HtrA對(duì)乳牙變異鏈球菌產(chǎn)酸、黏附的體外研究

王 玲，劉 瑤，韓林秀，劉興容

(西南醫(yī)科大學(xué):1口頜面修復(fù)重建與再生實(shí)驗(yàn)室，2附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科,四川瀘州 646000；3四川省交通運(yùn)輸廳公路局醫(yī)院口腔科)

乳牙齲是兒童最常見的口腔疾病，第四次全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示5歲兒童乳牙齲患率為70.9%，其中經(jīng)過充填治療的牙齒比例僅為4.1%[1]，可見我國兒童乳牙存在患齲率高而就診率低的狀況。多項(xiàng)研究[2-4]證實(shí)，兒童唾液中變異鏈球菌濃度與乳牙齲壞嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性。其致齲性主要毒力因子包括：產(chǎn)酸耐酸能力、在牙面定植形成生物膜的能力、合成胞內(nèi)及胞外多糖的能力等[5-6]。絲氨酸蛋白酶是變異鏈球菌的致齲關(guān)鍵酶，由HtrA基因編碼的HtrA蛋白作為一種熱休克蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶家族重要成員。前期實(shí)驗(yàn)已篩選出的乳牙變異鏈球菌HtrA 高毒力株的致齲性高于其他臨床分離株[7]，同時(shí)利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建的HtrA 缺陷株的轉(zhuǎn)化力減低，進(jìn)而使其毒力出現(xiàn)了下降[8]。本次研究目的擬在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，比較HtrA高毒力株與HtrA 缺陷株產(chǎn)酸能力、體外黏附能力的差異，為HtrA 基因?qū)θ檠雷儺愭溓蚓慢x性調(diào)控研究提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

乳牙變異鏈球菌HtrA 高毒力株(前期課題組篩選完成)；乳牙變異鏈球菌HtrA 缺陷株（前期課題組構(gòu)建完成）；變異鏈球菌國際標(biāo)準(zhǔn)株UA159（簡(jiǎn)稱UA159標(biāo)準(zhǔn)株）（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院國家級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.1.2 主要試劑

BHI液體培養(yǎng)基、BHI固體培養(yǎng)基（北京Solarbio科技有限公司）、羥基磷灰石粉末（上海邁坤化工有限公司）、熒光染料2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(6)-carboxyfluorescein,acetoxymethyl Ester（BCECF/AM，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、NaOH粉末（四川西隴化工有限公司）。

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、熒光酶標(biāo)儀、Thermo Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo 賽默飛公司）、雷磁PHSH-3F 型精密酸度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的復(fù)蘇、培養(yǎng)及鑒定

將凍存的乳牙變異鏈球菌HtrA 高毒力株和HtrA缺陷株復(fù)蘇，經(jīng)革蘭染色形態(tài)學(xué)及生化鑒定為純培養(yǎng)后，分別接種BHI瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h 增菌，酶標(biāo)儀調(diào)節(jié)菌液吸光度OD600=1.0，備用。

1.2.2 生長曲線測(cè)定

將HtrA 高毒力株和HtrA 缺陷株的菌液（OD600=1.0）與BHI 液體培養(yǎng)基分別按總體積比為5%:95%的比例加入試管內(nèi)，每組18管，37 ℃厭氧培養(yǎng)16 h，期間每隔2 h從兩組中各取2管菌液放置于4 ℃冰箱保存，直至16 h。各樣本震蕩混勻后各取200 uL 加入96 孔板，每管樣本取2 次，酶標(biāo)儀測(cè)OD600值并做好記錄。

1.2.3 產(chǎn)酸能力測(cè)定

將HtrA高毒力株和HtrA缺陷株的菌液（OD600=1.0）與pH4.5～7.0（0.5 為間隔）的BHI 液體培養(yǎng)基分別以體積比為1:10的比例接種，每組菌株相同pH設(shè)置三份，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，3 000 r/min 離心15 min，移取上清液，酸度計(jì)測(cè)定上清液終末pH 值，取三組均值，計(jì)算ΔpH（初始pH-終末pH）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。

