入侵植物小蓬草的細(xì)菌群落組成和多樣性研究

程丹丹,趙 菁,田忠賽

(中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430074)

生物入侵被認(rèn)為是目前僅次于土地利用變化而導(dǎo)致全球生物多樣性喪失的第二大因素[1]，嚴(yán)重威脅著生態(tài)系統(tǒng)的健康，是影響生物和生態(tài)安全的重要因素之一。盡管已經(jīng)開始采取諸多措施來(lái)防治生物入侵，但其依舊是當(dāng)今全球面臨的重大生態(tài)環(huán)境問(wèn)題之一[2]。我國(guó)已經(jīng)查明的外來(lái)入侵物種共529種，其中入侵植物多達(dá)270種，影響也日趨嚴(yán)重[3]。入侵植物具備規(guī)模大、范圍廣、難以清除、清除成本高等特點(diǎn)，能對(duì)農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)產(chǎn)生最直接的經(jīng)濟(jì)危害，并且給本土生物多樣性帶來(lái)不利的影響。對(duì)入侵植物微生物組的研究，能在一定程度上揭示微生物是否對(duì)生物入侵產(chǎn)生幫助，有助于植物入侵機(jī)制的探索，同時(shí)發(fā)現(xiàn)某些有益促生菌也是良好的生物資源。如Rout等[4]通過(guò)對(duì)北美入侵植物假高粱(Sorghumhalepense)的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細(xì)菌能夠固氮、溶磷，增強(qiáng)入侵植物的競(jìng)爭(zhēng)力，改變?nèi)肭种参锼谌郝涞纳锏厍蚧瘜W(xué)循環(huán)特征；Aschehoug等[5]通過(guò)對(duì)北美草原入侵植物矢車菊(Centaureastoebe)接種內(nèi)生真菌的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌可以增強(qiáng)矢車菊對(duì)土著植物的競(jìng)爭(zhēng)能力，并增強(qiáng)化感作用。

植物微生物組(Plant microbiota/microbiome)是指在植物生長(zhǎng)環(huán)境中，所有棲息附著于植物宿主表面和(或者)內(nèi)部的各種微生物。從微生物分布的部位來(lái)說(shuō)，植物微生物可以分為：根際微生物(rhizosphere microbe)、內(nèi)生微生物(endophytes)、葉際微生物(phyllosphere microbe)[6-7]。其中，根際微生物被認(rèn)為是植物的“第二基因組”(secondary genome)，為植物提供微生物衍生的化合物，有助于植物固氮、溶磷、耐寒和耐鹽堿[8-9]。葉際微生物是指植物葉表所有能棲息微生物區(qū)域的微生物，包括莖、花、果實(shí)和葉表面，廣義的葉際微生物也包括葉內(nèi)的微生物。植物葉際定殖有數(shù)百種微生物，其中大部分為細(xì)菌[10-11]，葉際微生物被認(rèn)為是植物與大氣環(huán)境交互響應(yīng)的媒介，對(duì)揭示植物與環(huán)境因子間的響應(yīng)機(jī)制十分重要[12-13]。內(nèi)生微生物是指其生活史的一定階段或全部階段存在于植物各種組織和器官內(nèi)部，一般認(rèn)為是不會(huì)引起植物感染、不會(huì)改變植物性狀的微生物[14]。內(nèi)生微生物可以增強(qiáng)宿主對(duì)各種脅迫環(huán)境的耐受力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物適應(yīng)力，植物甚至可以將有利的內(nèi)生微生物通過(guò)種子傳遞給下一代[15-16]。總體來(lái)說(shuō)，植物微生物可以礦化土壤有機(jī)質(zhì)、刺激植物防御機(jī)制、制約植物病原體，是決定土壤質(zhì)量、植物健康和生產(chǎn)力的關(guān)鍵因素之一，在植物生長(zhǎng)和抗病中起著重要作用[17-18]。

