加味神術(shù)散霧化對(duì)FM1感染小鼠NLRP3炎癥小體及下游炎性因子表達(dá)的影響

李繼庭，梁虹宇，蘇立芬

（1.廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510095；2. 廣東省廣州市白云區(qū)人民醫(yī)院，廣東 廣州 510500）

流行性感冒是由流感病毒誘發(fā)的急性呼吸系統(tǒng)傳染性疾病，臨床采取流感疫苗僅能預(yù)防某些特異性病毒，但無(wú)法阻止病毒的不斷變異［1］。中藥?kù)F化吸入具有芳香辟穢、直祛病邪、經(jīng)絡(luò)傳導(dǎo)以及固護(hù)正氣等功效［2］。本研究用治療瘟病的經(jīng)典方藥神術(shù)散經(jīng)加味后制為霧化劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探究加味神術(shù)散霧化對(duì)FM1感染小鼠NLRP3炎癥小體及下游炎性因子表達(dá)的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

藥品。加味神術(shù)散（蒼術(shù)、白芷、甘草、金銀花、野菊花、羌活、藿香、冰片），購(gòu)自廣東省第二中醫(yī)院。取15劑水煮蒸餾，濃縮后獲得黃色精油，采用乙醚將油反復(fù)溶出，加無(wú)水Na2SO4脫水干燥，用維持液將藥物混懸并超聲以備用。利巴韋林噴霧劑（史達(dá)德藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20171120）。

病毒毒種。甲1型流感病毒FM1鼠肺適應(yīng)株，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱研所病毒室提供。病毒經(jīng)小鼠增強(qiáng)毒力后，于雞胚尿囊腔常規(guī)傳代培養(yǎng)2次，分裝，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

儀器和試劑。電子天平，F(xiàn) A 2 0 0 4 N購(gòu)自上海精密儀器科學(xué)有限公司；全自動(dòng)真空組織脫水機(jī)，LeicaASP300S，德國(guó)Leica公司；超凈工作臺(tái)，型號(hào)SB-7C-1B，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；高壓蒸汽滅菌器，型號(hào)YX280A，上海三申醫(yī)療器械有限公司；Shandon包埋機(jī)、Shandon手動(dòng)切片機(jī)、Shandon全自動(dòng)染色機(jī)，英國(guó)Shandon公司；倒置顯微鏡，BX-50，日本OLYMPUS公司；超低溫冰箱，ThermoForma，美國(guó)電熱集團(tuán)（ThermoElectronCorporation）；電熱恒溫水浴鍋，DK-S22，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀，powerwave340，美國(guó)Bio-tek公司；高速勻漿機(jī)，IKAT10basicS25，德國(guó)IKA公司；隔水電熱恒溫培養(yǎng)箱，PYX-DHS-SOX，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；高速冷凍離心機(jī)，HERMLE-z323k，德國(guó)HERMLE公司；TaKaRa試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司；R&DELISA試劑盒，廈門(mén)研科生物技術(shù)有限公司；麻醉缸、電子稱、眼科剪、鑷子、玻璃瓶、燒杯、燒瓶。一次性注射器、移液器吸頭等由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)小鼠的選擇和喂養(yǎng)。SPF級(jí)NIH小鼠80只，體質(zhì)量13～15g，雌雄各半，小鼠由廣州弗爾博生物科技有限公司提供［貨號(hào)J022，醫(yī)動(dòng)字第28-2023號(hào)，合格證編號(hào)SCXK（京）2018-0011］。分籠飼養(yǎng)，小鼠使用的籠具、飼料及墊料等均高壓消毒，喂養(yǎng)自來(lái)水和標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)小鼠飼料，能夠正常自由飲食飲水，白天光照時(shí)間和黑暗時(shí)間各12h。小鼠應(yīng)用物品每隔3日進(jìn)行消毒，適應(yīng)性喂養(yǎng)7日。鼠房?jī)?nèi)備有空調(diào)以及排氣扇，實(shí)驗(yàn)室溫度維持（23±1）℃，相對(duì)濕度（75±10）%，飼養(yǎng)過(guò)程達(dá)到SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

