高速逆流色譜結(jié)合半制備型液相色譜分離茶樹紫芽花色苷研究

張 拓，劉林峰，林 玲，周 陽，肖文軍,2，龔志華＊

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410128；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128）

花色苷是一類具有2-苯基苯并吡喃基本母核結(jié)構(gòu)的植物次生代謝產(chǎn)物，具有調(diào)節(jié)糖脂代謝、提高免疫、清除自由基、抗氧化等多種生物活性[1-4]，是近年天然產(chǎn)物開發(fā)利用領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。茶樹芽葉出現(xiàn)紫化主要是由茶樹種質(zhì)、發(fā)育特性及其生長環(huán)境條件等因素所引起的花色苷含量顯著增加的抗逆生理表現(xiàn)。在傳統(tǒng)茶葉加工中，由于以紫色芽葉加工而成的茶產(chǎn)品在干茶色澤、湯色及葉底等品質(zhì)因子上呈紫色，被認(rèn)為不適于茶葉加工而造成大量浪費(fèi)。隨著紫芽茶樹花色苷研究的深入以及健康意識的增強(qiáng)，茶葉花色苷的高值化利用越來越受到業(yè)界的關(guān)注。然而，由于茶葉原料中花色苷含量較低，且存在多種花色苷組分，從而使得制備高純度的花色苷及其組分難度較大。目前分離純化植物花色苷的技術(shù)方法主要有柱層析法、高速逆流色譜法、半制備型高效液相色譜法和反相高效液相色譜法等，如申芮萌等[5]采用葡聚糖Sephadex LH-20凝膠層析柱分離純化藍(lán)莓中的花色苷，并優(yōu)化了分離花色苷的最佳緩沖液濃度、流速以及上樣量等條件；曹少謙等[6]采用柱層析法分離純化血橙中的花色苷，篩選出最佳的大孔樹脂，同時(shí)對工藝進(jìn)行優(yōu)化；于澤源等[7]采用大孔樹脂-中壓柱層析分離純化藍(lán)莓花色苷，其純度為90.88%；劉雪輝等[8]、陸英等[9]利用高速逆流色譜技術(shù)研究了玫瑰茄和紫甘薯中的花色苷分離純化工藝，并對工藝進(jìn)行優(yōu)化；SAITO T[10]采用色譜法研究紅芽茶樹中花色苷的分離工藝；以及以半制備型高效液相色譜法和反相高效液相色譜技術(shù)來分離純化花色苷[11]，但大多研究局限單一技術(shù)方法分離純化花色苷，結(jié)合不同分離技術(shù)的方法分離純化茶葉花色苷及其組分的研究鮮見報(bào)道。本研究以茶樹紫色芽葉為材料，經(jīng)酸性乙醇避光浸提、萃取脫脂、陽離子交換樹脂吸附等初步分離，探究了高速逆流色譜結(jié)合半制備型液相色譜制備高純茶葉花色苷組分的工藝技術(shù)，以期為茶樹紫色芽葉及其花色苷的開發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 茶葉與試劑

茶樹鮮葉：采摘湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)長安實(shí)踐教學(xué)基地高花色苷茶樹品系自選9803的一芽二葉茶鮮葉，經(jīng)冷凍干燥、粉碎后得茶葉粉末，低溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

藥品試劑：乙腈、甲醇（色譜純）、甲醇、無水乙醇（分析純）、天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；正己烷、乙酸乙酯（分析純）、國藥集團(tuán)化學(xué)試劑制造有限公司；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-葡萄糖苷：北京譜析科技有限公司；飛燕草素-葡萄糖苷：西寶生物科技（上海）股份有限公司；超純水：自制；酸性乙醇水溶液：自制；鈉型732陽離子交換樹脂：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

