間充質(zhì)干細胞對B細胞增殖及免疫調(diào)節(jié)功能的影響

劉秋莉，肖崇珺，黃牡丹，黃 里，陳小湧，鄭海清

（中山大學(xué)1.附屬第三醫(yī)院生物治療中心，廣東廣州510630；2.附屬第三醫(yī)院嶺南醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，廣東廣州510700；3.中山醫(yī)學(xué)院干細胞中心，廣東廣州510080）

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）是存在于骨髓中的非造血類的干細胞。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細胞除了具有較低的免疫原性外（低表達HLA-Ⅰ類分子，不表達HLA-Ⅱ類分子）［1-2］，還具有調(diào)節(jié)免疫活性細胞反應(yīng)的作用［3］：MSC除了能抑制T細胞由絲裂原刺激的增殖反應(yīng)，增加調(diào)節(jié)性T細胞比例外，還可以促進B細胞的增殖、活化以及其抗體分泌，并影響B(tài)細胞的趨化功能。盡管B細胞是重要的免疫調(diào)節(jié)細胞，在許多自身免疫性疾病和移植排斥中發(fā)揮重要功能作用［4-5］，但目前關(guān)于MSC對B細胞具體的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)并不明確。已有文獻報道MSC能夠誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細胞產(chǎn)生，但是經(jīng)MSC教育后的B細胞的功能是否有變化？因此，本研究擬觀察MSC對B細胞免疫調(diào)節(jié)作用的影響，從而探討MSC是否具有教育或誘導(dǎo)B細胞亞群產(chǎn)生進而具有主動抑制其他免疫細胞增殖、活化以及分泌相關(guān)炎癥因子的功能，為MSC在治療自身免疫性疾病和移植排斥中通過調(diào)控B細胞發(fā)揮作用的機制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MSC的分離和培養(yǎng)

取健康供體來源的骨髓細胞約30 mL，并簽署知情同意。采用Ficoll-Paque淋巴分離液（GE公司）用密度梯度離心法（450×g，30 min）從骨髓中分離單個核細胞；收集的單個核細胞接種至75 cm2培養(yǎng)瓶中，用低糖DMEM（L-DMEM，Low Glucose-Dulbecco′s Modified Eagle Medium）培養(yǎng)基在37°C，體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)、換液、傳代至第6代。

1.2 MSC表型鑒定

取體外培養(yǎng)到第6代的MSC消化重懸成106/mL，取100 μL細胞懸液于流式管，采用BD公司流式抗體CD29-PE、CD34-PE-cy7、CD44-APC、CD45-PE-cy7、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-FITC、CD166-APC標記MSC，同型對照分別為PE、PE-cy7、APC、-FITC的IgG抗體，進一步流式細胞儀鑒定MSC表型，證明體外培養(yǎng)對MSC細胞表型無影響。

1.3 體外定向誘導(dǎo)MSC成骨、成脂細胞及鑒定

取第6代的MSC按4×103/cm2的密度接種于6孔板，細胞達到60%～70%融合后，吸去舊培養(yǎng)基，加入成骨細胞誘導(dǎo)液（含10-7mol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50 mg/L 維生素C），置37℃，體積分數(shù)5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中，誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，吸去成骨細胞誘導(dǎo)液，用PBS緩沖液洗3次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，加入適量茜素紅S進行鈣結(jié)節(jié)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。同樣，將第6代的MSC按4×103/cm2的密度接種于6孔板，細胞達到80%～90%融合后，加入脂肪誘導(dǎo)液（含1 μmol/L地塞米松，0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，10 mg/L牛胰島素，0.2 mmol/L吲哚美辛，100 mmol/L胎牛血清FBS的HDMEM）誘導(dǎo)3 d，再用含10 mg/L牛胰島素，10%FBS的高糖DMEM（H-DMEM，High Glucose-Dulbecco′s Modified Eagle Medium）的脂肪誘導(dǎo)保持液處理1 d，如此循環(huán)3次后，用脂肪保持液處理7 d，每隔3 d換1次液。對照組加入含10%FBS的H-DMEM，置培養(yǎng)箱中，每隔3 d換液1次，最后吸去脂肪誘導(dǎo)液，用PBS洗3次，中性PFA室溫固定1 h，進行油紅O染色。

