CFTR對(duì)前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響

晉晨晨，杜潔儀，黃雪蓮，王冠蕾

（中山大學(xué) 1.中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室//心腦血管研究中心，廣東廣州510080；2.孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510120）

肥胖與2型糖尿病，心血管系統(tǒng)疾病，高血壓和癌癥密切相關(guān)，是當(dāng)今全球普遍性的公共健康問(wèn)題［1］。成熟的脂肪細(xì)胞缺乏增殖更新能力，而成年人脂肪細(xì)胞每年以10%的速率更新［2］，這主要是由脂肪組織中占15%～50%前脂肪細(xì)胞增殖、分化為成熟的脂肪細(xì)胞［3］。有研究表明病理性肥胖主要是由脂肪細(xì)胞體積肥大（adipocyte hypertrophy）導(dǎo)致；在肥胖人及小鼠（例如高脂飲食）過(guò)量能量攝入早期，白色脂肪組織的前脂肪細(xì)胞仍然有較高的增殖及分化能力。隨著肥胖進(jìn)展，前脂肪細(xì)胞分化能力下降，脂肪細(xì)胞肥大逐漸占據(jù)主導(dǎo)作用，脂肪組織發(fā)生慢性、低度炎癥，就能誘發(fā)胰島素抵抗［4］。因此，研究調(diào)控前脂肪細(xì)胞增殖和分化機(jī)制對(duì)防治肥胖及相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展十分關(guān)鍵。囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）可編碼 cAMP（3′-5′-cyclic adenosine monophosphate，cAMP）依賴激活的氯離子通道，CFTR單基因突變導(dǎo)致人類罕見(jiàn)遺傳疾病囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）的發(fā)生，主要影響呼吸道，腸道和生殖系統(tǒng)腺上皮功能［5］。研究發(fā)現(xiàn)CFTR可影響多種類型細(xì)胞的增殖和分化。CF病人及小鼠往往表現(xiàn)為身材瘦小，生長(zhǎng)遲緩，其機(jī)制與腸功能紊亂導(dǎo)致相關(guān)［6］。近來(lái)，研究還發(fā)現(xiàn)CFTR突變小鼠會(huì)造成肝新生脂肪合成能力顯著下降，提示CF小鼠脂質(zhì)更新能力下降。盡管研究也已發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成因子mRNA水平表達(dá)顯著下調(diào)［7］，這可能影響機(jī)體脂質(zhì)生成的過(guò)程。但CFTR在脂肪細(xì)胞數(shù)目更新中是否發(fā)揮作用？目前尚未報(bào)道。因此，本研究在CFTR全基因敲除小鼠，體外3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖分化模型和高脂飲食誘導(dǎo)肥胖早期模型上，探討基因干預(yù)CFTR對(duì)前脂肪細(xì)胞增殖和分化及脂滴形成的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分組

CFTR基因敲除小鼠（Cftrtm1UncTg（FABPCFTR）1 Jaw/J）購(gòu)于美國(guó) The Jackson Laboratory，品系為FVB/N，于中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心繁殖。SPF級(jí)C57 BL/6小鼠，雄性，4～5周齡，體質(zhì)量13～15 g，購(gòu)自中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并于中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，室溫20～25℃，自由取食和飲水。動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（粵）2016-029。將C57 BL/6小鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常飲食喂養(yǎng)0、2、4周組（n=12只/組），高脂飲食喂養(yǎng)0、2、4周組（n=12只/組）。喂養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)使用原則進(jìn)行脂肪組織分離前脂肪細(xì)胞及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另外，分別取4和8周齡CFTR基因敲除小鼠和同周齡野生型對(duì)照小鼠各12只進(jìn)行分離內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要材料