超聲波清洗器，KQ2200B型，昆山超聲儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)，MODULYOD-230型，Thermo Fisher Sciebti fic，美國；色譜分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），C18 ECOSIL HPLC COLUMN型，日本ECOSIL公司；紫外可見分光光度計(jì)，UV754N型，德國Thermo Scienti fic公司；SPD-20A型紫外檢測器；Unitary C18反相色譜柱 (10 mm×250 mm，5 μm)；高效液相色譜儀，A20型，日本Shimazu公司；精密電子天平，AE240型，瑞士Starorius公司；pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多公司；超低溫冰箱，美國Thermo公司；水浴鍋，DSY-2-8型，北京國華醫(yī)療器械廠；高速逆流色譜（內(nèi)徑1.6 mm，容積 280 mL，轉(zhuǎn)速 0～1000 r/min），TBE-300A 聚四氟乙烯柱，上海同田公司；制備型高效液相色譜儀，LC-8A 型，日本Shimadzu Corporation公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SY-2000型，上海榮亞生化儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 茶樹紫芽花色苷的提取

取茶樣干粉21.96 g，花色苷提取條件參考文獻(xiàn)[12-14]，設(shè)置為：料液體積比1∶25、80%乙醇（加1%冰醋酸）、室溫避光浸提24 h、提取兩次，合并兩次浸提液，蒸發(fā)濃縮至膏狀后獲得提取物保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 脫脂

取茶樣干粉13.60 g，配置正己烷∶乙酸乙酯∶水混合溶劑（1∶1∶2，V/V/V），對茶樣提取液進(jìn)行萃取脫脂處理,萃取至有機(jī)層無色為止，收集脫脂液，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 離子交換樹脂分離

以1.3.2得到的脫脂液為上樣液，經(jīng)鈉型732陽離子交換樹脂[15-16]吸附，樹脂前處理方法參照馬淑青等[15]，上樣液pH 值為3、上樣液流速為5 BV/h[17-18]，吸附至飽和為止；吸附完成后分兩次洗脫, 第一次洗脫：采用80%乙醇溶液洗脫，洗脫液流速3 BV/h，洗脫液合并收集10 BV濃縮至1 BV去有機(jī)相，得到濃縮液I，HPLC檢測分析濃縮液I的濃度；第二次洗脫：依次采用2 BV不同比率4%鹽酸-乙醇溶液洗脫，洗脫液流速3 BV/h，洗脫梯度為50%、60%、70%、80%、90%，按乙醇濃度分別收集洗脫液，2 BV合并濃縮至1 BV去有機(jī)相，得濃縮液Ⅱ，HPLC檢測分析濃縮液Ⅱ的濃度。

1.3.4 大孔樹脂除酸

離子交換樹脂的第二次洗脫液濃縮后經(jīng)D101大孔樹脂吸附樹脂去除鹽酸，濃縮收集液、冷凍干燥得到紫芽茶樹花色苷粗品粉末，粉末用甲醇溶解，HPLC檢測并計(jì)算粗品總花色苷純度（參照1.3.7）。

1.3.5 高速逆流色譜溶劑體系篩選與分離

按表1設(shè)計(jì)不同溶劑體系方案，按比例配置10 mL體系溶液。振蕩混勻后待靜置分層，移取3 mL下相加入少量上述花色苷粉末，再用3 mL上相萃取，分別檢測萃取前后花色苷組分的峰面積，各組分的分配系數(shù)（K值）計(jì)算方法參考文獻(xiàn)陳田等[19]，篩選最佳溶劑體系。

選取表1中最佳溶劑體系方案，高速逆流色譜分離參數(shù)參考文獻(xiàn)[8,19]：將最佳溶劑體系靜置12 h，兩相分離后超聲脫氣30 min。上相作固定相，下相作流動相，將固定相以20 mL/min的流速泵滿管路，然后以850 r/min正轉(zhuǎn)，流速2 mL/min的條件泵入流動相，溫度25℃，檢測波長280 nm。取20 mL下相溶解花色苷500 mg，進(jìn)樣20 mL后采集數(shù)據(jù)。根據(jù)高速逆流色譜峰峰型、保留率P和流出液情況判斷分離效果。根據(jù)色譜分步收集 110～130 min、138～159 min、251～271 min、280～299 min 時(shí)的流出物，合并相同化合物的流出液，減壓濃縮溫度為40℃，冷凍干燥備用。取少量干粉甲醇溶解，經(jīng)HPLC進(jìn)樣檢測。

