順鉑耳毒性小鼠模型的建立

李永奇 ，曾祥麗 ，丁大連 ，，蔣海燕 ，Richard SALVI

（1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東廣州510630；2.美國紐約布法羅大學(xué)聽力與耳聾中心，紐約布法羅14214）

順鉑是臨床常用的抗腫瘤藥物之一，對常見的多種腫瘤，如膀胱癌、睪丸癌、子宮頸癌、肺癌和頭頸癌等都具有較好的抗腫瘤效果。但在臨床用藥過程中，有較高比例的患者出現(xiàn)了耳鳴、聽力下降和頭暈等不良反應(yīng)［1-4］，順鉑的耳毒性已經(jīng)成為限制其臨床應(yīng)用的主要原因之一。盡管順鉑的耳毒性機(jī)制尚未完全闡明，然已有許多文獻(xiàn)支持內(nèi)耳細(xì)胞凋亡學(xué)說，認(rèn)為氧自由基、DNA損傷、炎性因子等均是觸發(fā)細(xì)胞凋亡和上、下游細(xì)胞信號通路改變的因素［5-7］。更多的研究也表明基因因素在鉑類藥物耳毒性機(jī)制中很可能起著重要作用［8-10］。隨著遺傳學(xué)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，許多基因敲除小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠逐漸被應(yīng)用于內(nèi)耳實驗研究中，小鼠也將成為研究鉑類藥物耳毒性機(jī)制及防治的重要實驗動物。國內(nèi)外學(xué)者們嘗試了多種方法來建立順鉑耳毒性小鼠模型，其中采用較多的是中劑量順鉑連續(xù)多次腹腔注射法，雖已有部分文獻(xiàn)報道順鉑3～5 mg/kg連續(xù)注射4 d以上，小鼠的客觀聽閾比治療前有提高［11-13］，但這些實驗結(jié)果多數(shù)治療前后的差異并不顯著，且缺乏內(nèi)耳膜迷路鋪片依據(jù)。而與此同時，有更多的文獻(xiàn)報道此方法并不能成功建立穩(wěn)定的順鉑耳毒性小鼠模型，此外，在多數(shù)研究中，接受連續(xù)累計較大劑量順鉑治療的小鼠，大多數(shù)很快就出現(xiàn)了腎臟毒性和神經(jīng)毒性，甚至死亡等［14-17］。小鼠內(nèi)耳組織似乎對順鉑有較強(qiáng)的抵抗性。根據(jù)前期實驗順鉑耳毒性損傷大鼠和灰鼠模型的成功建立經(jīng)驗，我們初步推測小鼠的內(nèi)耳血-迷路屏障很可能是導(dǎo)致其內(nèi)耳組織對順鉑抵抗性的重要原因之一。袢利尿劑之一的利尿酸可暫時性開放大鼠和灰鼠的血-迷路屏障［5，18］。但利尿酸只能通過靜脈注射給藥，在體積小、血管細(xì)小的小鼠上操作較難。呋塞米（速尿）也是常用的袢利尿劑，我們的前期實驗表明呋塞米200 mg/kg腹腔注射后1 h，小鼠的血管紋血-迷路屏障暫時性開放，24 h后血管紋細(xì)胞形態(tài)和功能均恢復(fù)正常［19］。Versnel等［20］報道呋塞米能顯著增強(qiáng)慶大霉素對小鼠的耳毒性，認(rèn)為其機(jī)制是呋塞米暫時性開放了內(nèi)耳血-迷路屏障。那么，呋塞米是否也能增強(qiáng)順鉑對小鼠的耳毒性？為此，我們在前期呋塞米暫時性開放血-迷路屏障的研究基礎(chǔ)上［19］，進(jìn)一步觀察到兩種很低劑量的順鉑（0.5和1.0 mg/kg），聯(lián)合呋塞米200 mg/kg一次腹腔注射后，結(jié)果引起小鼠的耳蝸外毛細(xì)胞的顯著損傷，具體結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

26只聽力正常的成年健康CBA/CAJ雄性大鼠（Jackson Lab，USA），年齡8～12周，體質(zhì)量25～33 g。所有動物實驗方案和治療操作等均得到美國紐約州立大學(xué)布法羅分校動物試驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 動物分組和實驗方案

