三七花醇提物PNFM對健康人血小板功能的體外作用

覃 楠，李 卿，左 曉，鄒培斧，馬麗娟，萬建波，楊 燕3，4，，7，嘉紅云

（1.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，廣東廣州510260；2.中山大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)系，廣東廣州510080；3.廣東省營養(yǎng)與健康重點實驗室，廣東廣州510080；4.廣東省營養(yǎng)轉化工程技術研究中心，廣東廣州510080；5.中山大學公共衛(wèi)生學院（深圳），廣東深圳518000；6.澳門大學中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室，澳門；7.深圳市大鵬新區(qū)婦幼保健院保健部，廣東深圳518120）

血栓性疾病主要是指動脈血栓習慣疾病和靜脈血栓性疾病，主要包括心肌梗死［1-2］、腦血栓［3-4］和深靜脈血栓，發(fā)病率很高，已成為我國與西方國家人口死亡和致殘的主要原因［5］。血栓形成或栓塞是導致心、腦和外周血管事件的最后關鍵環(huán)節(jié)，是致死和致殘的直接原因。血小板在血栓形成特別是動脈血栓和微血管血栓形成中起著關鍵作用［6］，其中血小板異常活化、聚集等并啟動血栓形成的過程尤為關鍵，有效抑制血小板過度活化是防治動脈血栓的主要方法之一。目前臨床應用的抗血小板藥物如阿司匹林、氯吡格雷等，均存在出血、胃腸道反應等副作用，因而尋找臨床療效顯著且不良反應小的抗血小板藥物是近年來關注的熱點［7］。三七為五加科人參屬植物，是我國傳統(tǒng)中藥材，安全性高且療效顯著，已被用于預防和治療多種疾病。三七的根、莖、葉、花均可入藥，其中主要活性成分為三七皂苷，目前三七根中提取的三七總皂苷被研究可抗炎、抗血小板、改善血栓［8-9］而在臨床上被廣泛應用于心腦血管疾病的治療，其主要的作用成分為一些二醇皂苷和三醇皂苷［10］；三七花作為民間藥物或膳食補充，過去也常用于預防心血管疾病等，已被證實具有多種藥理活性，包括抗癌［11］、抗菌［12］、抗氧化［13］及改善急性心肌梗死的預后等等，且三七花朵部分的皂苷含量是最高的［14］，與三七根部有明顯的差異，但目前尚未發(fā)現(xiàn)關于三七花的皂苷對健康人血小板及血栓影響的相關報道。因此，本課題從三七花朵的粉劑提取出溶于甲醇的皂苷，獲得三七花的醇提取物（Panax Notoginseng flower extracted by methanol，PNFM）。本研究在體外實驗中探討PNFM對健康人血小板活化、釋放、黏附及鈣離子動員和聚集等功能的影響，為三七花應用于心腦血管血栓疾病的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

招募健康大學生志愿者，納入標準包括：①至少2周內(nèi)未服用過任何抗凝或抗血小板藥物；②未攝入過三七、人參等富含三七皂苷的物質(zhì)；③無吸煙、酗酒等習慣。所有志愿者均對實驗方法知情且已簽署知情同意書，本實驗通過中山大學公共衛(wèi)生學院倫理委員會審核同意。

1.2 藥物及試劑

1.2.1 試劑及儀器 FITC Mouse Anti-Human CD62P、FITC Mouse Anti-Human PAC-1、IgG 購自BD Pharmingen公司；ATP標準品及熒光試劑盒購自Chrono-Log公司；Phalloidin-iFluor 488購自Abcam公司；血小板聚集儀購自Chrono-Log公司；Gallios流式細胞儀購自Beckman公司；酶標儀購自Bio-Tek instrument Inc。

1.2.2 提取物準備 三七花醇提物PNFM由中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室（澳門大學）提供。具體提取方法為：將約200 mg的PNF細粉放入于10 mL的甲醇中，混勻20 s。于室溫下將此懸浮液置于超聲浴中超聲提取2 h后，取上清裝入25 mL容量瓶中，用甲醇定容后，用0.22 μm過濾器進行過濾，再將20 mL的上述液體于65℃的旋轉真空蒸發(fā)器中濃縮至干燥后，將其溶于3 mL去離子水中，再用真空冷凍干燥器冷凍干燥，得到PNFM凍干粉，將其溶于蒸餾水調(diào)整濃度為50 mg/mL用于體外研究［15］。