在植物微生物組研究中通常要求植物樣品采集后儲(chǔ)存在4℃條件，且在24 h之內(nèi)處理，以保證試驗(yàn)材料的新鮮和試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。在植物內(nèi)生菌的研究中需要對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行嚴(yán)格的表面消毒，以去除材料表面DNA的污染，以免對(duì)內(nèi)生菌的提取、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析產(chǎn)生干擾；同時(shí)還需要充分地研磨，使植物內(nèi)生菌的DNA充分釋放，以達(dá)到測(cè)序結(jié)果可靠性的最大化。目前，在植物內(nèi)生菌的研究中，表面消毒多采用化學(xué)法，即使用乙醇、雙氧水、次氯酸鈉等化學(xué)試劑組合清洗植物材料表面。這些試劑能殺死細(xì)菌并降解殘留DNA，針對(duì)不同的植物，通過(guò)改變消毒液濃度和消毒時(shí)間，均能達(dá)到較好的除菌和降解DNA的效果[19-20]。例如對(duì)美洲黑楊(Populusdeltoides)根內(nèi)生菌的研究中，就使用了雙氧水、乙醇和次氯酸鈉去除根表細(xì)菌[21]。此外，還有少部分研究使用無(wú)菌水大量沖洗，使用超聲波、渦旋震蕩等機(jī)械法來(lái)去除植物材料的表面細(xì)菌，如在水稻根微生物組研究中，獲取根內(nèi)生菌則是使用超聲波處理，通過(guò)多次的超聲波以確保根表附著的微生物全部脫離[22]。Richter-Heitmann等[23]對(duì)比了采用化學(xué)和機(jī)械的除菌方法對(duì)水稻根微生物組研究結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用水沖洗和使用化學(xué)試劑并未破壞根表組織的完整性，而不同的頻率聲波會(huì)對(duì)根表組織產(chǎn)生一定的破壞，因此建議研究?jī)?nèi)生菌還是使用化學(xué)法去除表面細(xì)菌DNA。在植物基因組和代謝組的研究中，常常使用機(jī)器研磨代替人工研磨，以便快速處理植物樣本，而冷凍干燥后的植物樣本能達(dá)到長(zhǎng)期保存樣本的目的。但是這些處理方式在植物微生物組研究中尚不多見，還需要評(píng)估其對(duì)植物微生物組的研究是否存在不利的影響。

本文選用入侵植物小蓬草(ConyzacanadensisL.)為研究對(duì)象,小蓬草是菊科一年生草本，原產(chǎn)北美，是我國(guó)分布最廣的入侵物種之一[24]。通過(guò)提取小蓬草相關(guān)的細(xì)菌DNA，用特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增細(xì)菌DNA的16S rRNA 基因的V5～V7高變區(qū)，使用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行測(cè)序，再利用獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行Alpha和Beta多樣性分析，探索小蓬草生境中的土壤及其根和葉的細(xì)菌群落組成和多樣性，并分析表面消毒、冷凍干燥保存和不同研磨方法等處理方式對(duì)研究結(jié)果的影響。該研究結(jié)果可為后續(xù)入侵植物微生物組的試驗(yàn)研究提供一定的方法指導(dǎo)，并為微生物在植物入侵機(jī)制中所起的作用研究提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

小蓬草樣本均于2017年7月采自中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)北區(qū)草地。在研究區(qū)隨機(jī)選取3個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)之間的間隔不超過(guò)2 m，每個(gè)采樣點(diǎn)采集3株相鄰且長(zhǎng)勢(shì)良好的小蓬草。將3株植株小心地連根挖出，輕輕將附著在根上的土抖落至自封袋中混合均勻，記作根圍土(root zone soil)。采集每個(gè)植株根周圍0～10 cm的表土，組成混合土樣記作背景土(bulk soil)。將小蓬草根在50 mL滅菌離心管中用無(wú)菌水沖洗，經(jīng)過(guò)3 000 r/min離心5 min后棄掉上清液，將沉淀物記作根際土(rhizosphere soil)[25]。全部樣本放入無(wú)菌自封袋、離心管中，均密封儲(chǔ)存于4℃低溫保鮮,在24 h之內(nèi)進(jìn)行后續(xù)處理。