1.3.6 半制備高效液相色譜制備花色苷及其組分的條件優(yōu)化

表1 不同溶劑體系設(shè)計(jì)方案Table 1 Designs of Different solvent systems

將高速逆流色譜法得到干粉用甲醇溶解，參考上述高效液相色譜條件，采用C18制備柱（20 mm×250 mm，10 μm），在波長 280 nm、柱溫30℃的條件下，控制其他條件不變，分別探究不同流動相、不同流速、不同進(jìn)樣量、不同梯度洗脫方案對花色苷分離效果的影響[20]，方案設(shè)計(jì)如表2，確定最佳色譜條件，根據(jù)色譜圖分別收集不同組分，各組分收集濃縮后做二次進(jìn)樣分離。

表2 不同條件方案Table 2 Designs of Different condition scheme

1.3.7 花色苷含量分析方法

待檢測樣品液經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過膜，高效液相色譜分析方法參照劉林峰等[21]，每次進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣3次，按以下公式[7,22]計(jì)算樣品液中花色苷含量。

式中：c為花色苷標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg / mL）；m0為花色苷標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量（g）；v0為標(biāo)準(zhǔn)品體積（mL）；A1為標(biāo)準(zhǔn)品峰面積；A0為花色苷峰面積；ω為總花色苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（μg / g）；A3為花色苷峰面積；v1為待測樣品體積（mL）；m1為待測樣品質(zhì)量（g）；P 為花色苷得率（mg / g）；m2為總花色苷質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取、脫脂、離子交換柱色譜與大孔樹脂分離對花色苷得率的影響

萃取結(jié)果和離子色譜分離結(jié)果如表3。樣品粗提的條件為避光，提取后得率5.64 mg/g；再經(jīng)過有機(jī)相萃取脫脂處理、陽離子交換樹脂層析后，得率提升；對樹脂層析處理后的花色苷分析檢測，其純度為20.38%，說明其中含有較多的雜質(zhì)。

表3 前處理工藝結(jié)果Table 3 Result of pretreatment processes

2.2 高速逆流色譜最佳溶劑體系的篩選

目標(biāo)組分在兩相溶劑體系中的分配系數(shù)K值[8]影響高速逆流色譜法的分離效果，K值偏大則出峰耗時(shí)過長，目標(biāo)組分峰型變寬變矮，組分之間的分離度R較差；而K值偏小，各組分在固定相中的保留時(shí)間較短，出峰過快，導(dǎo)致流出組分難以分離。不同配比的溶劑體系的K值如表4所示，組別1、2、3、6中單個(gè)組分K值較大，組別4、5組分之間的K值相差較小，組分不能完全分離，篩選后確定組別7為最佳溶劑體系。

表4 不同溶劑體系的K值及分離度R值Table 4 K value and resolution R value in different solvent systems

在以乙酸乙酯-正丁醇-乙腈-0.1%三氟乙酸水（8∶35∶13∶60）為最佳的溶劑體系中，雜質(zhì)峰與目標(biāo)組分峰分離效果良好，保留率為56.8%，各組分在固定相中保留時(shí)間較長，可有效分離。收集流出液，經(jīng)檢測計(jì)算，以樹脂吸附處理后的花色苷濃縮物為樣品，經(jīng)高速逆流色譜分離后，總花色苷得率達(dá)到160.59 mg/g。以高效液相色譜檢測流出液，得到物Ⅰ和Ⅱ，物質(zhì)Ⅰ主要是黃酮類物質(zhì)，而物質(zhì)Ⅱ主要是花色苷類物質(zhì)，總花色苷純度達(dá)到43.64%，將交換樹脂層析后的粗品純度提高一倍左右，由此可見，通過高速逆流色譜法可以分離出花色苷粗制品中黃酮類雜質(zhì)，并有效提高花色苷粗制品純度，適用于花色苷的純化工藝。

2.3 半制備型高效液相色譜法條件優(yōu)化

2.3.1 梯度洗脫篩選

通過調(diào)節(jié)各梯度的兩相組成、梯度的變化速率，從而影響目標(biāo)組分的分離效果。控制流動相為Ⅱ、流速為10 mL/min、進(jìn)樣量為1 mL，考察梯度洗脫方案的結(jié)果如圖1所示，方案a出峰時(shí)間較晚，耗時(shí)較長；方案b、c出峰時(shí)間均提前，方案c出峰最早。相比于方案b的分離效果，方案c可實(shí)現(xiàn)各花色苷組分的有效分離，且實(shí)驗(yàn)消耗的流動相最少，故選擇方案c用于后續(xù)研究。

