葛根增效丹參在腦缺血再灌注中的保護(hù)作用研究

馬和碩 ，呂 杰 ，劉 淼，鐘順杰，張婷婷，彭 超，羅禮容

（西南醫(yī)科大學(xué)：1臨床醫(yī)學(xué)本科2016級；2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000）

缺血性腦血管病（ischemic ceebral vascular disease，ICVD）是指大腦中的血液供應(yīng)障礙，從而相應(yīng)血供區(qū)域缺血、缺氧，導(dǎo)致腦組織壞死、軟化，引起短暫或永久性損傷。其機(jī)制復(fù)雜，目前抗腦缺血藥物的作用無法取得理想效果[1]。丹參作為傳統(tǒng)活血化瘀藥具有廣泛的生物活性并且其在腦缺血再灌注損傷治療中的作用日益受到關(guān)注。研究表明，丹參及其主要活性物質(zhì)能夠改善血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物活性從而減輕缺血再灌注損傷[2]。

丹參與葛根配伍能夠有效治療血瘀并主要用于心腦血管疾病，有研究表明，丹參配伍葛根能夠更好的改善血瘀大鼠的血液流變性[3]。葛根屬代表性風(fēng)藥有醫(yī)者認(rèn)為祛風(fēng)藥在血瘀證的治療中具有重要意義。風(fēng)藥在很多方面能夠增強(qiáng)活血化痰藥的療效，尤其是頭部和肌肉上的血瘀往往非用風(fēng)藥難獲佳效[4]。

本課題擬采用現(xiàn)代手段建立大鼠MCAO 模型并進(jìn)行相預(yù)，初步證明丹參可以對腦缺血再灌注損傷起到一定保護(hù)作用并且葛根可以增強(qiáng)丹參在腦缺血再灌注損傷中的保護(hù)功效，并通過檢測VEGF 的變化，探討這種增效作用的機(jī)制，為腦缺血再灌注損傷的防治提供新的配伍與臨床治療思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

材料清潔級240 g雄性SD大鼠60只（重慶騰鑫科技），MCAO 線栓（北京西濃科技有限公司2432A2），TTC 染液（上海信裕），10%水合氯醛（上海恒遠(yuǎn)）兔抗大鼠VEGF（武漢博士德），山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），丹參，葛根。

1.2 方法

1.2.1 分組

采用隨機(jī)分組的方法將60只SD雄性大鼠分成6 組，MCAO 模型組丹參組、葛根組、雙藥組，對照組、假手術(shù)組。

1.2.2 給藥

①葛根組：取葛根100 g 放入水中，浸泡20 min后分兩次水煎,用文火慢慢熬煎，頭煎從湯沸后再熬45 min，濾出藥湯；二煎則在沸后再煮25 min，兩次湯液混合均勻，濃縮至水煎劑與生藥比為1：1，存入4 ℃冰箱保存[5]。②丹參組：稱取丹參100 g按上述方法配置水煎劑。③雙藥組：以1∶1 的比例稱取雙藥各100 g，充分混合、重復(fù)上述方法。丹參組術(shù)后給予丹參水煎劑，按照每公斤體重，給予于相當(dāng)于生藥5 g的水煎劑，給藥7 d，每日灌喂一次。葛根組按上述給藥方法給藥葛根水煎劑。雙藥組按上述給藥方法給藥混合水煎劑。其余各組每天喂食5 mL 生理鹽水，灌喂7 d。

1.2.3 MCAO模型制造

根據(jù)林軍[6]等總結(jié)的MCAO線栓經(jīng)驗(yàn)采用改良線栓栓塞法制作大鼠MCAO模型。按每公斤體重4 mL使用10%水合氯醛腹腔注射法麻醉大鼠。自大鼠頸部中線處行手術(shù)切口，向右側(cè)分離皮下組織與肌層，游離右側(cè)頸總動脈（CCA）后，沿CCA上行游離頸內(nèi)動脈（ICA）與頸外動脈（ECA）并結(jié)扎ECA與CCA近心端（不結(jié)扎翼腭動脈）后自CCA插入栓塞線，栓塞線標(biāo)記處約位與ECA、ICA分叉處（18～20 mm），固定栓塞線，分層縫合。栓塞兩小時后抽出栓塞線。