1.2 樣本處理

將每個(gè)采樣點(diǎn)的3株小蓬草分為地上和地下部分，用純水清洗植物材料表面雜質(zhì)，選取新鮮的無(wú)病蟲害的葉和長(zhǎng)勢(shì)良好的根，將其按照采樣點(diǎn)分別均勻混合后，均分8份，對(duì)應(yīng)8個(gè)處理組合。處理組合按照如下劃分：樣品是否進(jìn)行表面消毒處理、冷凍干燥處理還是及時(shí)處理新鮮樣本、機(jī)器研磨和人工研磨兩種研磨方式；每個(gè)處理組合有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。表面消毒的流程是：將樣品在70%酒精振蕩浸泡1 min，1%NaClO振蕩浸泡1～2 min(地上部分為1 min，地下部分為2 min)，隨后用無(wú)菌水沖洗4次，取最后一次沖洗的無(wú)菌水涂布牛肉膏蛋白胨平板，培養(yǎng)2～3 d，若無(wú)菌落生長(zhǎng)則確定表面消毒除菌完全。未進(jìn)行表面消毒的樣品直接進(jìn)行后續(xù)處理。冷凍干燥處理是將樣品放入滅菌50 mL離心管中，使用冷凍干燥機(jī)處理48 h，隨后至-20℃保存，于一個(gè)月后進(jìn)行后續(xù)處理。未進(jìn)行冷凍干燥的樣品在24 h之內(nèi)迅速處理。機(jī)器研磨是采用高通量組織研磨機(jī)(Retsch?MM400，German)將樣品在頻率為300 s-1下研磨3 min；人工研磨則是將樣品置于滅菌研缽中加入液氮研磨成粉末[26]。

1.3 PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

所有樣品(植物樣、土壤樣)DNA均使用試劑盒MOBIO PowerSoil DNA Isolation Kit (MO-BIO,Carlsbad,CA,USA) 提取，植物樣研磨后取約2 g，土壤樣取約0.25～0.3 g，按照說(shuō)明書提取DNA。使用16S rRNA基因擴(kuò)增子來(lái)確定每個(gè)樣品中的細(xì)菌群落多樣性。PCR采用的引物是799F-1193R(799F：AACMGGATTAGATACCCKG，1193R：ACGTCATCCCCACCTTCC)，因?yàn)檫@一對(duì)特異性引物被設(shè)計(jì)用來(lái)擴(kuò)增細(xì)菌DNA的16S rRNA基因的V5～V7高變區(qū)，一定程度上可以避免植物葉綠體和線粒體的擴(kuò)增[27-28]。PCR采用25 uL反應(yīng)體系，包括：含有10 uM的正向和反向引物，10 ng的DNA模板及Q5?高保真DNA聚合酶，于98℃預(yù)變性2 min后，98℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s循環(huán)30次后，72℃終延伸5 min。

將樣品在2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)，選擇條帶在400～500 bp長(zhǎng)度進(jìn)行切膠回收，使用AXYGEN切膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。將回收產(chǎn)物使用全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀Mircoplate reader(BioTek，F(xiàn)Lx800)進(jìn)行熒光定量，根據(jù)每個(gè)樣本測(cè)序量的需求，按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。使用TruSeq?Nano DNALT Library Prep Kit (Illumina,CA,USA)試劑盒制備測(cè)序文庫(kù)。通過(guò)對(duì)測(cè)序文庫(kù)在生物芯片分析儀Agilent Boanalyzer上進(jìn)行質(zhì)檢，使用Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量后，采用ILLumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行2×300 bp雙端測(cè)序，測(cè)序在上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行。

1.4 序列數(shù)據(jù)處理

按照樣本特有的條形碼，將各樣本序列分成成對(duì)的reads，采用FLASH(V1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)切除每個(gè)樣本reads的條碼及引物序列并進(jìn)行拼接，運(yùn)用QIIME軟件(V1.7.0，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)量控制，得到高質(zhì)量可用數(shù)據(jù)(Clean Tags)。通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)(Gold database，http://drive5.com/uchime/uchime_download.html)進(jìn)行比對(duì)，使用UCHIME算法(http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)檢測(cè)并去除嵌合體序列，最終得到有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)。