1.2.4 黏附能力測(cè)定

1.2.4.1 細(xì)菌懸液的標(biāo)記

分別取500 μL 菌液（OD600=1.0）HtrA 高毒力株和HtrA缺陷株的菌液于試管中，再分別加入1.5 mL PBS 緩沖液和3 μL 熒光染料BCECF/AM，放入37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)2 h，進(jìn)行熒光標(biāo)記。標(biāo)記完成后，3000 r/min 離心5 min，PBS 洗滌。將洗滌好的兩組細(xì)菌分別重懸于37 ℃的PBS緩沖液中，酶標(biāo)儀調(diào)節(jié)菌液OD600=1.0，分裝于96孔板中，備用。

1.2.4.2 唾液包被的羥基磷灰石的制備

量取50 mg 羥基磷灰石粉末，懸浮于10 mL 0.2 mol/L的NaOH溶液中，處理10 min，超純水洗滌直到上清液pH接近7.0，靜置使粉末沉淀，小心吸棄上清液，沉淀放入烘箱60 ℃過夜干燥。收集同一健康志愿者進(jìn)食4 h后的無刺激性唾液30 mL，12 000 r/min離心20 min，收集上清液，無菌微孔濾膜過濾除菌。按照羥基磷灰石粉末：唾液=1 mg：200 μL的比例混勻，37 ℃恒溫放置1 h，2000 r/min離心5 min，移除上清液，沉淀即包被完成的羥基磷灰石。

1.2.4.3 黏附實(shí)驗(yàn)

在96 孔板中加入包被完成的羥基磷灰石粉末1 mg，標(biāo)記后的菌株200 μL，混合均勻。其中HtrA高毒力株和HtrA 缺陷株各3 個(gè)孔。37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)30 min。小心吸棄上清液，PBS 緩沖液輕柔洗滌沉淀1 次，PBS 緩沖液使沉淀重新懸浮，熒光酶標(biāo)儀分別測(cè)定兩組細(xì)菌熒光值，即為黏附菌的熒光值。將只加入羥基磷灰石粉末和PBS緩沖液的相應(yīng)對(duì)照孔作為陰性對(duì)照，將未加入羥基磷灰石粉末，只含標(biāo)記菌液的相應(yīng)對(duì)照組熒光值作為總的熒光值。在熒光酶標(biāo)儀上設(shè)置激發(fā)波長為485 nm、發(fā)射波長為535 nm，測(cè)定各孔的熒光值，以減去陰性對(duì)照后的值作為測(cè)定的熒光值。

黏附率公式如下：

細(xì)菌黏附率=（黏附細(xì)菌的熒光值-陰性對(duì)照熒光值）/（總的熒光值-陰性對(duì)照熒光值）×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 生長曲線測(cè)定

兩組菌株革蘭氏染色油鏡下（×1 000）形態(tài)分別如圖1、2 所示。在非應(yīng)激環(huán)境下，兩組菌株在0～4 h 的生長趨勢(shì)和生長速度基本一致（P＞0.05），在4 h 及以后，HtrA 高毒力株的菌液濃度均高于HtrA缺陷株，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖1 HtrA高毒力株（×1 000）

圖2 HtrA缺陷株（×1 000）

圖3 兩菌株生長曲線的比較

2.2 產(chǎn)酸能力測(cè)定

在pH 為6.5 和7.0 時(shí)，兩菌株均能產(chǎn)酸，產(chǎn)酸能力沒有明顯不同，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在pH 值6.0、5.5、5.0 時(shí)，HtrA 缺陷株產(chǎn)酸能力弱于HtrA 高毒力株，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在pH值4.5時(shí)，HtrA缺陷株和HtrA高毒力株的產(chǎn)酸能力均受到明顯抑制，幾乎不產(chǎn)酸，其差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.3 黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

變異鏈球菌HtrA 缺陷株在唾液包被的羥基磷灰石表面的黏附率顯著低于HtrA 高毒力株（P＜0.05），見圖4。

表1 不同pH值下HtrA缺陷株和HtrA高毒力株的產(chǎn)酸能力的比較（±s，n=6）

表1 不同pH值下HtrA缺陷株和HtrA高毒力株的產(chǎn)酸能力的比較（±s，n=6）

圖4 兩菌株在唾液包被的羥基磷灰石表面的黏附率的比較（P＜0.05）

2.4 熒光顯微鏡下兩菌株黏附觀察

如圖5、6 所示，A、D 分別為熒光顯微鏡下缺陷株和高毒力株在羥基磷灰石表面的黏附情況，B、E分別為普通光鏡下同一視野觀察，C、F 為熒光顯微鏡和普通光鏡觀察圖片合并的情況，可見HtrA缺陷株在羥基磷灰石粉末表面的黏附比例少于HtrA 高毒力株。