1.2.4 檢測指標(biāo)

1.2.4.1 神經(jīng)功能評分

采用經(jīng)典Longa 評分方法，正常為0 分，提起尾巴無法伸展對側(cè)前爪評為1 分，行走時向一側(cè)轉(zhuǎn)圈評為2分，傾倒評為3分，意識水平下降，不能自發(fā)行走評為4分。

1.2.4.2 測定梗死面積

大鼠深度麻醉，斷頭取腦，去小腦低位腦干，-21℃冷凍20 min 后，將剩余部分冠狀面切成厚薄相同的6 片后置于2%TTC 溶液中，37 ℃恒溫染色25 min，拍照，采用IPP 6.0 圖像分析軟件分析圖像，計(jì)算梗死面積。

1.2.4.3 免疫組化發(fā)檢測VEGF表達(dá)

使用4%多聚甲醛固定大鼠腦組織并存放至蔗糖中（沉底）后使用OTC包埋。冰凍后切片，切片厚度約為0.2 cm。切片后將組織用丙酮浸泡25 min，PBS反復(fù)沖洗3次。置于甲醛（30 mL）、PBS（10 mL）、30%H2O2（0.5 mL）混合液中浸泡15 min，PBS沖洗3次。先加入兔抗大鼠VEGF 抗體（1∶1 000），置于室溫6 h后PBS沖洗，再加入山羊抗兔二抗置于室溫1 h，PBS 沖洗、顯色、脫水、透明后中性樹膠封片后置于高倍顯微鏡下，隨機(jī)選取2個視野，讀取VEGF陽性細(xì)胞個數(shù)，取平均數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分比較

與假手術(shù)組比較，MCAO 組神經(jīng)損傷程度明顯提高（P＜0.05）。與模型組比較，丹參組，葛根組神經(jīng)評損傷程度均有所下降（P＜0.05）；雙藥組大鼠與丹參組相比,神經(jīng)評分明顯下降（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死面積的比較(±s)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死面積的比較(±s)

注：a表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b表示與MCAO模型組比較，P＜0.05；c表示與相丹參組比較，P＜0.05

2.2 大鼠腦梗死面積比較

除對照組與假手術(shù)組外，各組大鼠右側(cè)腦組織均出現(xiàn)明顯蒼白色梗死灶。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠切片梗死區(qū)域明顯（P＜0.05）；丹參組、葛根組大鼠與模型組大鼠相比，梗死面積均有所減少（P＜0.05），葛根組與丹參組之間不存在明顯差異（P＞0.05）。雙藥組大鼠與模型組大鼠相比，梗死面積下降（P＜0.05）；雙藥組大鼠與丹參組大鼠相比梗死面積下降（P＜0.05）見表1，圖1。

圖1 各組大鼠腦梗死情況

2.3 免疫組化發(fā)檢測VEGF表達(dá)結(jié)果：

各組大鼠均存在VEGF 表達(dá)，對照組與假手術(shù)組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與對照組與假手術(shù)組比較，模型組、丹參組、葛根組與雙藥組VEGF 表達(dá)均升高（P＜0.05）；雙藥組VEGF 陽性表達(dá)明顯高于丹參組（P＜0.05）見表2。

表2 大鼠缺血部位VEGF表達(dá)（±s）

表2 大鼠缺血部位VEGF表達(dá)（±s）

注：a表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；b表示與模型比較，P＜0.05；c表示與丹參組比較，P＜0.05