1.4 外周血淋巴細胞的制備

1.4.1 外周血單個核細胞的獲取 通過密度梯度離心法，用淋巴細胞分離液分離肝素鈉抗凝的不同健康人來源的新鮮外周血，收集全部白膜層單個核細胞，用無菌PBS按1：4稀釋。450×g，離心10 min，棄上清。再加足量PBS洗滌兩次。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基（Roswell Park Memorial Institute，RPMI-1640）完全培養(yǎng)基懸浮細胞，即獲得人外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell PBMC）。

1.4.2 流式細胞儀分選外周血T、B淋巴細胞并檢測純度 用含0.1%BSA的PBS（pH 7.4）洗滌2遍，棄上清，加入BD公司流式抗體小鼠抗人CD3-FITC，CD19-FITC標記PBMC，抗體用量每次實驗106個細胞/test，充分震蕩混勻，4℃孵育30 min，然后用含0.1%BSA的PBS（pH 7.4）洗滌兩遍，去除多余抗體；用PBS重懸細胞，BD influx流式分選儀分選細胞。分選所得的細胞采用FACS influx流式細胞儀檢測其純度，使檢測細胞純度＞95%。

1.5 MSC與B細胞共培養(yǎng)

MSC接種在24平底孔板，按MSC∶B=1∶5比例共培養(yǎng)，即MSC每孔約1×105，B細胞5×105每孔。培養(yǎng)體系總體積為500 μL。分選純化的CD19+B細胞，按MSC：B=1：5比例分別接種于24孔板，共培養(yǎng)3 d。收取細胞進行染色，標記CD19-FITC、CD5-V450、CD24hi-PE、CD27-APC、CD38hi-PECy7采用流式細胞儀分析CD19+CD5+B細胞、CD27+CD24hiB細胞與CD38hiCD24hiB細胞百分比變化以及CD19+CD5+B細胞生物學(xué)功能。

1.5.1 B細胞與MSC共培養(yǎng)對其增殖的影響 取invitrogen公司熒光染料CFSE（Carboxyfluorescein succinimidyl amino ester）標記的CD19+B細胞，PBS洗滌一遍，棄上清，用計數(shù)板計數(shù)后，按MSC∶B=1∶5的比例與MSC共培養(yǎng)，培養(yǎng)體系總體積為500 μL，并加入小鼠抗人 IgM 10 mg/L，CD40L 1 mg/L（刺激時間為96 h），所有細胞組均設(shè)3個復(fù)孔。96 h后收集B細胞，流式細胞術(shù)分別檢測單獨培養(yǎng)的B細胞以及和MSC共培養(yǎng)后的B細胞增殖情況。

1.5.2 MSC對B細胞細胞因子分泌的影響 取CD19+B細胞，PBS洗滌一遍，棄上清，用計數(shù)板計數(shù)后，按MSC∶B=1∶5的比例與MSC共培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)體系總體積為500 μL，最后6 h加入BD公司 leukocyte activation cocktail，包含 PMA（Phorbol 12-Myristate 13-Acetate）50 μg/L、離子霉素（ionomycine）500 μg/L 以及 BFA（Brefeldin A）10 mg/L。72 h后收細胞，用含0.1%BSA+0.05%NaN3的PBS（pH7.4）洗滌一遍，棄上清，調(diào)整細胞濃度為106/mL，取100 μL細胞懸液于流式管，加入表型流式抗體CD19-FITC，充分混勻，室溫避光孵育15 min；加100 μL細胞固定液（solution A），充分混勻，室溫避光孵育15 min，然后用含0.1%BSA+0.05%NaN3的PBS（pH 7.4）洗滌一遍，棄上清；加100 μL細胞破膜液（solution B）重懸細胞，同時加入胞內(nèi)細胞因子流式抗體IL-10，充分震蕩混勻，4℃避光孵育30 min，然后加2 mL含0.1%BSA+0.05%NaN3的PBS（pH7.4）洗滌兩遍，去除多余抗體；棄上清，用200 μL 10 g/L多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）重懸細胞，流式檢測。

1.5.3 CD19+B細胞與MSC培養(yǎng)后對CD4+T細胞增殖的影響 取CFSE標記的CD4+T細胞（2×105細胞/孔），PBS洗滌一遍，棄上清，用計數(shù)板計數(shù)后，按CD19+B∶CD4+T=1∶1的比例，接種到anti-CD3 mAb（200 μg/L）的96孔板，并加入anti-CD28 mAb（1 mg/L）刺激。培養(yǎng)體系總體積為200 μL。所有細胞組均設(shè)3個復(fù)孔。流式檢測96 h的CD4+T細胞增殖情況。