1.3 富血小板血漿及純化血小板的制備

采用靜脈穿刺抽取健康志愿者外周靜脈血15 mL于檸檬酸鈉抗凝管中。將采集的全血以1 000 r/min的轉速（r=8.5 cm，下同）室溫離心10 min，上清轉移至新的EP管中，得到富血小板血漿（platelet rich plasma，PRP）。剩余血液以3 000 r/min離心15 min，收集上清得到貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）。再將PRP于SepharoseCL-2B凝膠過濾系統(tǒng)過濾后得到純化血小板。

1.4 血小板P-選擇素和PAC-1的流式細胞術檢測

將PRP用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋至1×106/mL，分別取50 μL的血小板與不同濃度 PNFM（0、100、300、500 μg/mL）孵育20 min，分別與FITC-CD62P、FITC-PAC-1避光37℃孵育30 min后，加入終濃度為100 μmol/L的ADP激活5 min，然后立即加入10 g/L的多聚甲醛溶液避光固定，上機檢測［16］。

1.5 血小板ATP釋放實驗

取230 μL PRP，加入20 μL ATP熒光試劑，測定終質(zhì)量濃度2 ng/mL的ATP標準品的最大峰值；取與不同濃度PNFM孵育后的PRP，加入20 μL ATP熒光試劑后，分別測定5、10 μmol/L ADP誘導的各組孵育后的血小板的最大ATP釋放量，7 min后終止反應，軟件自動計算得到ATP釋放濃度，記錄釋放曲線［16］。

1.6 血小板在纖維蛋白原上的鋪展實驗

在玻片上鋪展纖維蛋白原（終質(zhì)量濃度為100 μg/mL）4℃過夜后，BSA（PBS配制）封閉，然后分別加入預先干預好的純化血小板（濃度1×107/mL）和1 mmol/L的CaCl2，37℃鋪展1 h，PBS洗凈后加入40 g/L的多聚甲醛溶液固定15 min，再用0.1%Triton X-100穿孔后，用Phalloidin-iFluor 488進行熒光染色1 h，防淬滅劑封片后，激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照，用ImageJ軟件計算血小板鋪展面積。

1.7 血小板聚集實驗

取250 μL PRP與不同濃度的PNFM孵育20 min，分別用5、10 μmol/L 的ADP作為誘導劑后用血小板聚集儀檢測樣本的最大聚集率，8 min后終止反應，記錄聚集曲線［16］。

1.8 統(tǒng)計學分析

所有的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均采用SPSS 20.0軟件進行。多組計量資料采用單因素方差分析（ANOVA），多組比較有統(tǒng)計學意義后采用Dunnett′st檢驗，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PNFM在體外對健康人血小板CD62P的影響

在100、200 μmol/L的ADP誘導下，PNFM干預組的血小板表面CD62P的表達量均比對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1）。

2.2 PNFM在體外對健康人血小板PAC-1的影響

在100、200 μmol/L的ADP誘導下，PNFM干預組的血小板表面PAC-1的表達量均比對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2）。

2.3 PNFM在體外對健康人血小板ATP釋放的影響

在5 μmol/L ADP的誘導下，PNFM干預組對健康人血小板的ATP的釋放均有顯著抑制作用，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，圖3）。

圖1 PNFM抑制ADP誘導的健康人血小板CD62P的表達Fig.1 PNFM inhibited the expression of CD62P of healthy human induced by ADP

圖2 PNFM抑制ADP誘導的健康人血小板PAC-1的表達Fig.2 Effect of PNFM on human platelet αIIbβ3 activation induced by ADP

圖3 PNFM抑制ADP誘導的健康人血小板ATP的釋放Fig.3 PNFM inhibited the ATP release of healthy human induced by ADP

圖4 PNFM抑制健康人血小板在纖維蛋白原上的鋪展Fig.4 PNFM inhibited healthy human platelet spreading on fibrinogen

2.4 PNFM對健康人體外血小板在纖維蛋白原上鋪展的影響

與對照組相比，PNFM的各濃度干預組的單個血小板面積均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖4）。

2.5 PNFM在體外對健康人血小板聚集的影響

在5、10 μmol/L的ADP的誘導下，PNFM 300、500 μg/mL的干預組明顯抑制健康人體外血小板的聚集，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖5）。

2.6 PNFM在體外對健康人血小板鈣離子動員的影響

在200 μmol/L的ADP的誘導下，PNFM所有干預組明顯抑制健康人體外血小板鈣離子的動員，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖6）。