2.3.2 洗脫流速篩選

在半制備高效液相色譜制備花色苷及組分過程中，流速會影響溶質(zhì)、色譜柱和流動相之間的相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致目標(biāo)組分保留時(shí)間的變化。一般來說，隨著流速的持續(xù)增加，色譜分辨率有降低的趨勢，而且過高的流速對于制備柱壽命的負(fù)面影響較大?？刂屏鲃酉酁棰?、梯度洗脫方案為c、進(jìn)樣量為1 mL，考察流速方案的結(jié)果如圖2所示，流速從5 mL/min增加到10 mL/min，出峰時(shí)間提前，耗時(shí)減?。浑S流速增大至20 mL/min，出峰時(shí)間進(jìn)一步提前，但分離度明顯下降，峰型變差，無法有效達(dá)到分離的目的，綜合后選擇5 mL/min的低流速作為較優(yōu)的洗脫流速方案。

圖1 不同洗脫程序方案分離花色苷的HPLC色譜圖Fig. 1 HPLC Chromatograms of different elution procedure

圖2 不同洗脫流速分離花色苷的HPLC色譜圖Fig. 2 HPLC Chromatograms of different elution fl ow rate

2.3.3 進(jìn)樣量篩選

適當(dāng)增加單次進(jìn)樣量的優(yōu)點(diǎn)在于節(jié)約時(shí)間，減少流動相消耗，但進(jìn)樣量過大，會出現(xiàn)柱壓過載、分離度下降的問題?？刂铺荻认疵摲桨笧閏、流動相為Ⅱ、流速為5 mL/min，考察進(jìn)樣量的結(jié)果如圖3所示，進(jìn)樣量為0.5 mL時(shí)，分離效果較差，而進(jìn)樣量為2 mL時(shí)，出峰時(shí)間較晚，且分離度不如1 mL進(jìn)樣量時(shí)的分離效果，故選擇1 mL為最優(yōu)進(jìn)樣量方案。

2.3.4 流動相篩選

控制梯度洗脫方案為c、流速為5 mL/min、進(jìn)樣量為1 mL，以甲醇為有機(jī)相的方案Ⅰ不能將花色苷組分有效分離，方案Ⅱ出峰較早，且分離效果優(yōu)于方案Ⅰ，而方案Ⅲ出峰時(shí)間雖較晚，但分離度較方案Ⅱ高，在保證分離度的前提下，綜合三個(gè)方案，最終選擇方案Ⅲ為最優(yōu)流動相。

2.3.5 花色苷組分的制備

將高速逆流色譜純化后的花色苷在甲醇中溶解，按上述篩選獲得的最優(yōu)色譜條件：C18柱（20×250 mm，10 μm）制備柱，波長 280 nm，流動相1%醋酸(A)-乙腈(B)、梯度洗脫（0～55 min，10%A～40%B），流速 5 m L/min，進(jìn)樣量為1 mL進(jìn)樣分離，根據(jù)出峰時(shí)間和峰形接收花色苷組分，各組分再濃縮二次進(jìn)樣分離。

圖3 不同進(jìn)樣量方案分離花色苷的HPLC色譜圖Fig. 3 HPLC Chromatograms of different injection volume

圖4 制備型HPLC第二次分離花色苷組分的HPLC圖Fig. 4 HPLC chromatogram ofAnthocyanin components

二次進(jìn)樣分離收取了5種花色苷組分流出液，各花色苷組分經(jīng)分析型HPLC進(jìn)樣檢測（圖4），花色苷組分保留時(shí)間分別為14.8 min、23.1 min、28.4 min、31.3 min 和 33.6 min，純度分別達(dá)到40.68%，24.38%，35.75%，90.61%和60.53%，其中組分4純度最高。UV光譜圖顯示（圖5）組分1、組分2、組分3、組分 4和組分 5分別在 523 nm、482 nm、534 nm、532 nm和520 nm處有最大吸收峰，而這5種組分在波長280 nm附近也存在最大吸收峰，符合花色苷類物質(zhì)在可見光區(qū)500-540 nm附近和紫外光區(qū)280 nm附近存在最大吸收波長的特征[5,9,23]，同時(shí)組分2在326 nm處存在一個(gè)吸收峰，研究發(fā)現(xiàn)[24,25]花青素分子在326-329 nm處存在的吸收峰是由于咖啡酸酯化的原因，故推測組分2為?；ㄉ?。