1.5.4 CD19+B細胞與MSC培養(yǎng)后對CD4+T細胞分泌IFN-γ的影響 取CD4+T細胞，PBS洗滌一遍，棄上清，用計數(shù)板計數(shù)后，按CD19+B∶CD4+T=1∶1的比例與MSC共培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)體系總體積為500 μL，最后6 h加入 leukocyte activation cocktail。收細胞，用含0.1%BSA+0.05%NaN3的PBS（pH 7.4）洗滌一遍，棄上清，調(diào)整細胞濃度為106/mL，取100 μL細胞懸液于流式管，加入表型流式抗體CD4-FITC，充分混勻，室溫避光孵育15 min；加100 μL solution A（細胞固定液），充分混勻，室溫避光孵育15 min，然后用含0.1%BSA+0.05%NaN3的PBS（pH7.4）洗滌一遍，棄上清；加100 μL solution B（細胞破膜液）重懸細胞，同時加入胞內(nèi)細胞因子流式抗體IFN-γ-APC，充分震蕩混勻，4℃避光孵育30 min，然后用含0.1%BSA+0.05%NaN3的PBS（pH7.4）洗滌兩遍，去除多余抗體；棄上清，用200 μL 1%PFA重懸細胞，流式檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS軟件分析結(jié)果，均以均數(shù)±標準差（）表示。在外周血淋巴細胞相關(guān)實驗中，鑒于不同健康人來源的B淋巴細胞按來源配對后被分為CD19+B細胞單獨培養(yǎng)組和共培養(yǎng)組（按CD19+B∶MSC=5∶1比例），因此B淋巴細胞增殖實驗、B細胞分泌IL-10實驗以及檢測B細胞亞群CD19+CD5+B細胞增殖實驗與其IL-10分泌實驗均采用配對t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義；同樣，在CD19+B細胞抑制CD4+T細胞分泌IFN-γ的實驗中，CD19+B細胞單獨培養(yǎng)組與MSC共培養(yǎng)組之間的比較亦采用配對t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MSC的鑒定及體外誘導(dǎo)分化成骨、成脂

健康捐獻者的骨髓在體外成功分離培養(yǎng)出MSC（圖1A），并驗證MSC在體外具有誘導(dǎo)分化成骨、成脂功能。當MSC在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)2周，大部分的細胞分化為被油紅O染色的脂肪細胞（圖1B）。當MSC在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)3周，大于80%的細胞分化為能被茜素紅S染色的成骨細胞（圖1C）。同時，我們還采用流式細胞儀分析MSC表型，細胞表面標記抗原CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166均為陽性，而不表達造血干細胞表面標記抗原CD45和CD34（圖1D）。

圖1 MSC體外誘導(dǎo)分化及表面標記分子Fig.1 MSC induced differentiation and phenotype in vitro

圖2 MSC促進CD19+B細胞增殖Fig.2 MSC promotes proliferation of CD19+B cells

圖3 MSC促進CD19+B細胞分泌IL-10Fig.3 MSC enhances the IL-10 secretion of CD19+B cells

2.2 MSC在體外促進B細胞的增殖及其分泌IL-10

為了探討MSC在體外對調(diào)節(jié)性B細胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響，我們首先對MSC在體外對B細胞增殖及分泌相關(guān)因子功能的影響進行了研究觀察。我們利用CFSE熒光標記系統(tǒng)來評估B細胞的增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：單獨培養(yǎng)組中B細胞增殖的比例為（33.13±1.11）%；共培養(yǎng)組中B細胞增殖的比例為（42.30±0.58）%，以上實驗細胞均重復(fù)3次，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩組之間的比較有統(tǒng)計學(xué)差異（t=2.6，P=0.016，圖2A、B）。

IL-10是炎癥反應(yīng)中重要的抑炎因子。為了進一步分析MSC對B細胞免疫調(diào)節(jié)的影響，我們又對MSC在體外是否具有促進B細胞分泌抑炎癥因子進行了研究。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，在采用CpG+重組人可溶性CD40L預(yù)先刺激B細胞的條件下，共培養(yǎng)組分泌IL-10的B細胞的比例由（0.48±0.04）%增加至1.25%±0.07%，與單獨培養(yǎng)組的B細胞比較，兩組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.7，P=0.003，圖3A、B）。以上實驗均重復(fù)了3次。