圖5 PNFM抑制ADP誘導的健康人血小板的聚集Fig.5 PNFM inhibited the platelet aggregation rate of healthy human was induced by ADP

圖6 PNFM抑制ADP誘導的健康人血小板的鈣離子動員Fig.6 PNFM inhibited the platelet calcium mobilization of healthy human induced by ADP

3 討論

血小板過度活化、聚集在血栓的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，抑制血小板過度活化和聚集等功能已經(jīng)成為防治血栓性疾病的重要靶標之一。三七對血小板的研究大多基于三七根部，但其不同部位如花朵部分與三七根部的皂苷成分含量有很大的不同［17］，如三七花中含有豐富的人參二醇皂苷Fc和Rc、Rb2、Rb3，這些在三七根中含量極少。過去由于技術局限性，三七根部較花朵更易獲取和保存，因此主要使用三七根部作為活血化瘀中藥的主要成分。但最近研究指出，三七花中皂苷含量更為豐富，可能具有更高的藥用價值。它們對血小板功能的影響研究極少，其中含量較多的Rb3、Rc、Rb2被報道有抗炎，抗氧化，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等功能［18-20］，尚無對血小板的相關研究，在花朵中含量少而根部含量較高的Rb1被證明對SD大鼠的血小板聚集有抑制作用［21］，但其對人血小板功能的研究尚無報道。本研究使用的PNFM主要含有Rb3、Rc、Rb2、Rb1、Rd、Fc等幾種皂苷，已被證明有抗炎的作用［15］，我們用它干預人血小板，探索三七花中皂苷對血小板功能的影響。研究結果顯示，PNFM可以顯著抑制不同濃度的ADP誘導的血小板活化、釋放、黏附，聚集及鈣離子動員。血小板無核，但含有豐富的顆粒物包括α顆粒、致密顆粒、溶酶體等，它們對血小板功能有至關重要的作用。血小板顆粒釋放引起大量的活性分子在血管損傷部位的聚集，這些活性物質(zhì)具有多種生物學活性，包括放大細胞活化信號，啟動血栓的形成，介導細胞的黏附，促使細胞分化和遷移。已有研究顯示，降低血小板顆粒釋放水平，可以抑制膳食誘導的動脈血栓，動脈粥樣硬化的形成，炎癥反應等［22-23］。本研究結果，PNFM可以顯著調(diào)節(jié)人血小板功能，尤其對血小板顆粒物釋放作用如α顆粒的CD62P、致密顆粒的ATP釋放的效果特別顯著。血小板中顆粒物釋放的信號通路很復雜，如3羧基磷脂酰肌醇激酶PI3K是血小板活化過程中的關鍵信號傳導分子，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt是其下游的主要效應分子；是多種激活劑活化血小板的共同通路［24］，Akt可以通過活化內(nèi)皮型一氧化氮合成酶eNOS促進血小板NO生成，刺激cGMP產(chǎn)生，從而調(diào)控血小板顆粒釋放［25］；絲裂原活化蛋白激酶家族MAPKs中的P38、ERK等在血小板中均有表達，也參與調(diào)控血小板顆粒物釋放等多種功能［26］。PNFM通過哪些信號通路來實現(xiàn)其效果，我們進行了以下猜測：PNFM中含量最高的皂苷Rb3可以通過Pyk2-PI3K-AKT信號傳導途徑抑制柯薩奇病毒B3感染后的心臟微血管內(nèi)皮細胞的內(nèi)皮-間質(zhì)轉化［18］；含量較高的Rc被證明可通過p38/ATF-2信號傳導而發(fā)揮抗炎作用［27］，還可調(diào)節(jié)Akt/FoxO1而抑制人胚胎細胞的氧化應激；同樣含有Rb1的三七總皂苷曾被報道抑制血小板活化和聚集與血小板中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）蛋白的過表達，和PI3K/Akt/eNOS途徑的上調(diào)有關［28］。其中Rb1還被報道可以通過抑制PI3K/Akt途徑從而抑制血管內(nèi)皮功能紊亂和保護心肌缺血再灌注［6］。因此我們推測PNFM是否可能通過這些通路從而影響血小板顆粒物釋放等功能，目前尚不清楚，需要我們進一步深入研究。

綜上所述，PNFM可以有效抑制血小板過度活化和聚集等功能，為三七花作為防治心腦血管血栓性疾病的藥物提供了新的可能。