20只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字法平分為2組，每組10只：①A組小鼠氣體吸入異氟醚全身麻醉（4%異氟醚誘導(dǎo)，1.0%～1.5%異氟醚維持）后，先行200 mg/kg呋塞米（Phoenix Pharmaceutical INC.St Joseph，MO USA）腹腔注射，1 h后再腹腔注射1.0 mg/kg的順鉑（Sigma P-4394）；②B組小鼠氣體吸入異氟醚全身麻醉后，先行200 mg/kg呋塞米腹腔注射，1 h后再腹腔注射0.5 mg/kg的順鉑。所有小鼠在腹腔注射順鉑后仍繼續(xù)吸入1.5%的異氟醚維持麻醉3 h，整個過程注意保持小鼠正常體溫；在治療當(dāng)天至治療后3 d，每只小鼠每天皮下注射生理鹽水1 mL，每天1次，并用四環(huán)素眼膏局部涂雙側(cè)眼瞼，每天2次，兩組小鼠均連續(xù)觀察10 d，在治療前、治療后第10天時，采用氣體吸入異氟醚全身麻醉后進(jìn)行聽性腦干反應(yīng)（auditory brainstem response，ABR）檢測和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（distortion product otoacoustic emission，DPOAE）檢查，完成最后一次客觀聽力檢測后動物立即斷頭，取其雙側(cè)耳蝸組織，40 g/L多聚甲醛溶液立即固定，一側(cè)耳蝸行全耳蝸基底膜鋪片，從蝸底到蝸尖計數(shù)全部內(nèi)外毛細(xì)胞，并繪制平均耳蝸圖；另一側(cè)耳蝸行環(huán)氧樹脂包埋半薄切片，染色后觀察毛細(xì)胞、血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)的病變情況。6只小鼠作為正常對照組，實驗開始前和開始后均全麻下進(jìn)行ABR和DPOAE檢測，10 d后安樂死，取雙側(cè)耳蝸組織，分別行全耳蝸基底膜鋪片和半薄切片。

1.3 客觀聽功能檢查

1.3.1 聽覺腦干電反應(yīng)測聽 所有小鼠在實驗開始前1周和治療結(jié)束后均全麻下進(jìn)行ABR檢測，ABR的整個檢測過程在均隔音室中進(jìn)行，動物先吸入4%的異氟醚誘導(dǎo)麻醉約3～5 min，之后持續(xù)吸入1.0%～1.5%的異氟醚維持麻醉，記錄電極插入顱頂雙側(cè)外耳道連線的中點(diǎn)處皮下，參考電極插入檢測耳的乳突皮下，接地電極插入對側(cè)耳乳突皮下。采用Tucker-Davis Technologies（TDT system，SigGen，F(xiàn)L，USA）的聲脈沖，經(jīng)交流、直流轉(zhuǎn)換后通過高頻揚(yáng)聲器分別輸出4、8、12、16、20和32 kHz的刺激聲（0.5 ms上升/下降期，無平臺期，21/s），刺激聲按照5 dB的強(qiáng)度級別逐漸遞減，輸入信號被放大50 000倍并疊加500次后再輸入電腦，并由TDT BioSig軟件控制記錄所獲得波形。揚(yáng)聲器與檢測耳的骨性外耳道口的距離為9 cm，測試時對側(cè)耳外耳道內(nèi)塞入硅膠模來避免或減輕對側(cè)耳感音后的電生理反應(yīng)。所有小鼠每次均記錄雙耳各頻率的聽閾以及各個頻率純音強(qiáng)度的Ⅲ波的振幅值。

1.3.2 畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射檢查 同樣，所有小鼠在實驗開始前1周和治療結(jié)束后均全麻下進(jìn)行DPOAE檢查。DPOAE檢測在隔音室中進(jìn)行，動物先吸入4%的異氟醚誘導(dǎo)麻醉約3～5 min后，再持續(xù)吸入1.0%～1.5%的異氟醚維持麻醉。帶有麥克風(fēng)和兩個傳導(dǎo)聲音的管子被塞入外耳道，2個HIS-3738高頻轉(zhuǎn)換頭（F1，F(xiàn)2）通過軟管置于外耳道內(nèi)，F(xiàn)1/F2=1.2，麥克風(fēng)的輸出口接Smart DPOAE的輸入端口，測試軟件為Smart OAE系統(tǒng)的畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射軟件4.53（Intelligent Hearing System，Miami，F(xiàn)L，USA），測試純音頻率為分別為4、8、12、16、20和 32 kHz，F(xiàn)1的刺激強(qiáng)度從80 dB開始，每5 dB遞減，最低35 dB SPL，F(xiàn)2的刺激強(qiáng)度比相應(yīng)的F1小10 dB。噪音區(qū)域是采用24 Hz的2F-F2。