調(diào)用Uparse序列對(duì)比工具(Uparse v7.0.1001,http://drive5.com/uparse/)對(duì)獲得的高質(zhì)量數(shù)據(jù)按照序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU(operational taxonomic unit,可操作分類)劃分，并選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列，在Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)(Release 13.8，http://greengenes.secondgenome.com/)進(jìn)行注釋。序列處理和注釋均在上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行。獲得原始OTU豐度矩陣之后，將豐度值低于全樣本測(cè)序總量0.001%的OTU去除，并剔除掉鑒定出來(lái)屬于葉綠體和線粒體的宿主序列，此OTU豐度矩陣用于后續(xù)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用ImageGP 易漢博生物信息在線作圖網(wǎng)站(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/VennDiagram.html)繪制Venn圖、箱線圖?；谖催M(jìn)行均一化的數(shù)據(jù)并使用R軟件包(Biodiversity R)計(jì)算每個(gè)樣本群落的Alpha-多樣性(Shannon指數(shù))，分別對(duì)根、葉、土壤細(xì)菌群落的不同水平分類單元的豐度的中位數(shù)進(jìn)行排序，決定優(yōu)勢(shì)門和科，并繪制優(yōu)勢(shì)門和科豐度的柱形圖。方差分析和組間多重比較結(jié)果均通過(guò)R軟件包進(jìn)行。NMDS(Nonmetric Multidimensional Scaling,非度量多維尺度)分析和Adonis分析則是基于BC(Bray-Curtic,相異度)距離，利用R軟件包vegen完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本細(xì)菌群落的Alpha多樣性

本次從57個(gè)樣本中得到3 460 130的高質(zhì)量DNA片段，剔除鑒定為非細(xì)菌、葉綠體或者線粒體的序列后，剩下1 498 222條序列，鑒定為3 315個(gè)OTU,見圖1。從根樣本中鑒定出的OTU數(shù)目最多，占總OTU數(shù)目的96%。根樣本包含大多存在于土壤、葉中的OTU，根葉共有的OTU數(shù)目占總OTU數(shù)目的53.5%，根土共有的OTU數(shù)目占總OTU數(shù)目的68%，根特有的OTU數(shù)目211個(gè)(占總OTU數(shù)目的6.4%)被鑒定。葉樣本中鑒定出的OTU數(shù)目最少，只占總OTU數(shù)目的55.1%，且葉中特有的OTU最少，僅有51個(gè)(占總OTU數(shù)目的1.5%[見圖1(a)]。從3種類型的土壤中鑒定出的共有OTU數(shù)目很高，占總OTU數(shù)目的58.9%，3種土壤均包含小部分特有的OTU數(shù)目(占總OTU數(shù)目的5.0%～7.9%)[見圖1(b)]。

圖1 土壤和小蓬草根、葉中細(xì)菌群落共有的OTU韋恩圖Fig.1 Venn diagrams of shared bacteria operational taxonomic units (OTU) in bacterial communities in leaf,root and soil associated with Conyza canadensis

來(lái)自不同類型樣本(小蓬草根、葉和土壤樣本)細(xì)菌群落的Alpha多樣性(以Shannon指數(shù)為代表)存在顯著的差異，小蓬草葉樣本細(xì)菌群落的Aplha多樣性最低，其次是小蓬草根樣本，土壤樣本細(xì)菌群落的Alpha多樣性最高。背景土、根圍土和根際土細(xì)菌群落的Alpha多樣性基本保持在同一水平，雖然根際土細(xì)菌群落的Alpha多樣性較根圍土和背景土略低，但是3種土壤之間的差異不顯著，見圖2。

圖2 土壤和小蓬草根、葉中細(xì)菌群落的Shannon指數(shù) 箱線圖Fig.2 Boxplot of Shannon index of bacterial communities from leaf,root and soil samples associated withConyza canadensis不同樣本類型間差異顯著(AVOVA test：df=4，52；F=24.82；p<0.001)。圖中不同的字母表示組間多重比較的結(jié)果。

2.2 樣本細(xì)菌群落組成

本次總共發(fā)現(xiàn)了25個(gè)不同的細(xì)菌門，其中平均豐度排名前10的細(xì)菌門所占豐度之和在各個(gè)樣本中均大于 98%，且前3門(變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria和擬桿菌門Bacteroidetes)豐度之和均大于90%。小蓬草根、葉和土壤細(xì)菌群落前10門的相對(duì)豐度排序略有不同，但三者均以變形菌門和放線菌門為優(yōu)勢(shì)門，這兩個(gè)門的豐度之和在小蓬草根和葉細(xì)菌群落中高達(dá)85%，在土壤細(xì)菌群落中達(dá)到70%以上。其中，變形菌門在小蓬草葉細(xì)菌群落中豐度最高(65%)，而放線菌門在小蓬草根細(xì)菌群落(38%)中的豐度高于小蓬草葉和土壤細(xì)菌群落中的豐度。比較小蓬草根、葉中的豐度土壤三類樣本，小蓬草葉細(xì)菌群落中異常球菌門(Deinococcus-Thermus)的豐度占比為1.5%，略高于小蓬草根和土壤；小蓬草根細(xì)菌群落中厚壁菌門(Firmicutes)的豐度較高，占比為5%；而土壤細(xì)菌群落中擬桿菌門(Bacteroidetes，豐度占比為7.5%)、酸桿菌門(Acidobacteria，3.7%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，豐度占比為5.5%)、浮霉菌門(Planctomycetes，豐度占比為2.4%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，豐度占比為2.1%)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae，豐度占比為1.4%)的豐度均略高于它們?cè)谛∨畈萑~、根細(xì)菌群落中的豐度[見圖3(a)]。