2.3 MSC增強CD19+B細胞對CD4+T細胞增殖的抑制并減少其IFN-γ的分泌

既然MSC在體外具有促進B細胞的增殖及其分泌IL-10，我們接著進一步觀察MSC是否也具有促進CD19+B細胞對CD4+T細胞的免疫調(diào)節(jié)抑制功能。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)組中的CD19+B細胞能明顯抑制CD4+T細胞的增殖并減少其IFN-γ的分泌水平（圖4A、B，5A、B）。

2.4 MSC增加CD19+CD5+B細胞的表達與IL-10的分泌

為了進一步解釋分析CD19+B細胞與MSC共培養(yǎng)后具有明顯抑制CD4+T細胞的增殖并減少其IFN-γ分泌的原因，我們緊接著又采用流式細胞儀對CD19+B細胞相關(guān)亞群細胞進行了分析，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)組中CD19+CD5+B細胞亞群的比例明顯增加，而其它調(diào)節(jié)性B細胞亞群中CD27+CD24hiB細胞與CD38hiCD24hiB細胞反而呈減少趨勢（圖6A、B，7A）。

圖4 MSC增強CD19+B細胞對CD4+T細胞增殖的抑制能力Fig.4 MSC enhances the ability of CD19+B cells to inhibit CD4+T cells

圖5 MSC增強CD19+B細胞抑制CD4+T細胞分泌IFN-γ Fig.5 MSC enhances the ability of CD19+B cells to inhibit the secretion of IFN-γ by CD4+T cells

圖6 MSC對其它調(diào)節(jié)性B細胞亞群表達的影響Fig.6 Effects of MSC on other subgroups expression of regulatory B cells

我們已在前面的研究中發(fā)現(xiàn)MSC能促進B淋巴細胞的增殖并且能增加其IL-10的分泌，而CD19+B細胞與MSC共培養(yǎng)后，能明顯抑制CD4+T細胞的增殖并減少其IFN-γ的分泌水平，這是否與其分泌IL-10相關(guān)？因此，我們又繼續(xù)分析B細胞中具有分泌IL-10的CD5+B細胞亞群，結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)組中CD5+B細胞數(shù)量的百分比由單獨培養(yǎng)條件下的（21.31±1.22）%增加至（31.27±0.92）%（t=2.7，P=0.014）；而且其IL-10的分泌水平由（1.09±0.08）%增加至（2.44±0.06）%（t=4.6，P＜0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖7A～D）。進一步實驗中，我們在B細胞和T細胞的共培養(yǎng)體系中加入R&D公司小鼠抗人IL-10中和抗體（10 μg/mL），結(jié)果顯示，IL-10中和抗體能夠逆轉(zhuǎn)B細胞抑制T細胞分泌IFN-γ（圖8A、B）和細胞的增殖百分比（圖8C、D）。

圖7 MSC增加CD5+B細胞的比例與其分泌IL-10Fig.7 MSC increase the proportion of CD5+B Cells and its IL-10 secretion

圖8 B細胞通過分泌IL-10抑制T細胞炎癥因子分泌和增殖反應(yīng)Fig.8 B cells inhibit T cells secretion inflammation cytokine and proliferation through secreting IL-10

3 討論

B細胞是獲得性免疫反應(yīng)中的重要的效應(yīng)細胞。一般認為B細胞通過產(chǎn)生抗原特異性抗體和輔助誘導(dǎo)CD4+T細胞活化而發(fā)揮正性免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。直到在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了負性調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的特異B細胞亞群，才證實了調(diào)節(jié)性B細胞（Regulatory B-cell）的存在及B細胞對于維持機體免疫耐受的重要作用。近年來，越來越多的實驗研究均表明了B細胞也具有免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)作用［4-6］。

Corcione等［7］發(fā)現(xiàn)MSC呈劑量依賴性地使B細胞停滯在Gn/G期，對其增殖產(chǎn)生明顯地抑制性作用；同時，MSC還能抑制抗IgG抗體、可溶性分子CD40L以及其他細胞因子刺激下引起的B細胞的增殖；而Rafei等［8］的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)MSC可以通過趨化因子CCL2抑制轉(zhuǎn)錄因子STAT3的表達，進而誘導(dǎo)PAX5蛋白的生成來抑制漿細胞Ig的分泌；還有研究表明MSC可以通過抑制B細胞介導(dǎo)的成熟蛋白-1信使RNA的表達，從而抑制B細胞終末分化。相反，也有研究表明MSC具有促進B細胞的增殖與分化的作用［9］，這可能與MSC分泌的IL-7有關(guān)；在CpG，CD40L和IL-2的刺激下，MSC能誘導(dǎo)與其直接接觸的B細胞增殖，然而這種誘導(dǎo)增殖的效應(yīng)在Transwell培養(yǎng)體系里被阻斷了；MSC還能誘導(dǎo)記憶B細胞增殖分化為漿細胞［9-10］。