1.4 組織病理學(xué)檢查

1.4.1 全耳蝸基底膜鋪片、耳蝸毛細(xì)胞計數(shù)及平均耳蝸圖 小鼠在治療后第10天全身麻醉完成ABR和DPOAE檢查后，立即采用頸部牽引的方法處死，斷頭，打開雙側(cè)聽泡，取出顳骨組織放入40 g/L的多聚甲醛溶液中固定，約24 h后再將顳骨浸入5%氯化氫溶液脫鈣8～12 h。左耳耳蝸行全耳蝸基底膜鋪片，在放大20倍的解剖顯微鏡下分離取出全耳蝸基底膜、球囊斑、橢圓囊斑和3個壺腹嵴。常規(guī)施行蘇木素染色并制備內(nèi)耳各終器鋪片，顯微鏡下觀察和計數(shù)從蝸底到蝸尖的全部內(nèi)外毛細(xì)胞，繪制平均耳蝸圖，在放大400倍的光學(xué)顯微鏡下，以目鏡中0.24 mm的顯微測微尺為測量尺度，逐個視野從蝸尖向蝸底進(jìn)行內(nèi)、外毛細(xì)胞計數(shù)。計數(shù)結(jié)果輸入到計算機(jī)并與軟件中預(yù)先設(shè)置的正常CBA小鼠耳蝸毛細(xì)胞參考數(shù)據(jù)相對比。耳蝸圖按照從頂回到底回每10%距離中內(nèi)外毛細(xì)胞損失的百分比被依次確立。右耳耳蝸行環(huán)氧樹脂包埋，玻璃刀切片機(jī)行半薄切片，染色后觀察毛細(xì)胞、血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)的病變情況。

1.4.2 耳蝸半薄切片 耳蝸組織用40 g/L的多聚甲醛溶液固定10～12 h后，用Decal（Baxter Scientific Products）脫鈣24 h，體積分?jǐn)?shù)70%、80%、95%、100%、100%的酒精和丙酮梯度脫水，用配制好的環(huán)氧樹脂膠EPON 812包埋，60℃恒溫箱干燥12 h，Reichert Super Nova microtome玻璃刀 2 μm半薄切片，5 g/L甲苯胺藍(lán)染色50 s，Zeiss Axioskop顯微鏡下觀察觀察血管紋上皮細(xì)胞的病理改變，40倍照相（Olympus PM-10ADS）。

1.5 統(tǒng)計方法

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組均數(shù)采用方差齊性檢驗和單因素方差分析，各組間兩兩比較采用One-way ANOVA，以P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

治療組20只小鼠，每組各10只分別接受了相應(yīng)的呋塞米和順鉑腹腔注射，A組第1天時和第3天時各有1只小鼠出現(xiàn)不進(jìn)食、少尿和雙眼干，行動遲緩；B組第2天時有2只小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重脫水和腎臟功能損傷。以上4只小鼠都被實施安樂死而淘汰。其余16只小鼠成活至用藥后第10天。A、B組小鼠的死亡率均為20%。正常對照組的6只小鼠均成活至實驗結(jié)束時。

2.1 ABR聽閾和振幅改變

A組（1.0 mg/kg cisplatin）和 B組（0.5 mg/kg cisplatin）的8只小鼠用藥前和用藥后第10天均全麻下進(jìn)行了ABR檢測，結(jié)果顯示兩組小鼠平均聽閾都比治療前提高，其中A組、小鼠各頻率（4、8、12、16、20、32 kHz）的平均聽閾閾值提高50 dB，B組小鼠各頻率的平均聽閾閾值提高20 dB（圖1）。A組各頻率ABR振幅明顯降低，B組僅8和32 kHz振幅中度降低（圖2）。正常對照組10 d后ABR聽閾和振幅無明顯變化。

圖1 不同劑量順鉑和呋塞米治療7 d后小鼠的ABR閾值變化Fig.1 ABR threshold change in the two groups of mice 7 d post treatment with different dose of cisplatin and furosemide

2.2 治療前、后DPOAE改變

圖2 順鉑和呋塞米治療后10 d兩組小鼠ABR振幅改變Fig.2 ABR amplitude changes in mice 10 d post cisplatin and furosemide treatment

A組和B組用藥后第10天的DPOAE檢測結(jié)果顯示兩組小鼠的A組小鼠在頻率為中高頻率（4、8、12 kHz）時的DP值都比治療前明顯降低，在超高頻率（16，20，32 kHz）時DP值不能引出，B組（0.5 mg/kg cisplatin）小鼠僅在頻率8和32 kHz時的DP值比治療前輕度降低，其余頻率DP值無明顯變化（圖3）。正常對照組10 d后DPOAE無明顯變化。