高脂飼料（美國(guó)Research Diets Inc.公司），低脂飼料（美國(guó)Research Diets Inc.公司），3T3-L1細(xì)胞株（美國(guó)ATCC公司），DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS）（美國(guó)Gibco公司），小牛血清（FCS；BI公司），胰島素，地塞米松，異丁基甲基黃嘌呤，MTT試劑盒（美國(guó)Sigma公司），抗體PPAR γ，SREBP-1，C/EBP α（美國(guó)Abcam公司），CFTR抗體（美國(guó)Novus公司），Trizol，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Green Master（美國(guó)Roche公司），CFX96 touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），PCR引物購(gòu)于上海英濰捷基公司，CFTR沉默病毒（AdshCFTR）購(gòu)于上海吉?jiǎng)P公司，CFTR過(guò)表達(dá)病毒（Ad-hCFTR）由美國(guó)John F.Engelhardt教授提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 前脂肪細(xì)胞的分離 取小鼠附睪及腎周的脂肪組織，剔除結(jié)締組織和小血管等，于前脂肪細(xì)胞分離消化液中剪碎，后恒溫?fù)u床37℃，150 r/min振蕩25 min，250目細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，4℃，500×g離心10 min。將所得前脂肪細(xì)胞重懸于含100 mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中［8］。

1.3.2 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 用含100 mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率至70%～80%時(shí)，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，將3T3-L1細(xì)胞以細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL接種于6孔板中。第2天細(xì)胞長(zhǎng)至融合，即細(xì)胞單層鋪滿，繼續(xù)培養(yǎng)2 d至達(dá)到接觸抑制。此時(shí)，采用含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入分化劑：地塞米松，異丁基甲基黃嘌呤，胰島素（dexamethasone-isobutylmethylxanthine-insulin，DMI）的分化誘導(dǎo)液（作為Day0）培養(yǎng)2 d，后用只含胰島素的分化誘導(dǎo)液（Day2）培養(yǎng)48 h。第4天換成只含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基至第8天，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓闹炯?xì)胞，并用顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)以及脂滴生成過(guò)程［8-9］。

1.3.3 免疫印跡法 細(xì)胞經(jīng)處理后提取蛋白裂解液。進(jìn)行蛋白定量后按每孔30 μg蛋白上樣于SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。室溫封閉1 h后，與相應(yīng)一抗抗體4℃孵育過(guò)夜，洗膜后與二抗室溫孵育1 h，ECL反應(yīng)顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-rad）下檢測(cè)，并對(duì)條帶灰度值進(jìn)行定量分析［10］。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR） 采用Trizol法提取總RNA，按照cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以GAPDH為內(nèi)參檢測(cè)，所用引物見(jiàn)表1。按照SYBR Green Master試劑盒操作說(shuō)明，于CFX96 touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，記錄每個(gè)反應(yīng)管中熒光信號(hào)到達(dá)閾值時(shí)經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Ct值），目的基因相對(duì)表達(dá)量按2-ΔΔCt法進(jìn)行分析［8，11］。

表1 RT-qPCR檢測(cè)的引物序列Table 1 The primer sequence of RT-qPCR

1.3.5CFTR沉默和過(guò)表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染 將約2×105個(gè)/mL細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，當(dāng)3T3-L1細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)，取800 μL無(wú)血清無(wú)抗生素的培養(yǎng)基稀釋CFTR沉默病毒Ad-shRNA（Ad-shCFTR）使其 MOI值為 200，Ad-shCFTR序列為：5′-CCGGGCTGAAAGCAGGTGGGATTCTCAAGAGAAATCCCACCTGCTTTCAGCTTTTTTG-3′；其對(duì)照為Ad-Scr-shRNA（Ad-Scr）；CFTR過(guò)表達(dá)病毒（AdhCFTR）MOI值為100，其對(duì)應(yīng)的空載病毒為Ad-Lac Z（Lac Z）。將800 μL稀釋后的病毒液加入培養(yǎng)皿，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后吸去培養(yǎng)基，加入正常培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，誘導(dǎo)分化。分化進(jìn)程第4天，再轉(zhuǎn)染一次以維持其效率［10，12］。

1.3.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 將3T3-L1細(xì)胞接種于96孔板中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒后，待細(xì)胞達(dá)到融合，加入DMI誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)48 h，后加入MTT試劑，培養(yǎng)4 h后棄上清。每孔加入150 μL DMSO，室溫震蕩10 min，用酶標(biāo)儀（Winooski，VT，USA）測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的光密度值。

