黃芩素對(duì)肥胖小鼠體脂及胰島素抵抗的作用研究

陳美珍，陳簡(jiǎn)慶，吳紅蓮

（恩平市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東恩平 529400）

隨著社會(huì)生活水平的提高，生活方式的改變，老齡人口增加等，腹型肥胖人群越來(lái)越多?，F(xiàn)大量有關(guān)代謝綜合征的研究均提示腹型肥胖和胰島素抵抗是其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的兩個(gè)起最大突出作用的危險(xiǎn)因素。肥胖時(shí)，機(jī)體脂肪增多，而又以內(nèi)臟脂肪增加更為顯著[1-2]。在肥胖患者，體內(nèi)脂肪的蓄積導(dǎo)致大量非酯化游離脂肪酸（nonesterified fatty acids）大量釋放，進(jìn)入血循環(huán)后，可作用胰島素靶器官（肝臟、脂肪組織、骨骼肌），導(dǎo)致胰島素抵抗形成。脂肪組織不僅是能量?jī)?chǔ)存庫(kù)，而且更是一個(gè)具有旁分泌、自分泌功能的內(nèi)分泌器官。它可以分泌大量前炎癥因子和脂源性的細(xì)胞因子（如脂聯(lián)素）參與胰島素抵抗形成和糖耐量異常的發(fā)生過(guò)程。但是，代謝綜合征定義尚未一致，同時(shí)其病情復(fù)雜，發(fā)病機(jī)理不明確，深入研究發(fā)病機(jī)制，可為臨床防治提供有益參考。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)天然化合物具有多種藥理作用，遠(yuǎn)較單一化合物作用廣泛，因此對(duì)天然化合物的開發(fā)和研究成為熱點(diǎn)，尤其是天然化合物在心血管領(lǐng)域的研究更為火熱。有關(guān)藥物研究顯示，黃芩素是黃酮類的化合物，是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的主要有效成份之一，具有如抗炎、清除氧自由基和保護(hù)心腦血管等多種藥理作用[3-4]。本實(shí)驗(yàn)研究采用高脂飼料誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠29 周，建立代謝綜合征疾病模型。從個(gè)體體重，肝臟、內(nèi)臟脂肪重量增加等方面評(píng)價(jià)小鼠肥胖狀態(tài)；用糖耐量實(shí)驗(yàn)、胰島素耐量實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)小鼠機(jī)體組織糖耐量降低，胰島素敏感性下降改變；檢測(cè)血脂評(píng)價(jià)小鼠脂代謝紊亂；病理組織形態(tài)學(xué)顯示小鼠肝臟脂肪空泡變性等方面揭示代謝綜合征疾病特征。同時(shí)從飼料中添加天然化合物黃芩素進(jìn)行干預(yù)對(duì)比研究，觀察并分析黃芩素對(duì)代謝綜合征的可能保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：9 周齡，C57BL/6 小鼠的雄性小鼠120只，購(gòu)自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物中心。所有實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于廣東醫(yī)學(xué)院SPF 級(jí)動(dòng)物房。溫度24±2 ℃，濕度40%～70%，每12 h交替照明,自由飲水進(jìn)食。

動(dòng)物飼料主要成分：AIN-76A 標(biāo)準(zhǔn)飼料（脂肪5.2，蛋白質(zhì)17.7，碳水化合物64.9）；PAIGEN 高脂飼料（脂肪15.8%，膽固醇1.25%，膽酸鈉0.5%，玉米油1%）；AIN-76A 標(biāo)準(zhǔn)飼料添加中藥黃芩素，藥物濃度為0.5；PAIGEN 高脂飼料添加中藥黃芩素，藥物濃度為0.5。所有飼料均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物中心合成，經(jīng)鈷60 照射處理，密封后冰箱保存。

實(shí)驗(yàn)所需藥物及試劑：黃芩素粉劑（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）；檸檬酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；中性胰島素注射液（400 IU/10mL/支）（丹麥諾和諾德公司）；10%醫(yī)用葡萄糖注射液（上海百特醫(yī)療用品有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：10 周齡,雄性C57BL/6 小鼠,共120只。采用高脂飼料誘導(dǎo)，建立C57BL/6 小鼠代謝綜合征模型。并給予中藥黃芩素干預(yù)，進(jìn)行對(duì)比觀察和研究。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具體分組如下：HFD 組(high fat diet group),給予PAIGEN 高脂飼料；HFD+0.5%Bacalein 組，給予已添加0.5%黃芩素的PAIGEN 高脂飼料飼養(yǎng)；NC 組（normal rodent chow group），用AIN-76A 標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)；NC+0.5%Bacalein 組，給予已添加0.5% 黃芩素的AIN-76A 標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)。以上各組C57BL/6 小鼠均為30只。