3 討論

腦缺血，即腦血液供給不足，局部氧供應(yīng)下降，能量代謝失衡所導(dǎo)致的腦組織損傷，較長時間的腦缺血會導(dǎo)致腦神經(jīng)細(xì)胞壞死，這種壞死是不可逆的[7-8]。目前臨床上治療腦缺血的首要原則是即時進(jìn)行再灌注治療，恢復(fù)缺血部位的血供。然而，目前研究表明，當(dāng)腦缺血再灌注發(fā)生時會誘導(dǎo)大量氧自由基引起脂質(zhì)過氧化加速并誘發(fā)局部炎癥反應(yīng)，從而加重腦組織損傷[9-11]。因此，尋找減輕腦組織損傷或在缺血再灌注中提供保護(hù)作用的方法成為新的要求。經(jīng)過大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與臨床研究后發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方能夠通過多種靶點(diǎn)與通道發(fā)揮作用，在預(yù)防和治療腦缺血再灌注損傷方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，其臨床應(yīng)用前景廣闊。作為傳統(tǒng)的血瘀藥，丹參，因其療效較好，不良反應(yīng)輕已廣泛運(yùn)用于臨床治療。當(dāng)前研究表明丹參可以抑制細(xì)胞凋亡，緩解炎癥反應(yīng)，抗氧化應(yīng)激損傷和血小板聚集抑制，同時改善血腦屏障病理性開放[12],同時，基礎(chǔ)研究及臨床試驗(yàn)均表明，丹參可以在腦缺血再灌注期間保護(hù)腦組織[13]。但是，這種保護(hù)作用尚不足以在臨床實(shí)踐中起到理想的保護(hù)效果[14]，因而本研究旨在尋找對丹參這種保護(hù)作用增效的方法，并研究其增效程度是否能夠取得理想效果。

丹參配伍葛根不僅符合李東垣所創(chuàng)升陽化瘀法而且符合風(fēng)藥對活血化瘀藥功效的增效作用，同時現(xiàn)代研究表明，葛根（pueraria）的主要成分葛根（pueraria lobata）和葛根素（葛根素）可引起血管舒張；丹參的主要成分丹參酮則具有改善血液循環(huán)并且提高機(jī)體缺氧耐受能力的作用，二者配伍，葛根能夠促進(jìn)血管的運(yùn)動而丹參主要作用于血液本身，促進(jìn)血液循環(huán)，消除血液淤滯，確保血管通暢[15]。通過本次研究發(fā)現(xiàn)，丹參葛根配伍后能夠?qū)Φ⒌哪X缺血再灌注保護(hù)起到顯著的增效作用其神經(jīng)損傷與腦梗死面積均明顯降低。

另外，丹參能夠改善內(nèi)皮祖細(xì)胞活性，它還激活PI3-K/AKT 途徑以防止腦缺血再灌注損傷[16]。通過檢測VEGF 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，丹參葛根配伍可以促進(jìn)VEGF表達(dá)的上調(diào)。而VEGF表達(dá)上調(diào)可能與AKT/mTOR/Hif-1α信號通路表達(dá)有關(guān)該信號通路是與內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移、歸巢相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過促進(jìn)骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢至缺血腦組織區(qū)，促進(jìn)該區(qū)域血管再生[17]。其中雷帕霉素（mtor）具有促進(jìn)血管生成的作用，它可以作為Hif-1α上游，調(diào)控其mRNA合成與蛋白質(zhì)表達(dá)，從而促進(jìn)血管發(fā)生[18-19]同時蛋白激酶B（AKT）可以直接調(diào)節(jié)Hif-1α與VEGF蛋白的表達(dá)，也可以作為mTOR 的上游因子，啟動mTOR表達(dá)[20]。而葛根也可以激活A(yù)KT相關(guān)信號通路，因此可推測，這種保護(hù)作用以及葛根丹參配伍所起到的增效機(jī)制很可能與AKT/mTOR/Hif-1α信號通路有關(guān)。但由于本課題組經(jīng)費(fèi)限制，未能做進(jìn)一步研究

本次研究發(fā)現(xiàn)了丹參葛根配伍能夠?qū)Φ⒌哪X缺血再灌注后保護(hù)作用起到明顯的增效作用，是否與AKT/mTOR/Hif-1α信號通路有關(guān)，有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

丹參葛根配伍能夠促進(jìn)VEGF 表達(dá)上調(diào)，減輕缺血再灌注損傷大鼠腦梗死灶面積，證實(shí)葛根能夠增效丹參在腦缺血再灌注中的保護(hù)作用。在一定程度上證實(shí)了風(fēng)藥對活血化瘀藥功效的增效，有利于臨床應(yīng)用。