1.3.7 油紅O染色檢測(cè)脂滴形成 誘導(dǎo)分化的第8天，移去細(xì)胞的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，40 g/L多聚甲醛于室溫固定3T3-L1細(xì)胞30 min，然后棄去40 g/L多聚甲醛，用冰PBS洗3次，加入0.5%的油紅O染色工作液于37°C烘箱孵育15 min，棄去油紅O溶液后，用70%異丙醇洗3遍，每次3 min，去除未著色的染料，倒置顯微下觀察并拍照記錄。后用100%異丙醇復(fù)溶，在酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處的光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad Prism 7.00軟件統(tǒng)計(jì)。數(shù)值數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)處理兩樣本間比較，數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊時(shí)采用t檢驗(yàn)；數(shù)據(jù)方差不齊時(shí)采用校正的t檢驗(yàn)。多組數(shù)據(jù)比較，呈正態(tài)分布且方差齊時(shí)采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多組數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義后，對(duì)于不同時(shí)間及處理組檢測(cè)結(jié)果和對(duì)照組比較采用Dunnett′st檢驗(yàn)；其他組間兩兩比較采用Bonferroni法進(jìn)行檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFTR基因敲除鼠內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞增殖和分化指標(biāo)下降

分離4周齡和8周齡CFTR基因敲除小鼠和同周齡野生型小鼠內(nèi)臟脂肪組織中前脂肪細(xì)胞，RT-qPCR結(jié)果顯示，與同周齡野生型小鼠（wild type littermates，WT）組相比，4周齡CFTR基因敲除小鼠（CFTRknockdown mice，CFTRKO）前脂肪細(xì)胞標(biāo)記物Pref-1（preadipocyte factor-1，Pref-1）表達(dá)明顯下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；圖1A，表2）。同時(shí)，前脂肪細(xì)胞增殖和 分化轉(zhuǎn) 錄 因子CyclinD1，PPAR γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ），C/EBP α（CCAAT/enhancer-binding protein α）和SREBP-1（sterol regulatory element-binding protein-1）均明顯下降（圖1A，表2）。8周齡時(shí)，相比于同周齡WT組，8周齡CFTRKO組增殖分化相關(guān)基因表達(dá)也明顯降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；圖1B，表2）。但是，在相應(yīng)的各周齡WT和CFTRKO組間 C/EBP β（CCAAT/enhancer-binding protein β）和FABP4（fatty acid binding protein 4）的表達(dá)差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A，B；表2）。

圖1 CFTR基因敲除小鼠內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞增殖和分化相關(guān)基因表達(dá)下降Fig.1 The mRNA levels of transcription factorsregulating preadipocyte proliferation and differentiation decreased in primary visceral preadipocytes from CFTR KO mice

2.2 3T3-L1細(xì)胞早期分化中CFTR的表達(dá)變化

如圖2所示，建立DMI誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化體外模型，采用免疫印跡法觀察DMI誘導(dǎo)后0～5 dCFTR蛋白水平表達(dá)變化。結(jié)果顯示，CFTR蛋白表達(dá)在DMI誘導(dǎo)0～5 d后明顯增加（F=4.099，P＜0.05），與DMI誘導(dǎo)第0天相比，第3天CFTR蛋白表達(dá)出現(xiàn)顯著增加（Day 3：2.12±0.65vs.Day 0：1.03±0.04，q=3.23，P=0.019）。同時(shí)，前脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1（F=55.35，P＜0.0001），PPAR γ（F=8.549，P＜0.001）和C/EBP α（F=39.47，P＜0.0001）表達(dá)均明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

表2 CFTR基因敲除小鼠內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞增殖和分化相關(guān)基因表達(dá)下降Table 2 The mRNA levels of transcription factors regulating preadipocyte proliferation and differentiation decreased in primary visceral preadipocytes from CFTR KO mice （）

表2 CFTR基因敲除小鼠內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞增殖和分化相關(guān)基因表達(dá)下降Table 2 The mRNA levels of transcription factors regulating preadipocyte proliferation and differentiation decreased in primary visceral preadipocytes from CFTR KO mice （）

WT-4W age：4-week-age-old wild type littermates；KO-4W age：4-week-age-old CFTR knockdown mice；WT-8W age：8-week-age-old wild type littermates；KO-8W age：8-week-age-old CFTR knockdown mice；n=6.1）P＜0.05 vs.WT-4W age group by Student′s t-test；2）P＜0.05 vs.WT-8W age group by Student′s t-test；3）By corrected t-test.

