(yàn)證PRDX3在mRNA和蛋白水平的敲低表達(dá)情況，與786O-PRDX3NCi相比，786OPRDX3KN分別低表達(dá)約0.48倍和0.51倍。

表3 PRDX3的TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果Table 3 the ratio results for PRDX3in quantitative proteomic based on TMT labeled

圖2 PRDX3過表達(dá)和敲低表達(dá)細(xì)胞系的驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 Verification for PRDX3 mRNA and protein expression in different cell lines

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)速率檢測(cè)

為了探究PRDX3的表達(dá)量對(duì)腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，本研究對(duì)786O-PRDX3（+）、786OPRDX3（-）及野生型細(xì)胞系（WT）進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線測(cè)定，繪制OD值與時(shí)間的生長(zhǎng)曲線。786OPRDX3（+）與786O-PRDX3（-）細(xì)胞系相比，48 h后出現(xiàn)顯著性差異，細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著減慢（P=0.001）。至120 h時(shí)，786O-PRDX3（+）組細(xì)胞較其他兩組細(xì)胞下降了約30%（圖3A）。

本研究也對(duì)786O-PRDX3-KN、786O-PRDX3-NCi及野生型細(xì)胞系（WT）進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線測(cè)定。繪制OD值與時(shí)間的生長(zhǎng)曲線。發(fā)現(xiàn)敲低PRDX3后，與陰性對(duì)照細(xì)胞相比，并無顯著性差異（P=0.106；圖3B）。

2.4 Pull-down相互作用蛋白

本研究構(gòu)建的786O-PRDX3（+）穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中融合了flag標(biāo)簽，采用Anti-flag tag的beads進(jìn)行pull-down試驗(yàn)，用于與PRDX3相互作用蛋白的挑選。優(yōu)先挑選與對(duì)照組相比，786O-PRDX3（+）組特有的蛋白。表4呈現(xiàn)的是得分排在前10位的蛋白，這些蛋白主要與氧化應(yīng)激與蛋白降解途徑有關(guān)。

2.5 PRDX3參與ccRCC發(fā)生發(fā)展機(jī)制的初步探索

研究表明，PRDX家族通過與其他蛋白形成二硫鍵來傳遞氧化信號(hào)［10］，推測(cè)PRDX3也是通過二硫鍵與其他蛋白相互作用的。本研究利用二硫蘇糖醇DTT和加熱條件能打開二硫鍵的原理進(jìn)行探索分析，圖4為786O-PRDX3（+）在還原/非還原條件下pull-down的結(jié)果，PRDX3主帶所在位置在26 ku左右，PPI箭頭處（48～63 ku之間）出現(xiàn)明顯的特異性條帶，推測(cè)可能是與PRDX3特異結(jié)合的相互作用蛋白。

2.6 PRDX1與PRDX3結(jié)合位點(diǎn)的初步確認(rèn)

結(jié)合SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果，將圖4箭頭對(duì)應(yīng)條帶切下，膠條經(jīng)脫色等處理后，進(jìn)行胰蛋白酶酶切，進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過pLink軟件將質(zhì)譜譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。表4是基于pLink的肽段交聯(lián)信息，PRDX3通過第229位半胱氨酸與PRDX1第173位半胱氨酸交聯(lián)，score值0.0028，b、y例子匹配良好，交聯(lián)位點(diǎn)可信。

2.7 驗(yàn)證PRDX1與PRDX3的結(jié)合位點(diǎn)

圖3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果Fig.3 Cell proliferation rate detected by the CCK-8 assay in five cell lines

表4 基于質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫(kù)搜索的蛋白質(zhì)鑒定信息Table 4 Protein identity information for protein interaction with PRDX3based on LC/MS-MS

本研究將PRDX3蛋白第229位的半胱氨酸C定點(diǎn)突變成丙氨酸A后，測(cè)序確認(rèn)突變效果。通過lipo2000轉(zhuǎn)染試劑，將突變前后的PRDX3過表達(dá)質(zhì)粒分別采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)入786-O細(xì)胞系中，48 h后裂解細(xì)胞分別進(jìn)行pull-down試驗(yàn)。Western blot的結(jié)果表明，突變之后，不再能檢測(cè)到PRDX1條帶，而突變之前仍可以看到PRDX1條帶（圖5），證明兩者是通過二硫鍵相互作用的。兩者相互作用，可能共同參與了氧化還原過程，也可能由于與PRDX1相互作用，解除了對(duì)PRDX3的抑制，使相關(guān)胞內(nèi)信號(hào)得以傳遞。