模型復(fù)制［3］。進(jìn)行感染小鼠造模，在麻醉缸內(nèi)，用乙醚將小鼠輕度麻醉，正常對(duì)照組予以50mL0.9%生理鹽水滴鼻，其余各組均予以流感病毒稀釋液50mL滴鼻以感染小鼠造模。

分組和給藥。NIH小鼠采用隨機(jī)數(shù)字分配法分為正常組、利巴韋林組、病毒對(duì)照組、神術(shù)散霧化組共4組，每組20只。給藥劑量按動(dòng)物每公斤體質(zhì)量占人體表面積的比值計(jì)算。利巴韋林組予以利巴韋林0.13g/（kg·d），神術(shù)散霧化組予以加味神術(shù)散1.50g/（kg·d），正常對(duì)照組以及病毒對(duì)照組應(yīng)用與神術(shù)散霧化劑組體積相同的0.9%生理鹽水。造模前2日給藥，給藥第3日在病毒接種1h后繼續(xù)給藥。將各組藥物原液稀釋成所需濃度，各組小鼠經(jīng)咽部噴霧，連續(xù)給藥7日。每日喂養(yǎng)全價(jià)飼料，自由飲水。

3 觀察指標(biāo)

咽部黏膜勻漿制作方法。滴鼻病毒感染后第5日，末次給藥24h后采取脫椎處死小鼠。其中每組10只獲得咽部黏膜，PCR樣品保存液保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)；另外每組10只取咽部黏膜于低溫條件下，根據(jù)常規(guī)方法制備黏膜勻漿［黏膜重（g）/生理鹽水（mL）=1/9］，采取4℃2500r/min離心30min后獲取上清液，放-20℃冰箱中保存，以待ELISA檢測(cè)應(yīng)用。

熒光定量P C R檢測(cè)咽部黏膜組織中N L R P 3、caspase-1的mRNA表達(dá)。采用TRIzol裂解獲得咽部黏膜組織，經(jīng)氯仿抽提→異丙醇沉淀→75%乙醇洗滌→DEPC水溶解→分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量以及純度處理。cDNA合成以及均參考TaKaRa試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，引物序列和反應(yīng)條件。

IL-1β、IL-18水平檢測(cè)。采用R&DELISA試劑盒對(duì)咽部黏膜勻漿IL-1β、IL-18水平進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。采用 SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示、用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以（%）表示、用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 治療結(jié)果

4.1 各組咽部黏膜NLRP3、caspase-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

與正常對(duì)照組比較，病毒對(duì)照組、利巴韋林組及神術(shù)散霧化組NLRP3、caspase-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量較高（P＜0.05）；與病毒對(duì)照組比較，利巴韋林組及神術(shù)散霧化組NLRP3、caspase-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量較低（P＜0.05）；與利巴韋林組比較，神術(shù)散霧化組NLRP3、caspase-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量較低（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組咽部黏膜NLRP3、caspase-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表1 各組咽部黏膜NLRP3、caspase-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與病毒對(duì)照組比較，#P＜0.05；與利巴韋林組比較，△P＜0.05.

images/BZ_7_1287_358_2253_422.png正常對(duì)照組 20 1.01±0.14 1.00±0.06病毒對(duì)照組 20 2.58±0.21* 2.94±0.42*利巴韋林組 20 1.22±0.13*# 1.36±0.18*#神術(shù)散霧化組 20 1.11±0.10*#△ 1.11±0.07*#△

4.2 加味神術(shù)散霧化對(duì)咽部黏膜勻漿IL-1β、IL-18的水平影響

與正常對(duì)照組比較，病毒對(duì)照組、利巴韋林組及神術(shù)散霧化組IL-1β、IL-18水平較高（P＜0.05）；與病毒對(duì)照組比較，利巴韋林組及神術(shù)散霧化組IL-1β、IL-18水平較低（P＜0.05）；與利巴韋林組比較，神術(shù)散霧化組IL-1β、IL-18水平較低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 加味神術(shù)散霧化對(duì)咽部黏膜勻漿IL-1β、IL-18分泌水平的影響 （pg/mL，±s）