2.3 全耳蝸基底膜鋪片毛細(xì)胞定量圖

A、B兩組小鼠聯(lián)合應(yīng)用呋塞米和順鉑10 d后和耳蝸基底膜鋪片的結(jié)果如圖4所示，和正常對照組比較可見，兩組小鼠都出現(xiàn)耳蝸外毛細(xì)胞的損傷，蝸底損傷較重，蝸尖較輕。平均耳蝸圖示A組外毛細(xì)胞損傷從蝸底到蝸尖廣泛性損傷，蝸底外毛細(xì)胞損失平均超過80%，蝸尖約為30%；B組蝸底外毛細(xì)胞損傷較重，最大接近75%，蝸尖外毛細(xì)胞輕度損傷，平均缺失率為10%；兩組耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞無明顯損傷，數(shù)目正常（圖5）。進(jìn)一步對A、B兩組小鼠的耳蝸基底膜的不同部位（蝸尖、底回上部和底回下部）存活的外毛細(xì)胞數(shù)目與正常組作one-way ANOVA統(tǒng)計分析，結(jié)果示蝸尖處外毛細(xì)胞數(shù)目A組輕度減少，B組均接近正常值，底回上部A組顯著減少，B組輕度減少，底回下部A組幾乎完全損傷，B組明顯減少，A、B兩組和正常組比較蝸尖、底回上部、底回下部差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖6）。

2.4 血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞病變

耳蝸組織半薄切片結(jié)果顯示經(jīng)上述治療后，A、B兩組的小鼠的耳蝸蝸管外側(cè)壁血管紋細(xì)胞形態(tài)正常，而螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞密度亦和正常小鼠無明顯差異。說明1.0 mg/kg和0.5 mg/kg的順鉑和呋塞米聯(lián)合注射后進(jìn)入內(nèi)耳組織的有效藥物濃度尚且較低，不足以引起耳蝸蝸管外側(cè)壁的血管紋和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的病變。

3 討論

圖3 順鉑和呋塞米治療后10 d兩組小鼠DPOAE值Fig.3 DPOAE change in mice 10 d post cisplatin and furosemide treatments

圖4 小鼠耳蝸基底膜鋪片圖Fig.4 Surface preparation of basilar membrane of mice treated with cisplatin and furosemide

順鉑耳毒性動物模型已經(jīng)在大鼠、灰鼠和豚鼠上成功建立，但在小鼠上的建模卻經(jīng)過了很長時間的摸索，曾經(jīng)嘗試的建模方法主要有3種：①一次超大劑量（順鉑15～16 mg/kg）腹腔注射法；②中劑量（順鉑3～5 mg/kg）連續(xù)多次腹腔注射法；③圓窗膜局部給藥法。建模結(jié)果：方法①不僅未能造成小鼠的耳毒性損傷，還由于應(yīng)用超大劑量順鉑，實驗組小鼠大部分出現(xiàn)了嚴(yán)重腎臟和神經(jīng)毒副反應(yīng)而死亡［14-17］。方法②圓窗膜給藥法雖然具有給藥直接、用量少，安全度較高的特點(diǎn)，且文獻(xiàn)報道其建模成功率高，但這種造模方法并不能充分模擬臨床上順鉑靜脈滴注的給藥途徑［14-15］，故實際應(yīng)用的不多。方法③的研究報道最多，但造模結(jié)果卻差異很大，一部分報道建模成功，另一部分報告無效。因此，目前國內(nèi)外學(xué)者對此方法建模的成功率和穩(wěn)定性仍存在一定的爭議［11，14-17，21-22］，許多學(xué)者認(rèn)為小鼠的內(nèi)耳組織對順鉑的抵抗性要比大鼠、灰鼠和豚鼠的都強(qiáng)［14-17］。

圖5 順鉑聯(lián)合呋塞米治療后10 d兩組小鼠的平均耳蝸毛細(xì)胞損傷計數(shù)圖Fig.5 Average HC loss graph of two groups of mice 10 d post cisplatin and furosemide treatment

圖6 順鉑和呋塞米治療后10 d兩組小鼠耳蝸外毛細(xì)胞損傷數(shù)目統(tǒng)計圖Fig.6 Outer hair cells loss statistics in the two groups of mice 10 d post the cisplatin and furosemide treatment

小鼠內(nèi)耳組織對順鉑有很強(qiáng)抵抗性的具體原因還需要進(jìn)一步探索。我們初步推測原因之一是由于小鼠體質(zhì)量輕、體積小，而大劑量或中劑量順鉑連續(xù)注射后引起的腎毒性和神經(jīng)毒性往往是致命性的，因此實驗組小鼠總生存率很低。原因之二可能由于小鼠的內(nèi)耳血-迷路屏障的存在，使血液中的順鉑鉑離子能進(jìn)入內(nèi)耳外淋巴液中的量極少，尚不足以引起毛細(xì)胞等的損傷。