我們在本研究中發(fā)現(xiàn)，MSC在體外培養(yǎng)體系具有增強B淋巴細胞對CD4+T細胞的增殖及其分泌IFN-γ水平的抑制能力（圖4、5）；當我們采用流式細胞儀進一步分析B細胞相關(guān)亞群細胞時，我們發(fā)現(xiàn)CD5+B細胞的數(shù)量明顯增加，同時其分泌的IL-10也顯著增加。這提示著MSC增強B淋巴細胞對CD4+T細胞的增殖及其分泌IFN-γ的抑制可能與具有分泌IL-10的CD5+B細胞的表達增加有關(guān)。Mizoguchi等［11］曾經(jīng)報道過：他們在慢性結(jié)腸炎的小鼠動物模型中發(fā)現(xiàn)一群能分泌IL-10的調(diào)節(jié)性B細胞，而這群調(diào)節(jié)性B細胞高表達CD1d表型。Guo等［12］在hMSC治療多發(fā)性硬化動物模型EAE小鼠時也發(fā)現(xiàn)，隨著EAE小鼠臨床病情的緩解，其體內(nèi)具有分泌IL-10的CD1d highCD5+調(diào)節(jié)性B細胞明顯的表達增加。Le Huu等［13］更進一步將CD1d highCD5+B10細胞過繼輸注至cGVHD小鼠模型中，他們發(fā)現(xiàn)cGVHD小鼠的硬皮病表現(xiàn)明顯改善。這提示著MSC可能通過增加分泌IL-10的B細胞的表達，從而對自身免疫系統(tǒng)疾病起到相應(yīng)的治療作用。盡管目前也有些研究表明MSC是具有抑制B淋巴細胞的增殖［14］，并且使得B淋巴細胞分泌IgM、IgG，和IgA的功能明顯受損［7-8］，但有的研究也證實了MSC能促進B淋巴細胞的增殖，這也充分地支持了我們的研究結(jié)果［15］。

CD5是一個具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞表面受體分子，除T細胞外，CD5分子還表達在一類特殊的B細胞亞群（B1a）表面［16］。經(jīng)BCR（B細胞受體）激活后，人外周血中CD19+CD5+B細胞能產(chǎn)生較傳統(tǒng)B細胞（CD19+CD5-B細胞）更多的IL-10［17］，IL-10是一種重要的抑制炎癥水平的免疫調(diào)節(jié)因子，能產(chǎn)生IL-10的B細胞稱為調(diào)節(jié)性B細胞（Breg）。Dalloul［18］將CD5+B細胞描述為具有免疫調(diào)節(jié)能力的Breg細胞。Lo-Man［19］也曾報道CD5+B細胞通過產(chǎn)生大量的IL-10抑制新生小鼠的固有免疫反應(yīng)的DC細胞的功能。Lemoine［20］發(fā)現(xiàn)CD5+B細胞能通過影響Treg細胞的功能發(fā)揮免疫抑制作用，在包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡的多種自身免疫病人樣本中均能發(fā)現(xiàn)相同的抑制作用。

雖然本研究在體外實驗證實了MSC具有促進CD5+調(diào)節(jié)性B細胞表達的增加以及增強其免疫調(diào)節(jié)功能，但是MSC在體內(nèi)是否也同樣具有促進CD5+調(diào)節(jié)性B細胞的表達增加？其體內(nèi)的功能學(xué)表現(xiàn)如何？以及MSC在體內(nèi)對其免疫調(diào)節(jié)作用的影響的具體機制如何？我們?nèi)圆磺宄@也是本研究的不足之處，因此需要進一步的研究探討。此外，雖然本實驗研究所采用的PBMC均來自不同健康者提供的血液，且每組實驗均至少重復(fù)3次并同時設(shè)置3個復(fù)孔，但其代表性仍有一定的局限性。