表2 加味神術(shù)散霧化對(duì)咽部黏膜勻漿IL-1β、IL-18分泌水平的影響 （pg/mL，±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與病毒對(duì)照組比較，#P＜0.05；與利巴韋林組比較，△P＜0.05.

images/BZ_7_1287_1189_2254_1261.png正常對(duì)照組 20 20.29±2.12 36.67±2.49病毒對(duì)照組 20 55.30±5.73* 94.21±5.18*利巴韋林組 20 36.29±3.89*# 71.70±5.01*#神術(shù)散霧化組 20 25.40±2.85*#△ 63.50±4.09*#△

5 討 論

中醫(yī)治療流感的有效性在臨床和實(shí)驗(yàn)研究中獲得證實(shí)［4］，中醫(yī)的“內(nèi)病外治”法歷史悠久，是中醫(yī)不可或缺的部分。隨著當(dāng)今醫(yī)療模式的轉(zhuǎn)變和“以人為本”醫(yī)療理念的深化，中醫(yī)外治法因其便捷、有效以及安全等優(yōu)勢(shì)受到廣大醫(yī)療學(xué)者的重視，近幾年中醫(yī)外治法逐步在臨床疫病防治中推廣。神術(shù)散出自《楊氏家藏方》，收錄于《太平惠民和劑局方》，用于治療四時(shí)瘟疫，頭痛項(xiàng)強(qiáng)，發(fā)熱憎寒，身體疼痛及傷風(fēng)鼻塞，是瘟病犯衛(wèi)的經(jīng)典方。本研究在原方基礎(chǔ)上加入金銀花、野菊花以及冰片（蒼術(shù)、羌活、金銀花、白芷、藿香、野菊花、冰片、甘草）。方中蒼術(shù)燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目，白芷、羌活疏風(fēng)散寒、散寒燥濕，藿香理氣和中、辛溫散寒，金銀花、野菊花清熱解毒，冰片透內(nèi)熱、散郁火、避穢化濁，甘草調(diào)和諸藥。諸藥合用，可避穢化濁、透邪外出，發(fā)揮良好的疫病防治作用［5］。

NLRP3炎性小體由NLRP3、Caspase-1及銜接分子凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白（ASC）結(jié)合構(gòu)成。正常機(jī)體NLRP3活性處于抑制狀態(tài)，在NLRP3配體和NLRP3的LRR相結(jié)合后促進(jìn)熱休克蛋白分泌，NLRP3的NOD結(jié)構(gòu)域存在自身寡聚化，致使其熱蛋白結(jié)構(gòu)域（PYD）與ASC結(jié)合，并通過(guò)ASC的胱天蛋白酶招募結(jié)構(gòu)域招募并激活Caspase-1，IL-1β、IL-18為Caspase-1的下游炎性因子，Caspase-1活化后使IL-1β、IL-18前體加工為成熟且有活性的形式，分泌于細(xì)胞外產(chǎn)生免疫作用。研究認(rèn)為，NLRP3能感知胞內(nèi)病原微生物和代謝物，是啟動(dòng)和構(gòu)成炎性復(fù)合體的重要成分［6］。Caspase-1是IL-1β、IL-18成熟有活性的轉(zhuǎn)化酶，是NLRP3炎性小體的效應(yīng)蛋白。研究顯示，F(xiàn)M1感染小鼠的NLRP3及Caspase-1的表達(dá)量及其下游炎性因子IL-1β、IL-18存在顯著意義，上述因子水平均遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組小鼠，并發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體在FM1感染的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［7］。研究結(jié)果顯示，神術(shù)散霧化組NLRP3、caspase-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量、IL-1β、IL-18遠(yuǎn)低于病毒對(duì)照組、利巴韋林組，提示加味神術(shù)散霧化可能通過(guò)下調(diào)NLRP3炎癥小體及下游炎性因子表達(dá)。

加味神術(shù)散霧化能下調(diào)NLRP3炎性小體及其下游因子IL-1β、IL-18的分泌水平，對(duì)流感病毒FM1感染小鼠具有免疫保護(hù)作用。從分子生物學(xué)水平分析其抗流感病毒的有效性，為加味神術(shù)散霧化治療流感的臨床應(yīng)用提供了理論支持。