動(dòng)物飼養(yǎng)及終點(diǎn)取材：C57BL/6 小鼠于室溫24±2 ℃,濕度40%～70%喂養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。所有小鼠先普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)l 周，從小鼠第十周齡開始，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組開始正規(guī)投食，每周一次稱量小鼠食量；在實(shí)驗(yàn)開始6 周內(nèi)，每周均測(cè)量記錄小鼠體重，以后每?jī)芍芊Q量一次小鼠體重，直至小鼠喂養(yǎng)至29 周。在實(shí)驗(yàn)第23、24 周，小鼠禁食6 h后，分別行小鼠腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT）、腹腔注射胰島素耐量試驗(yàn)（IPITT)，評(píng)價(jià)小鼠胰島素抵抗。第29 周末小鼠在禁食8 h后，先稱量體重，采用無(wú)水乙醚吸入法麻醉小鼠，F(xiàn)isher 毛細(xì)玻璃采血管經(jīng)眼眶后靜脈叢刺入，采血約1.2 mL 室溫下靜置1～2 h，使血液自然凝固。4 ℃高速離心機(jī)離心分離血清，一部分血清送本院檢驗(yàn)科檢測(cè)血脂。在采血完畢后迅速頸椎脫臼法處死小鼠，快速分離出小鼠全部肝臟，PBS 溶液漂洗血液，用無(wú)菌紗布蘸干肝臟表面的液體后置于天平上稱量肝臟重量。同時(shí)按肝臟重量（g）/小鼠體重（g）×100，計(jì)算出肝臟指數(shù)。將肝組織在10%福爾馬林溶液中固定24 h，逐級(jí)脫水，石蠟包埋制成5 μm 切片，行HE 染色，以觀察肝臟脂肪病變情況。仔細(xì)完全分離出腸系膜、雙側(cè)腎周圍及雙側(cè)睪丸附近的白色脂肪組織，置于天平上稱量白色脂肪組織重量。同時(shí)按白色脂肪組織重量（g）/小鼠體重（g）×100，計(jì)算出脂肪指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高脂飼料飼養(yǎng)組小鼠肥胖狀態(tài)及血脂紊亂

2.1.1 小鼠體重動(dòng)態(tài)變化

從實(shí)驗(yàn)第5 周開始，與HFD 組比較，HFD＋0.5% Bacalein 組小鼠體重輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且一直保持至實(shí)驗(yàn)終末，未添加藥物的高脂飼料飼養(yǎng)小鼠明顯肥胖，見圖1。

圖1 小鼠體重動(dòng)態(tài)變化

2.1.2 小鼠腹圍、Lee’s 指數(shù)比較

各組小鼠腹圍比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明外周脂肪的增長(zhǎng)并不與代謝綜合征成平行相關(guān)。而小鼠Lee’s 指數(shù)比較，反映了HFD 組小鼠較為顯著的肥胖狀態(tài)，見表1。

表1 小鼠腹圍、Lee’s 指數(shù)比較

2.1.3 小鼠肝臟指數(shù)、內(nèi)臟脂肪指數(shù)比較

黃芩素可以降低高脂引起的肝臟重量增加，表現(xiàn)了良好的肝臟保護(hù)作用，黃芩素顯著降低內(nèi)臟脂肪，減輕肥胖癥狀，見表2。

表2 小鼠肝臟指數(shù)、內(nèi)臟脂肪指數(shù)比較（%）

2.1.4 小鼠血脂檢測(cè)

從血脂檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，黃芩素可以有效降低血總膽固醇和低密度脂蛋白濃度（P＜0.01），見表3。