Groups WT-4W age KO-4W age t（t′）P WT-8W age KO-8W age t P Pref-1 1.00±0.32 0.28±0.531）2.808 0.019 1.00±0.49 0.34±0.462）2.379 0.038 CyclinD1 1.00±0.21 0.63±0.60 1.4163）0.21 1.00±0.47 0.29±0.412）2.725 0.021 C/EBP β 1.06±0.32 0.95±0.11 0.8353）0.44 1.00±0.33 0.86±0.21 0.820 0.43 PPAR γ 1.00±0.26 0.53±0.411）2.327 0.042 1.00±0.19 0.40±0.442）2.986 0.011 SREBP-1 1.00±0.31 0.70±0.22 1.913 0.084 1.00±0.27 0.62±0.282）2.301 0.044 C/EBP α 1.00±0.34 0.49±0.401）2.344 0.041 1.00±0.38 0.40±0.232）3.006 0.013 FABP4 1.00±0.29 1.05±0.34 0.279 0.786 1.00±0.30 0.83±0.18 1.058 0.32

圖2 在DMI誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化中CFTR蛋白表達(dá)增加Fig.2 The increase of CFTR protein expression in DMI-induced 3T3-L1 cell differentiation

2.3 CFTR對(duì)3T3-L1細(xì)胞早期增殖型分化的影響

為了特異性地研究CFTR基因?qū)η爸炯?xì)胞增殖和分化的影響，我們按照先前的研究制備了沉默CFTR的shRNA（Ad-shCFTR）和過(guò)表達(dá)CFTRcDNA（Ad-hCFTR）的腺病毒［11，13］。首先，在3T3-L1前脂肪細(xì)胞上檢測(cè)沉默和過(guò)表達(dá)CFTR基因腺病毒的感染效率。圖3A，B免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分別感染3T3-L1細(xì)胞Ad-shCFTR和Ad-hCFTR48 h后，可顯著抑制和增加CFTR蛋白表達(dá)。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染Ad-shCFTR組在濃度為200 MOI時(shí)可顯著抑制CFTR表達(dá)（Ad-shCFTR200 MOI組 0.54±0.25vs.對(duì)照組 1.00±0.19，q=2.765，P=0.039；圖3A）；而轉(zhuǎn)染Ad-hCFTR組在濃度為100 MOI時(shí)可顯著增加CFTR表達(dá)（AdhCFTR100 MOI組2.82±0.24vs.對(duì)照組1.00±0.34，q=7.452，P＜0.0001；圖3B），并且采用Ad-Scr-shRNA（Ad-Scr）和Ad-Lac Z（Lac-Z）分別作為基因沉默組和過(guò)表達(dá)組的陰性對(duì)照，對(duì)內(nèi)源性CFTR表達(dá)并無(wú)顯著性影響（圖3）。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采取上述病毒濃度。

圖3 沉默和過(guò)表達(dá)CFTR病毒在3T3-L1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率Fig.3 The efficiency of the shRNA and the overexpression adenovirus of CFTR on 3T3-L1 cells

隨后，分別采用Ad-shCFTR和Ad-hCFTR感染3T3-L1前脂肪細(xì)胞后，繼之以DMI誘導(dǎo)分化48 h。如圖4所示，RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，0 h時(shí)各處理組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而DMI誘導(dǎo)48 h后，早期分化增殖轉(zhuǎn)錄因子 C/EBP β，C/EBP δ（CCAAT/enhancer-binding protein δ），CREB（cAMP-response element binding protein）和KLF4（krüppellike factor 4）表達(dá)升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與DMI誘導(dǎo)分化48 h對(duì)照組相比，沉默CFTR的Ad-shCFTR能顯著抑制DMI誘導(dǎo)增強(qiáng)的早期分化轉(zhuǎn)錄因子C/EBP β，C/EBP δ，CREB和KLF4的 mRNA 表達(dá)（P＜0.05；圖 4）；而過(guò)表達(dá)CFTR的Ad-hCFTR進(jìn)一步促進(jìn)早期分化轉(zhuǎn)錄因子C/EBP β，C/EBP δ，CREB表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ad-hCFTR有促進(jìn)分化轉(zhuǎn)錄因子KLF4表達(dá)上升趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；圖4D）。