圖5 制備型HPLC第二次分離花色苷組分的UV光譜圖Fig. 5 UV spectrum of Anthocyanin components

3 結(jié)論與討論

植物中花色苷本身的含量較低，而又因植物的種類不同，其含量存在差異，在茶樹中也是如此。已有研究表明[26-27]，茶樹中含飛燕草素-3-O-β-半乳糖苷、矢車菊素-3-O-β-半乳糖苷、天竺葵素-3-蕓香糖苷等多種花色苷組分，而各種組分分子量、糖苷位置等不同，所以花色苷組分的功能及分子極性也會相應(yīng)地表現(xiàn)出差異，單一的分離技術(shù)可制備較高純度的花色苷，但可能會因提取條件的限制而存在花色苷變質(zhì)[12,28]、種類單一等問題，多種色譜方法結(jié)合并分離植物活成分性的研究也有報(bào)道[29]，因此，從植物中制備花色苷需要協(xié)同多種分離技術(shù)，可以克服因植物原料中花色苷含量低、花色苷組分類型多、極性不同等造成制備花色苷的技術(shù)缺點(diǎn)，從而達(dá)到高效分離純化植物中花色苷的目的。

本研究采用花色苷含量較高的紫芽茶樹品種，對樣品進(jìn)行前處理，整個(gè)過程在避光、酸性條件下進(jìn)行，獲得花色苷的提取物，后續(xù)制備的濃縮液也及時(shí)冷凍干燥保存，保證在最初的原料及實(shí)驗(yàn)過程中，減少花色苷因變質(zhì)的失損量，盡可能多的保留樣品中的花色苷。進(jìn)而以高速逆流色譜繼續(xù)純化花色苷，在該環(huán)節(jié)中，溶劑體系的優(yōu)化極為重要，其決定了花色苷產(chǎn)物的最終得率。在本研究中，酸乙醇粗提物中得率僅為5.64 mg/g，但已高于文獻(xiàn)報(bào)道的3.78 mg/g[12]，而經(jīng)過進(jìn)一步處理，并以篩選出最佳的溶劑體系進(jìn)行高速逆流色譜純化除雜，得率達(dá)到160.59 mg/g，而純度也由前處理的20.38%上升至43.64%，花色苷提取效率極大提升。最后采用半制備液相色譜，利用其分離純度高、可制備量大、分離效率高等[20,30]等優(yōu)點(diǎn)，分離高純度的花色苷組分，通過優(yōu)化的色譜條件，實(shí)驗(yàn)分離出5種花色苷組分，純度最高達(dá)90%以上，說明半制備液相色譜對于紫芽茶花色苷的分離效率與采用的色譜條件具有重要的關(guān)系。綜上所述，采用高速逆流色譜耦合半制備型液相色譜，分離純化紫芽茶樹花色苷的效率得到大幅提升，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在對紫芽茶樹花色苷及組分的分離中，高速逆流色譜結(jié)合半制備液相色譜是一種有效的分離制備花色苷的方法。

實(shí)驗(yàn)所分離的花色苷組分中純度有高于90%的組分，但也有組分因?yàn)榉蛛x條件的限制而僅有20%以上，這樣的純度尚且達(dá)不到質(zhì)譜鑒定的要求，其中組分2，根據(jù)文獻(xiàn)可推測其為?；ㄉ眨@也需要對該組分深入的研究及分析，所以在花色苷分離純化的后續(xù)研究中，還是要以分離純化為基礎(chǔ)，制備純度更高的花色苷及其組分，協(xié)同多種工藝技術(shù)、把控關(guān)鍵環(huán)節(jié)及節(jié)點(diǎn)，深入分析在不同植物中花色苷類型、組分的存在方式及功能的差異性，從而真正達(dá)到制備高純度花色苷的目的，發(fā)揮植物功能成分研究開發(fā)與利用的價(jià)值。