表3 小鼠血脂（TC、LDL-C）檢測(cè)（mmol/l）

2.2 高脂飼料飼養(yǎng)組小鼠糖耐量調(diào)節(jié)受損和胰島素抵抗

2.2.1 空腹血糖（Fasting Blood Glucose,FBG）

空腹血糖檢測(cè)比較發(fā)現(xiàn)，HFD 組小鼠血糖水平與HFD＋0.5% Bacalein 組小鼠血糖水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 四組小鼠空腹血糖比較

2.2.2 小鼠腹腔注射葡萄糖耐量試驗(yàn)（Intraperitoneal injection of glucose tolerance test，IPGTT)

與HFD 組小鼠比較，HFD＋0.5%Bacalein 組小鼠在加入黃芩素干預(yù)后可以明顯改善由長(zhǎng)期高脂飲食引起的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，增強(qiáng)其糖耐量能力，曲線下面積（AUC）降低15.36%（P＜0.001），見表5。

表5 四組小鼠IPGTT曲線下面積（AUC）比較（mmol.min/l）

2.2.3 小鼠腹腔注射胰島素耐量試驗(yàn)（Intraperitoneal injection of insulin tolerance test，IPITT)

HFD 組與HFD＋0.5%Bacalein 組相比較，前組小鼠對(duì)外源胰島素的敏感性明顯降低，但加入黃芩素干預(yù)后可以明顯改善由長(zhǎng)期高脂飲食引起的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，增加對(duì)胰島素的敏感性，其曲線下面積（AUC）降低31.6%（P＜0.001），見表6。

表6 四組小鼠IPGTT 曲線下面積（AUC）比較

2.3 HE 染色顯示模型組小鼠肝臟組織脂肪變性

HFD 組小鼠肝臟HE 染色顯示，肝細(xì)胞脂肪脂滴浸潤(rùn)，發(fā)生明顯的空泡化，脂滴空泡融合成片狀，細(xì)胞核破壞成散碎片狀，著色淺。根據(jù)肝臟脂肪病變判斷標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估HFD 組小鼠的肝臟脂肪變性等級(jí)為3 級(jí)，約55%～60%的肝細(xì)胞發(fā)生了明顯脂肪變性。高脂飲食組小鼠的肝臟脂肪空泡變較HFD＋0.5%Bacalein 組小鼠肝臟變化非常明顯，后組小鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)完好，僅少量細(xì)胞有脂肪變性，胞核完整，染色較深，這充分說(shuō)明了黃芩素在保護(hù)肝細(xì)胞免受脂肪毒害有重要作用。而NC 組及NC+0.5%Bacalein 組之間比較無(wú)明顯異常，也充分說(shuō)明了黃芩素藥物本身對(duì)小鼠肝臟是沒有毒性作用的。

3 討論

代謝綜合征是一種表現(xiàn)復(fù)雜的臨床綜合征，主要包括胰島素抵抗、腹型肥胖（或稱中心型肥胖、內(nèi)臟型肥胖）、血脂異常、高血壓、非酒精性脂肪肝病等。本研究認(rèn)識(shí)到在所有相關(guān)危險(xiǎn)因素中，異常肥胖（尤其是腹型肥胖）、胰島素抵抗是與代謝綜合征發(fā)生發(fā)展有關(guān)的、兩個(gè)主要的危險(xiǎn)因素?，F(xiàn)代社會(huì)物質(zhì)生活水平的提高、生產(chǎn)工作方式極度轉(zhuǎn)變，肥胖人群數(shù)量劇增，再加上老齡人群的不斷擴(kuò)大，同時(shí)，流行病學(xué)顯示代謝綜合征患者的心血管疾病、2 型糖尿病的發(fā)生率分別是正常人的2 倍，5倍[5]，可見其防治愈顯關(guān)鍵。但由于其病情復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制在當(dāng)前研究尚未明確，因此深入研究十分必要。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病模型是完全采用長(zhǎng)期高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)下建立的，其疾病形成類似人類在自然狀態(tài)下發(fā)生。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)小鼠在喂養(yǎng)29 周后，高脂飼料飼養(yǎng)組小鼠肥胖狀態(tài)非常明顯，其終末體重為（40.95±1.03）g,內(nèi)臟脂肪重量（3.26±0.26）g，而高脂飼料添加黃芩素飼養(yǎng)組小鼠，其終末體重為（35.87±0.93）g,內(nèi)臟脂肪重量（1.94±0.17）g。兩組小鼠終末體重，內(nèi)臟脂肪重量比較差異非常顯著（P＜0.01）。說(shuō)明了黃芩素有效對(duì)抗高脂飲食引起的肥胖，減少內(nèi)臟脂肪形成。