采用MTT檢測(cè)基因干預(yù)對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響，觀察DMI誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞克隆型增殖時(shí)期（0～48）h基因干預(yù)對(duì)增殖影響。圖5 MTT結(jié)果顯示，DMI誘導(dǎo)分化24 h時(shí)，與對(duì)照組相比，Ad-shCFTR組細(xì)胞增殖率明顯低于對(duì)照組（AdshCFTR組（118±7）%vs.對(duì)照組（150±14）%，q=3.901，P=0.0030）；而Ad-hCFTR組細(xì)胞增殖率明顯升高（Ad-hCFTR組（173±17%）vs.對(duì)照組（150±14）%，q=2.804，P=0.028）。Ad-shCFTR組在DMI誘導(dǎo)分化24～48 h明顯抑制細(xì)胞增殖活性，AdhCFTR組則促進(jìn)細(xì)胞增殖，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）；48 h時(shí)Ad-hCFTR組細(xì)胞增殖活性增加，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；圖5）。

2.4 CFTR對(duì)3T3-L1細(xì)胞分化末期的影響

圖4 沉默或過(guò)表達(dá)CFTR影響分化早期增殖型轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)Fig.4 Knockdown or overexpression CFTR altered the mRNA expression of proliferative transcription factors in early stage of differentiation

圖5 沉默或過(guò)表達(dá)CFTR影響3T3-L1細(xì)胞分化早期細(xì)胞增殖活性Fig.5 Knockdown or overexpression CFTR altered the cell viability in early stage of differentiation

前脂肪細(xì)胞分化末期的標(biāo)志性事件為脂質(zhì)形成（lipogenesis）。采用CFTR沉默和過(guò)表達(dá)病毒進(jìn)行基因干預(yù)后，以DMI分別誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞2，4，6 d后采用免疫印跡法檢測(cè)。圖6結(jié)果顯示，DMI誘導(dǎo)分化2 d，與同天Ad-Scr組相比，沉默CFTR組明顯抑制分化轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1表達(dá)（2Day-Ad-shCFTR組：1.43±0.27vs.2Day-Ad-Scr組：3.6±0.75，t'=6.657，P=0.0004）；DMI誘導(dǎo)分化4 d，與同天Ad-Scr組相比，沉默CFTR組明顯抑制分化轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1表達(dá)（4Day-Ad-shCFTR組：2.59±0.9vs.4Day-Ad-Scr組：5.77±1.94，t=3.628，P=0.0046）。DMI誘導(dǎo)分化4和6 d，分別與同天Ad-Scr組相比，Ad-shCFTR組明顯抑制 PPAR γ表達(dá)（4 Day：Ad-shCFTR組1.34±0.30vs.Ad-Scr組3.81±1.54，t'=3.834，P=0.011；6 Day：Ad-shCFTR組2.91±0.70vs.Ad-Scr組 6.3±2.5，t'=3.141，P=0.021）。而DMI誘導(dǎo)分化6 d時(shí)，與Ad-Scr組相比，Ad-shCFTR組明顯抑制C/EBP α表達(dá)（6 Day：AdshCFTR組 1.23±0.75vs.Ad-Scr組 1.97±0.31，t=2.232，P=0.0497），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6A）；而分別與同天Lac Z組相比，過(guò)表達(dá)CFTR則促進(jìn)之，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；圖6B）。

圖6 沉默和過(guò)表達(dá)CFTR抑制DMI誘導(dǎo)的分化轉(zhuǎn)錄因子的影響Fig.6 Effecr ofDMI-induced protein expression of transcriptional factors by CFTR shRNA knockdown and enhanced