圖3 土壤和小蓬草根、葉中細(xì)菌群落前10門及前 10科相對(duì)豐度柱形圖Fig.3 Relative abundance of top 10 phyla and families of the leaf,root,and soil bacteria communities associated with Conyza canadensis

在科水平，小蓬草葉、根和土壤細(xì)菌群落前10科豐度差異較大：小蓬草根細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)科是動(dòng)孢囊菌科(Kineosporiaceae，豐度占比為9.27%)和叢毛單胞菌科(Comamonadaceae，豐度占比為7.38%)；小蓬草葉細(xì)菌群落的優(yōu)勢(shì)科則是腸桿菌科(Enterobacteriaceae，豐度占比為21.34%)和甲基桿菌科(Methylobacteriaceae，豐度占比為17.54%)，這兩科在小蓬草根細(xì)菌群落中的豐度都很低；土壤細(xì)菌群落以叢毛單胞菌科(Comamonadaceae，豐度占比為6.40%)和亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae，豐度占比為4.54%)為優(yōu)勢(shì)科[見圖3(b)]。

小蓬草葉細(xì)菌群落中的大部分OTU可以鑒定到屬的水平，優(yōu)勢(shì)屬包括甲基桿菌屬(Methylobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、埃希氏-志賀氏菌屬(Escherichia-Shigella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和微桿菌屬(Microbacterium)等，這些類群的豐度之和達(dá)到細(xì)菌群落總豐度的50%。根細(xì)菌群落中有29.4%的細(xì)菌未鑒定到屬，已鑒定的優(yōu)勢(shì)屬包含了上述小蓬草葉的優(yōu)勢(shì)屬，同時(shí)還有鏈霉菌屬(Streptomyces)、放線游動(dòng)菌屬(Actinoplanes)、類卡諾氏菌屬(Nocardioides)、無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)、根瘤菌屬(Rhizobium)和芽孢桿菌屬(Bacillus)等。土壤中未鑒定到屬的細(xì)菌OTU最多，達(dá)46.0%，除去未鑒定到屬的細(xì)菌，豐度較高的有類卡諾氏菌屬(Nocardioides)、產(chǎn)酸菌屬(Acidibacter)和黃桿菌屬(Flavobacterium)，其中產(chǎn)酸桿菌屬(Acidibacter)和黃桿菌屬(Flavobacterium)的平均豐度高于小蓬草葉和根。

2.3 不同處理對(duì)小蓬草葉和根細(xì)菌群落研究結(jié)果的影響

進(jìn)行表面消毒處理的樣本中細(xì)菌群落的Alpha多樣性均低于未進(jìn)行表面消毒處理的樣本，尤其是對(duì)小蓬草葉樣本的影響十分顯著，未進(jìn)行表面消毒處理的小蓬草葉樣本中細(xì)菌群落的Alpha多樣性顯著高于表面消毒處理過(guò)的樣本[見圖4(a)]；在小蓬草根樣本中，表面消毒處理的影響接近顯著(p=0.051 8)[見圖4(b)和表1]。采用不同的研磨方式和是否進(jìn)冷凍干燥處理對(duì)小蓬草根和葉樣本中細(xì)菌群落Alpha多樣性的影響不顯著(見圖4和表1)。

圖4 不同處理的小蓬草根和葉中細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)Fig.4 Shannon index of bacterial communities from Conyza canadensis leaf and root samples with different treatments