圖2 各組小鼠第26 周肝臟行染色后的病變變化情況(HE×200)

許多臨床和研究證據(jù)證實(shí)[6-7]，腹部脂肪堆積、增多導(dǎo)致各種代謝異常，如糖耐量異常、高血脂。同時(shí)，腹型肥胖和胰島素抵抗與高血壓、2 型糖尿病、非酒精性脂肪肝（NAFLD）發(fā)生密切相關(guān)。因此有人指出，腹型肥胖是代謝綜合征的重要起始因子。

小鼠在長(zhǎng)期高脂飲食的誘導(dǎo)下是否發(fā)生糖耐量異常和胰島素抵抗，本實(shí)驗(yàn)行糖耐量和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)和評(píng)估?？崭寡潜容^，HFD 組小鼠血糖水平低于HFD＋0.5% Bacalein 組小鼠（P＜0.05）。推測(cè)與禁食時(shí)間較長(zhǎng)（6 h），由于HFD＋0.5%Bacalein 組小鼠肝臟病變較輕，不存在肝臟糖原合成、儲(chǔ)備功能障礙。當(dāng)饑餓時(shí)，大量的肝臟糖原可以及時(shí)代償性的大量釋放，引起血糖上升，而HFD 組小鼠存在脂肪肝?。ㄔ诟闻K組織形態(tài)學(xué)HE染色已得到證實(shí)），糖原合成、儲(chǔ)備減少所致。IPGTT 及血糖曲線下面積（AUC）結(jié)果顯示，高脂組小鼠血糖值明顯高于其他各組，且血糖峰值在腹腔注射葡萄糖液15 min 后出現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)第120 min，標(biāo)準(zhǔn)飲食組及加黃芩素干預(yù)組小鼠血糖均已降低至空腹前水平，但此時(shí)高脂飲食組小鼠由于明顯的血糖耐量受損而血糖值下降延遲,加黃芩素干預(yù)的高脂飲食組小鼠血糖曲線下面積（AUC）降低15.36%(P＜0.001)，可見，黃芩素有效調(diào)節(jié)血糖代謝，明顯改善糖耐量。IPITT 結(jié)果與糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，高脂飲食組及加黃芩素干預(yù)組小鼠血糖值也均高于標(biāo)準(zhǔn)飲食組及加黃芩素干預(yù)組，前兩組小鼠血糖曲線谷值處在30 min時(shí)，在實(shí)驗(yàn)2 h后，兩組小鼠血糖值均高于空腹基礎(chǔ)血糖水平，表明均存在胰島素抵抗。但高脂飲食加黃芩素干預(yù)組血糖值，血糖曲線下面積均低于單純高脂飼養(yǎng)組(P＜0.001)，充分說(shuō)明小鼠糖耐量調(diào)節(jié)受損存在，胰島素抵抗明顯。說(shuō)明黃芩素也較好地改善了胰島素抵抗。

在高脂飲食或肥胖時(shí)，胞外信號(hào)和胞內(nèi)刺激如氧化應(yīng)激[8]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等均可以激活I(lǐng)KKβ/NF-kB信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生及釋放增加[9]。而炎癥因子TNF-α、IL-6 等可通過(guò)作用于胰島素受體底物絲氨酸磷酸化，也就相應(yīng)的阻止了正常情況下的酪氨酸磷酸化而使胰島素PI3-K 這條代謝通路受損，促成胰島素抵抗[10]。此外，大量脂肪組織釋放出FFAs 入血，由于高濃度的血清FFAs 可增強(qiáng)葡萄糖6-磷酸酶活性，抑制了肝臟糖原的合成、儲(chǔ)備，還可作用于胰島素代謝通路，影響肝臟葡萄糖內(nèi)攝，導(dǎo)致輸出增加。這在胰島素的另一靶組織骨骼肌也同樣產(chǎn)生胰島素抵抗[11-12]。