3 討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)PRDX3在腎透明細(xì)胞癌組織中顯著下調(diào)表達(dá)，按照下調(diào)表達(dá)的平均倍數(shù)，在腎透明細(xì)胞癌786-O細(xì)胞系中過表達(dá)了PRDX3基因。過表達(dá)PRDX3基因的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著變慢，PRDX3的表達(dá)水平可能直接影響了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。通過pull-down實(shí)驗(yàn)和western blot試驗(yàn)證明PRDX1與PRDX3通過二硫鍵直接相互作用。PRDX3不但能調(diào)節(jié)胞內(nèi) ROS 水平［10］，而且還是c-Myc轉(zhuǎn)錄因子的下游靶標(biāo)，參與細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生等過程［11］。兩者的相互作用可能引起了ROS的變化，也可能介導(dǎo)了信號(hào)傳遞，進(jìn)一步影響了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

表4 基于pLink的肽段交聯(lián)信息Table 4 cross-link analysis for PRDX3 and PRDX1 based on the pLink software

圖4 在還原/非還原條件下pull-down的膠圖Fig.4 The gel map of pull-down analysis by SDSPAGE in reduce and non-reduce condition

圖5 Pull-down試驗(yàn)驗(yàn)證PRDX3與PRDX1的相互作用Fig.5 Site mutation for PRDX3for validating PRDX3-PRDX1interaction

PRDX3在多數(shù)的癌組織中上調(diào)表達(dá)，但在腎透明細(xì)胞癌中PRDX3下調(diào)表達(dá)，猜想在腎透明細(xì)胞癌中PRDX3的表達(dá)可能在某種程度上被抑制。Xi等［12］報(bào)道稱低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF1α）能夠抑制PRDX3的表達(dá)，從而促進(jìn)ccRCC細(xì)胞增殖。PRDX3作為線粒體主要參與氧化還原的蛋白，還能參與信號(hào)的調(diào)控。PRDX3表達(dá)減低，或許使某種信號(hào)不能傳遞。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們將PRDX3的表達(dá)量在原有基礎(chǔ)上又下調(diào)了一倍，但并未觀察到明顯的細(xì)胞表型變化。PRDX3的這一水平表達(dá)，可能還不足以引起胞內(nèi)信號(hào)的變化。是否PRDX3的表達(dá)量與信號(hào)傳遞有關(guān)系，我們將嘗試對(duì)PRDX3進(jìn)行基因敲除，繼續(xù)探究。

腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與的過程，目前已知在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，PRDX3與Nrf2、Abrin、Srx、FOXO3A等蛋白存在相互作用［13-16］，共同影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。本研究中首次發(fā)現(xiàn)PRDX3與PRDX1存在相互作用，也發(fā)現(xiàn)PRDX3通過二硫鍵形成了同源二聚體。PRDX3通過與PRDX1的互作以及自身形成的二聚體，是否解除了對(duì)PRDX3的抑制，介導(dǎo)信號(hào)傳遞，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，還需進(jìn)一步研究證明。

腫瘤細(xì)胞過度增殖的特性之一就是胞內(nèi)ROS增加，PRDX3的表達(dá)可明顯調(diào)節(jié)胞內(nèi)ROS水平［10］。ROS是一把雙刃劍，過高或過低均不利于腫瘤細(xì)胞是生長(zhǎng)。未來將進(jìn)一步檢測(cè)胞內(nèi)ROS水平的變化，闡述PRDX3表達(dá)量與胞內(nèi)ROS的關(guān)系，揭示PRDX3低表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)速率的關(guān)系。從蛋白表達(dá)水平來看，腎透明細(xì)胞癌中PRDX3下調(diào)表達(dá)，可與其他潛在的腫瘤標(biāo)志物PBRM1［17］、ErbB3［18］、LHX2［19］等協(xié)同預(yù)警腎透明細(xì)胞癌。提高PRDX3的表達(dá)量，腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速率明顯減慢，提示可以開發(fā)基于PRDX3的腎透明細(xì)胞癌靶向藥物。