同時(shí)，采用油紅O染色，檢測(cè)CFTR對(duì)分化末期（8 d）脂滴合成的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，沉默CFTR抑制DMI誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞脂滴形成（Ad-shCFTR：0.67±0.035vs.Control：1.00±0.038，q=9.255，P＜0.0001），而過(guò)表達(dá)CFTR則促進(jìn)之（Ad-hCFTR：1.24±0.063vs.Control：1.00±0.038，q=6.868，P＜0.0001），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001；圖7）。

2.5 高脂飲食肥胖小鼠模型早期前脂肪細(xì)胞CFTR基因表達(dá)增強(qiáng)

圖7 沉默和過(guò)表達(dá)CFTR對(duì)DMI誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞脂滴形成的影響Fig.7 Effect ofDMI-induced cellular lipid content by CFTR shRNA knockdown and enhanced

我們的上述研究結(jié)果顯示CFTR基因參與前脂肪細(xì)胞增殖分化，為進(jìn)一步明確CFTR對(duì)前脂肪細(xì)胞增殖和分化的影響，以及對(duì)肥胖的潛在影響。我們?cè)诟咧嬍撤逝中∈竽Ｐ蜕线M(jìn)行檢測(cè)，高脂飲食喂養(yǎng)2，4周后，分離正常對(duì)照組（normal chow diet，NC）和高脂飲食組（high fat diet，HFD）內(nèi)臟脂肪組織中前脂肪細(xì)胞，采用RT-qPCR檢測(cè)。圖8及表3結(jié)果顯示，高脂飲食喂養(yǎng)2周時(shí)，與同周數(shù)NC組相比，HFD組內(nèi)臟脂肪組織前脂肪細(xì)胞（primary visceral preadipocytes）增殖和分化轉(zhuǎn)錄因子 PPAR γ，C/EBP α，C/EBP β和 C/EBP δ在mRNA水平表達(dá)升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖8B～E；表3）；而末期分化指標(biāo)SREBP-1和FABP4稍有升高，高脂飲食喂養(yǎng)4周時(shí)，與同周數(shù)NC組相比，HFD組末期分化指標(biāo)SREBP-1和FABP4明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖8F，G；表3）。上述結(jié)果顯示，肥胖早期腹部?jī)?nèi)臟脂肪組織前脂肪細(xì)胞增殖分化能力是增加的，此時(shí)CFTR mRNA表達(dá)水平增加，在高脂飲食2周時(shí)HFD組明顯高于NC組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001；圖8A，表3）。

3 討論

脂肪細(xì)胞數(shù)目更新調(diào)控在肥胖早期維持脂肪組織功能穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用［2］。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，CFTR基因敲除鼠脂肪組織前脂肪細(xì)胞數(shù)目和分化能力明顯下降。同時(shí)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)沉默CFTR抑制前脂肪細(xì)胞早期增殖分化和末端進(jìn)程，過(guò)表達(dá)CFTR會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化。高脂飲食肥胖小鼠模型表明CFTR也可能參與肥胖早期前脂肪細(xì)胞增殖分化過(guò)程。

多種分化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控前脂肪細(xì)胞增殖和分化過(guò)程，包括C/EBP家族，PPAR家族，SREBP-1，Pref-1 及 CyclinD1［13］。本研究發(fā)現(xiàn) CFTR 基因敲除小鼠內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子及Pref-1和CyclinD1表達(dá)明顯下降，提示CFTR全基因敲除降低前脂肪細(xì)胞數(shù)目和分化能力。

前脂肪細(xì)胞分化可分為2個(gè)階段：早期克隆型增殖階段和末端分化階段［14］。本研究表明特異性敲除CFTR時(shí)間依賴性抑制前脂肪細(xì)胞增殖，抑制早期增殖分化轉(zhuǎn)錄因子（C/EBP β，C/EBP δ，CREB和KLF4）和末端轉(zhuǎn)錄因子（C/EBP α，PPAR γ和SREBP-1）表達(dá)，過(guò)表達(dá)則促進(jìn)之。CFTR也會(huì)影響脂滴形成，表明CFTR可能是通過(guò)影響前脂肪細(xì)胞早期分化，繼而影響后期脂滴形成進(jìn)程。綜上，CFTR可能通過(guò)影響前脂肪細(xì)胞增殖和分化，繼而影響肥胖早期脂肪細(xì)胞數(shù)目，在早期肥胖中發(fā)揮作用。