3 討論

在齲病病因?qū)W的研究中，大量證據(jù)表明細(xì)菌是齲病發(fā)生發(fā)展先決條件，而變異鏈球菌是口腔齲病中最重要的致齲菌，一直以來都是各國學(xué)者齲病防治研究的一個(gè)熱點(diǎn)。有研究[9-10]表明包括變異鏈球菌在內(nèi)的多數(shù)鏈球菌中，HtrA基因位于染色體復(fù)制起始點(diǎn)附近，包含有與染色體復(fù)制和細(xì)菌增殖有關(guān)的DnaA 蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在非應(yīng)激條件下，HtrA基因缺失對(duì)乳牙變異鏈球菌高毒力株增殖速度產(chǎn)生了一定影響。因此推測(cè)HtrA 基因缺失影響了乳牙高毒力變異鏈球菌染色體的復(fù)制過程從而影響了它的生長增殖速度。變異鏈球菌在長期進(jìn)化過程中形成了多種途徑代謝碳水化合物產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸[11]，有機(jī)酸持續(xù)作用于牙釉質(zhì)表面，導(dǎo)致牙釉質(zhì)軟化脫礦。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在酸性環(huán)境下，HtrA基因缺失降低了乳牙高毒力株變異鏈球菌產(chǎn)酸能力。Biswas 等[9]的研究顯示HtrA 基因缺陷可能影響烯醇酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）的表達(dá)，這兩種酶都是與糖酵解有關(guān)的細(xì)胞外酶。由此可以推測(cè)，HtrA是通過影響糖酵解過程中相關(guān)的酶，從而影響了細(xì)菌產(chǎn)酸的能力。

變異鏈球菌對(duì)牙面的黏附是形成牙菌斑的前提和致齲的重要條件，主要包括蔗糖依耐性黏附和非蔗糖依耐性黏附兩種途徑[12]。致齲菌對(duì)牙面的蔗糖非依賴性黏附,實(shí)際上是細(xì)菌表面的黏結(jié)素與獲得性膜中受體成分的特異性結(jié)合[13]。致齲菌對(duì)牙面的蔗糖依耐性黏附與葡聚糖介導(dǎo)的細(xì)菌黏附和聚集相關(guān)，并且葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase，GTF）和葡聚糖結(jié)合蛋白（glucan binding protein，GBPs）是與該過程相關(guān)的主要蛋白。Ahn 等[14]的研究表明在變異鏈球菌中只存在一個(gè)HtrA基因，且其對(duì)變異鏈球菌生物膜形成起重要調(diào)控作用。GTF利用蔗糖合成具有黏性的非水溶性葡聚糖來介導(dǎo)變異鏈球菌蔗糖依耐性黏附，GTF 還可進(jìn)入早期獲得性膜并合成葡聚糖，給GBPs 提供結(jié)合位點(diǎn)，直接影響變異鏈球菌的初始黏附過程[15]。李政等[16]研究表明變異鏈球菌HtrA缺陷株GTF的表達(dá)高于HtrA高毒力菌株，但是其生物學(xué)活性弱于HtrA高毒力菌株，推測(cè)HtrA基因可能不是簡(jiǎn)單影響GTF 的產(chǎn)量，而是影響了GTF 向細(xì)菌表面的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)，HtrA 基因可能對(duì)GTF 等蛋白的折疊發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本研究中HtrA 缺陷株在唾液包被的羥基磷灰石表面的黏附率低于HtrA 高毒力株，原因可能是HtrA蛋白作為一種蛋白酶和分子伴侶，對(duì)蔗糖依耐性黏附途徑中GTFs 和GBPs 等重要蛋白的折疊和胞內(nèi)向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起重要調(diào)節(jié)作用，HtrA 基因缺陷導(dǎo)致HtrA 蛋白表達(dá)異常，從而影響了變異鏈球菌的黏附能力。

4 結(jié)論

本研究表明HtrA 基因缺陷會(huì)影響乳牙變異鏈球菌的生長、產(chǎn)酸及黏附能力，但其具體影響機(jī)制還需進(jìn)一步研究。