對(duì)于黃芩素改善胰島素抵抗，調(diào)節(jié)血糖耐量保護(hù)作用，這可能與它改善高脂引起的游離脂肪酸、前炎癥因子如TNF-α、IL-1β、IL-6 等大量釋放，促進(jìn)具保護(hù)性的脂聯(lián)素合成、分泌，拮抗胰島素的靶器官胰島素抵抗有關(guān)。黃芩素是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的主要有效成份之一，具有多種藥理作用，如抗炎、清除氧自由基和保護(hù)心腦血管等作用[13]。盡管現(xiàn)沒有查閱到任何黃芩素在代謝綜合征中的抗炎研究，但是在慢性炎癥或腦創(chuàng)傷，急性胰腺炎等[14-15]研究中，通過(guò)有效降低TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子，均顯示了強(qiáng)大的抗炎效應(yīng)和保護(hù)作用。因此，本研究推測(cè)黃芩素很有可能是通過(guò)抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子表達(dá)發(fā)揮改善胰島素抵抗效應(yīng)，并調(diào)節(jié)異常血糖代謝。

高脂或肥胖時(shí)，隨著大量脂肪組織引起的游離脂肪酸大量釋放。在肝臟，游離脂肪酸導(dǎo)致葡萄糖，甘油三酯和VLDL 的分泌增加以及包括HDL-C 減少和LDL 增加在內(nèi)的脂質(zhì)，脂蛋白異常。本實(shí)驗(yàn)血脂檢測(cè)結(jié)果顯示，高脂飼料飼養(yǎng)組小鼠TC,LDL-C水平明顯高于高脂飼料飼養(yǎng)加黃芩素組（P＜0.01），提示小鼠血脂紊亂顯著。病理形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)一步也證實(shí)了血脂檢測(cè)結(jié)果的可靠性，高脂飼料飼養(yǎng)組小鼠肝臟組織HE 染色顯示，肝細(xì)胞脂肪脂滴浸潤(rùn)，發(fā)生明顯的空泡化，成片狀脂肪空泡，細(xì)胞核破壞成散碎片狀，著色淺。而加黃芩素的高脂飼料飼養(yǎng)組小鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)完好，僅少量細(xì)胞有脂肪變性，胞核完整，染色較深。黃芩素對(duì)抗高脂的肝臟毒性作用，推測(cè)可能主要與它本身具有抗脂質(zhì)氧化的能力相關(guān)。有研究報(bào)道，黃芩素能夠抑制大鼠肝臟微粒體，線粒體內(nèi)的鐵依耐的脂質(zhì)過(guò)氧化，能保護(hù)磷脂酰膽堿脂質(zhì)體膜免受脂質(zhì)氧化損傷。而且進(jìn)步研究分析提示，黃芩素是脂氧合酶抑制劑，其抗氧化能力主要與A,C 環(huán)上的羥基集團(tuán)的數(shù)量和位置有關(guān)。此外有研究報(bào)道[2]，黃芩素通過(guò)下調(diào)PDGF-β 受體，可以抑制肝臟星形細(xì)胞的激活及增殖，可在非酒精性肝病終末期肝硬化形成過(guò)程發(fā)揮抗纖維化，保護(hù)肝臟作用。

4 結(jié)論

本研究用高脂飼料飼養(yǎng)誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠，形成典型的腹型肥胖；機(jī)體組織糖耐量下降，胰島素敏感性顯著降低，明顯的糖、脂代謝紊亂；病理組織形態(tài)學(xué)提示肝臟發(fā)生顯著脂肪空泡變性，呈非酒精性脂肪肝病病變等，揭示了代謝綜合征的基本特征，同時(shí)運(yùn)用黃芩素進(jìn)行干預(yù)對(duì)比研究，對(duì)代謝綜合征作用顯示了較強(qiáng)的保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能就是圍繞以下兩個(gè)方面展開:①黃芩素作用于環(huán)氧化酶和抑制炎癥信號(hào)通路中樞NF-KB 途徑，減少炎癥因子TNF-α,IL-1β、IL-6 等產(chǎn)生和釋放，顯示了強(qiáng)大的抗炎效應(yīng)，也就很好的改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，有效減輕肥胖；②黃芩素可以有效清除大量?jī)?nèi)臟脂肪堆積形成的ROS、自由基及抑制游離脂肪酸釋放，調(diào)節(jié)糖代謝，增強(qiáng)胰島素靶器官的胰島素敏感性。