圖8 高脂飲食2，4周內(nèi)臟脂肪組織前脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子和CFTR基因水平表達(dá)升高Fig.8 The mRNA expression of differentiation transcriptional factors and CFTR increased in preadipocytes from epididymal white adipose tissue of mice fed with HFD for 2，4 weeks

表3 高脂飲食對(duì)內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子和CFTR基因水平的影響Table 3 Effects of high-fat diet on the mRNA expression of differentiation transcriptional factors and CFTR in preadipocytes from epididymal adipose tissue （）

表3 高脂飲食對(duì)內(nèi)臟前脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子和CFTR基因水平的影響Table 3 Effects of high-fat diet on the mRNA expression of differentiation transcriptional factors and CFTR in preadipocytes from epididymal adipose tissue （）

NC：normal chow diet group；HFD：high fat diet group.n=6，1）P＜0.05，2）P＜0.01，3）P＜0.001 and 4）P＜0.0001 vs.NC group in corresponding feeding period by Student′s t-test.

Groups NC-2weeks HFD-2weeks t P NC-4weeks HFD-4weeks t P CFTR 1.48±0.37 2.76±0.274)6.846＜0.0001 1.14±0.43 1.67±0.321)2.399 0.037 PPAR γ 1.15±0.47 2.41±0.363)5.251 0.0004 1.63±0.36 2.97±0.463)5.607 0.0002 C/EBP α 1.19±0.47 1.91±0.521)2.518 0.031 1.27±0.42 2.54±0.363)5.541 0.0002 C/EBP β 2.15±0.58 4.63±0.294)9.322＜0.0001 1.87±0.26 3.25±0.623)5.004 0.0005 C/EBP δ 1.98±0.47 3.98±0.544)6.847＜0.0001 1.74±0.38 2.57±0.422)3.569 0.005 SREBP-1 1.21±0.73 1.53±0.32 0.990 0.35 1.57±0.50 2.30±0.521)2.464 0.034 FABP4 1.25±0.55 1.61±0.38 1.311 0.22 1.40±0.56 2.84±0.413)5.052 0.0005

以往研究已證實(shí)由于腸道脂質(zhì)代謝紊亂，CF病人和小鼠個(gè)體表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕，身材矮小。Bederman等在其研究中已發(fā)現(xiàn)3周齡和6周齡CFTR敲除小鼠在體質(zhì)量，體長(zhǎng)，BMI，脂肪墊重量和其占體質(zhì)量百分比方面均明顯低于同周齡non-CF小鼠，并且認(rèn)為CFTR敲除小鼠體內(nèi)脂肪量減少與肝新生脂肪合成減少相關(guān)［7］。而我們的研究結(jié)果表明CFTR基因敲除小鼠前脂肪細(xì)胞數(shù)目和分化能力也減少，這可能是CFTR基因敲除導(dǎo)致脂肪組織質(zhì)量和體積減少的另一個(gè)機(jī)制。臨床發(fā)現(xiàn)CFTR基因突變個(gè)體易罹患糖耐量損傷，胰島素抵抗和2型糖尿病，其中的機(jī)制還未明確［15］。已發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者和肥胖動(dòng)物模型上脂肪組織伴隨著脂肪分化能力降低，脂肪細(xì)胞肥大，脂肪組織代謝功能障礙，可誘發(fā)胰島素抵抗［4］。我們研究發(fā)現(xiàn)CFTR基因敲除調(diào)控脂肪細(xì)胞分化能力，提示CFTR可能在病理性肥胖及其導(dǎo)致的代謝紊亂中起關(guān)鍵作用。高脂飲食肥胖小鼠模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持上述假設(shè)。但由于CFTR全基因敲除小鼠體質(zhì)量相對(duì)于野生型小鼠有顯著差異，因此如要闡明CFTR在病理性肥胖進(jìn)程中調(diào)控脂肪功能，需要應(yīng)用CFTR基因脂肪特異性敲除小鼠進(jìn)行更深入的研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CFTR基因敲除抑制前脂肪細(xì)胞增殖和分化，抑制脂質(zhì)生成，提示CFTR調(diào)控脂肪功能的重要性。