處理方式DfSum.SqMean.SqF值p值葉根葉根葉根葉根葉根表面消毒/未進(jìn)行表面消毒1,231,2324.0801.88424.0801.884 154.9804.2290.000 1???0.051 8人工研磨/機(jī)器研磨1,231,230.0000.1740.002 80.173 90.0020.3320.966 00.570 0冷凍干燥保存處理/及時(shí)處理1,231,230.3000.7580.301 40.758 40.1981.5270.660 00.230 0

注：“***”表示在0.000 1水平上差異顯著。

NMDS分析結(jié)果表明：來(lái)自于小蓬草根、葉和土壤的細(xì)菌群落組成差異明顯[圖5(a)]，是否進(jìn)行表面消毒處理的根和葉樣本的細(xì)菌群落組成差異顯著[見圖5(b)]；而采用不同研磨方式和是否進(jìn)行冷凍干燥保存處理的小蓬草根和葉樣本的細(xì)菌群落組成差異不顯著[見圖5(c)、圖5(d)]。Adonis分析結(jié)果表明：是否進(jìn)行表面消毒處理的小蓬草根、葉樣本的細(xì)菌群落組成差異顯著，但是否進(jìn)行冰凍干燥處理和采用不同研磨方式對(duì)小蓬草根和葉樣本的細(xì)菌群落組成的影響不顯著，見表2。

圖5 土壤和小蓬草根、葉細(xì)菌群落的NMDS分析圖Fig.5 Nonmetric multidimensional scaling (NMDS) plots for the leaf,root,and soil bacteria communities associated with Conyza canadensis

表2 不同處理方式對(duì)小蓬草根和葉中細(xì)菌群落Beta多樣性影響的Adonis分析結(jié)果

注：“**”、“*”分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著。

3 討 論

小蓬草根樣本細(xì)菌群落中OTU的數(shù)目最多，略高于土壤樣本，明顯高于小蓬草葉樣本；細(xì)菌群落Alpha多樣性卻是土壤最高，其次是小蓬草根，小蓬草葉的細(xì)菌群落Alpha多樣性最低。小蓬草細(xì)菌群落的Alpha多樣性變化趨勢(shì)與龍舌蘭[29]、擬南芥[30]、Espeletiasp.[31]的微生物組研究結(jié)果一致，但OTU數(shù)目的結(jié)果卻有差異。推測(cè)原因是本研究的樣本包含了根表細(xì)菌，而上述研究均采用的表面除菌樣本。土壤包含了大部分出現(xiàn)在根樣本中的細(xì)菌OTU，根樣本包含了大部分出現(xiàn)在葉樣本中的細(xì)菌OTU，而土壤和葉的共有OTU數(shù)目更少。表明相鄰的部位所共有的OTU數(shù)目越多，而且土壤是植物表面和內(nèi)部微生物組的重要來(lái)源。隨著取樣部位靠近植物內(nèi)部，植物對(duì)微生物的選擇作用越來(lái)越強(qiáng)烈，微生物之間的競(jìng)爭(zhēng)也越來(lái)越激烈，故多樣性程度越低[32]。細(xì)菌群落中優(yōu)勢(shì)門包括變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、厚壁菌門。由土壤到根再到葉，變形菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度在增加，而酸桿菌門相對(duì)豐度在降低，這與其他植物的微生物組如水稻[22]、龍舌蘭[29]、擬南芥[30]的研究結(jié)果類似。