袢利尿劑和氨基糖甙類藥物合用，后者的耳毒性會明顯增強(qiáng)，根據(jù)這一現(xiàn)象，我們的早期實驗已經(jīng)對到袢利尿劑中的利尿酸鈉暫時性開放血-迷路屏障進(jìn)行了研究［5，18］，并在近期的研究中進(jìn)一步明確了呋塞米開放小鼠血-迷路屏障的可能機(jī)制和最佳時機(jī)［19］，結(jié)果表明，呋塞米200 mg/kg腹腔注射后1 h，小鼠的血-迷路屏障的重要組成部分——耳蝸外側(cè)壁的血管紋細(xì)胞受損并大部分壞死，此時血-迷路屏障開放，如果此時腹腔注射順鉑，即使注射的是很低劑量，但由于沒有了血-迷路屏障的阻擋，鉑離子進(jìn)入內(nèi)耳外淋巴液中的量將成倍增加，進(jìn)而引起內(nèi)耳毛細(xì)胞等的顯著損傷。我們本組實驗，采用很低劑量的順鉑（1和0.5 mg/kg），聯(lián)合呋塞米一次腹腔注射后，引起了小鼠大量外毛細(xì)胞的顯著損傷，研究結(jié)果從聽覺電生理學(xué)和組織病理學(xué)兩方面同時說明了小鼠順鉑耳毒性模型的成功建立。

盡管順鉑聯(lián)合呋塞米能促進(jìn)順鉑的耳毒性的作用機(jī)制目前尚不清楚，并且本身呋塞米的耳毒性研究報道也不少，如一些文獻(xiàn)認(rèn)為呋塞米可能是通過引起氧自由基增加和抗氧化酶的減少使來引起內(nèi)耳細(xì)胞損傷［23-24］。也正是考慮過兩種藥物同時使用時會相互影響，可能導(dǎo)致難區(qū)分耳毒性到底是何種藥物所致的，我們首先在前期呋塞米耳毒性的實驗中反復(fù)嘗試，找到了一個合適的呋塞米暫時性耳毒性的治療劑量，即200 mg/kg，依據(jù)是這個劑量一次腹腔注射后5 min，小鼠的ABR聽閾就開始升高，30～60 min聽力損傷達(dá)到重度，繼續(xù)觀察，6 h后聽閾又開始下降，到24 h后聽閾恢復(fù)到治療前水平。順鉑的劑量也是選用了十分安全的1和0.5 mg/kg的極低劑量，可以認(rèn)為一次腹腔注射后基本上沒有導(dǎo)致耳毒性的可能。也正是采用了兩種藥的安全劑量來聯(lián)合使用，才可能更好地說明聯(lián)合用藥的效果。

進(jìn)一步從藥物代謝動力學(xué)上分析，呋塞米用藥后5 min開始作用，持續(xù)時間2 h，對內(nèi)耳的主要作用在耳蝸外側(cè)壁血管紋，快速引起血管紋血供減低，血管紋內(nèi)多種細(xì)胞缺血腫脹，1 h左右損傷最重，6 h后損傷開始修復(fù)，24 h修復(fù)完成；而順鉑在呋塞米用藥后1 h才給藥，腹腔吸收入血大約30～60 min，此時剛好血-迷路屏障開放，鉑離子將大量進(jìn)入內(nèi)耳，順鉑對內(nèi)耳毛細(xì)胞的損傷是內(nèi)耳組織內(nèi)的劑量依賴型，腹腔注射后24 h以上，其在耳蝸組織內(nèi)濃度達(dá)到最高［11］，之后引起耳蝸毛細(xì)胞的損害，而此時呋塞米暫時性耳毒性已經(jīng)基本恢復(fù)了。因此，可初步認(rèn)為兩藥聯(lián)用時，呋塞米能起到增強(qiáng)順鉑的耳毒性反應(yīng)，具體表現(xiàn)為增加順鉑進(jìn)入內(nèi)耳的量。而順鉑則由于其作用時間比呋塞米的起效時間要晚很多，可基本上認(rèn)為其對呋塞米的耳毒性不會產(chǎn)生大的作用。

綜上所述，我們通過極低劑量順鉑聯(lián)合呋塞米一次腹腔注射法建立的順鉑耳毒性小鼠模型具有建模方便、操作安全快捷的優(yōu)點(diǎn)。利用這一動物模型，我們將進(jìn)一步從分子基因水平探索順鉑引起內(nèi)耳組織細(xì)胞損傷的凋亡機(jī)制。