研究發(fā)現(xiàn)，一些植物益生菌是小蓬草細(xì)菌群落中的優(yōu)勢(shì)菌屬，可能會(huì)對(duì)小蓬草適應(yīng)不良環(huán)境提供一定的幫助。例如鞘氨醇單胞菌屬是很多植物的葉際優(yōu)勢(shì)菌屬，能利用的底物十分廣泛，具有較強(qiáng)的生物降解能力[33]，某些種還能產(chǎn)生有價(jià)值的高分子物質(zhì)如胡蘿卜素等，可以為植物降解復(fù)雜有機(jī)物提供良好的幫助[34]；通過(guò)對(duì)擬南芥研究發(fā)現(xiàn)，鞘氨醇單胞菌屬有著很好的植物保護(hù)效應(yīng)(plant-protective effect)，能夠抑制疾病癥狀，減少病原菌生長(zhǎng)[35]；根瘤菌屬中的部分種具備較強(qiáng)的固氮能力，能夠促進(jìn)植物對(duì)氮源的吸收和利用；甲基桿菌屬在自然界碳循環(huán)中有著重要的作用，有研究從3種番紅花屬的根瘤中分離出甲基桿菌屬，且能在結(jié)瘤植物如豬屎豆(Crotalaria)中生存并具有固氮功能[36]；鏈霉菌屬中的部分種能產(chǎn)生葡萄糖異構(gòu)酶，同時(shí)產(chǎn)生抗菌素；在豌豆(Pisumsativum)中發(fā)現(xiàn)一株寄生于根部的鏈霉菌(StreptomyceslydicusWYEC108)，能通過(guò)特殊的途徑增加根瘤產(chǎn)生的頻率且增加根瘤大小，是一種自然產(chǎn)生的促豆類植物生長(zhǎng)的微生物[36]；假單胞菌屬和芽孢桿菌屬是土壤、植物中廣泛存在的菌屬，與植物聯(lián)系緊密，部分種具有較強(qiáng)的溶磷能力，還能產(chǎn)生生長(zhǎng)素(IAA)[37]，如從美洲黑楊(Populusdeltoides)中分離出21株假單胞菌，其中大半接種至萵苣中均能表現(xiàn)促生機(jī)制[38]。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)，是否進(jìn)行冷凍干燥保存處理和采用不同的研磨方式對(duì)微生物群落組成的影響不是很明顯，但是否進(jìn)行表面消毒處理則影響較大。進(jìn)行表面消毒處理和未進(jìn)行表面消毒處理的小蓬草葉、根中細(xì)菌群落組成和多樣性有明顯的差異，未進(jìn)行表面消毒處理的樣本帶有組織表面的微生物，因此其多樣性明顯高于表面消毒處理過(guò)的樣本，表明小蓬草的根表和根內(nèi)以及葉表和葉內(nèi)的細(xì)菌群落存在明顯的差異。在未進(jìn)行表面消毒處理的小蓬草根中，存在大量廣泛存在于土壤和腐爛的植物體內(nèi)的鏈霉菌屬，其含量是消毒處理過(guò)的小蓬草根的3倍。未進(jìn)行表面消毒處理的小蓬草葉中存在大量類諾卡氏菌屬，類卡諾氏菌屬在土壤、水中廣泛存在，在植物體內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)，但含量較低[39]。鞘氨醇單胞菌屬也在未進(jìn)行表面消毒處理的小蓬草葉中含量遠(yuǎn)高于表面消毒處理的小蓬草葉中含量。鞘氨醇單胞菌屬在環(huán)境中無(wú)處不在，河水、地表、土壤中都有它們的蹤跡，和甲基桿菌一同被認(rèn)為是葉際常見的優(yōu)勢(shì)菌屬[34-35]。

4 結(jié) 論

對(duì)小蓬草根、葉以及相關(guān)土壤細(xì)菌群落多樣性的研究表明，小蓬草不同部位(根際、根和葉)的細(xì)菌群落多樣性和組成有一定差異，其優(yōu)勢(shì)門、科、屬與前人的研究結(jié)果類似。研究發(fā)現(xiàn)，小蓬草含有的一些優(yōu)勢(shì)菌屬是植物益生菌，可能在一定程度上幫助宿主適應(yīng)各種環(huán)境，如幫助宿主獲取養(yǎng)分、改善土壤性質(zhì)。該研究成果能為研究微生物在入侵植物中起到何種作用提供一定的數(shù)據(jù)支持，為防治生物入侵研究提供一定的幫助。此外，優(yōu)勢(shì)益生菌也是一種良好的生物資源，針對(duì)優(yōu)勢(shì)益生菌的進(jìn)一步研究，將其投入到環(huán)境生物保護(hù)的應(yīng)用中，能達(dá)到變害為寶的目的。

研究還發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行了表面消毒處理的小蓬草根和葉樣本的細(xì)菌群落組成和多樣性與未進(jìn)行表面消毒處理的樣本相比有明顯的差異；而不同的研磨方式和冷凍干燥保存處理，對(duì)小蓬草根和葉細(xì)菌群落組成和多樣性的研究結(jié)果并未產(chǎn)生明顯的影響。該結(jié)論可為植物微生物組的相關(guān)研究提供指導(dǎo)。