七種堅果仁中多酚、三萜含量及其抗氧化活性比較

王豪，涂宗財,*，羅亞林，王輝，葉云花，張露，沙小梅，謝雅雯

1(江西師范大學，生命科學學院江西省淡水魚高值化利用工程技術研究中心，江西 南昌，330022) 2(食品科學與技術國家重點實驗室(南昌大學)，江西 南昌，330047)

活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是人體代謝的正常產(chǎn)物，參與細胞信號傳遞、細胞凋亡等代謝途徑[1-2]，但自由基的過量積累可以造成生物膜系統(tǒng)損傷以及細胞內(nèi)氧化磷酸化障礙，誘導蛋白質、DNA和脂肪等生物大分子的氧化損傷[3-4]，對身體健康產(chǎn)生嚴重威脅，如引發(fā)心血管疾病、糖尿病、衰老、老年癡呆等多種慢性疾病[5-6]。預防和治療氧化損傷引起的各種慢性疾病的有效方法之一是利用抗氧化劑清除人體中過多的活性氧自由基，包括合成和天然的抗氧化劑。目前，合成抗氧化劑如叔丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、特丁基對苯二酚(TBHQ)和沒食子酸丙酯(PG)等主要作為食品添加劑用于延緩食品氧化變質、提高食品穩(wěn)定性等[7-8]，暫無可用于臨床治療的合成抗氧化劑。因此，從天然食物資源(蔬菜、水果、谷物、堅果等)中篩選安全、有效的清除ROS的活性成分，對促進人體健康，延緩人體衰老具有重要意義。

堅果是膳食纖維、礦質元素、多不飽和脂肪酸、維生素和抗氧化劑等的優(yōu)質來源，因其營養(yǎng)豐富、飽腹感強、保健效果好等特點日益成為備受推崇的主流健康休閑食品。目前已有大量關于堅果生物活性方面的研究報道，如YANG等[9]表明，核桃多酚可以影響自由基、抗氧化酶和脂質過氧化的代謝產(chǎn)物，從而提高小鼠脾淋巴細胞的免疫功能。黎章矩等[10]研究表明，香榧子提取物能預防小鼠動脈粥樣硬化。LIU等[11]通過研究發(fā)現(xiàn)脫毒銀杏果粉(DGP)可以減輕炎癥并促進正常的脂質代謝。劉志彬等[12]研究表明，巴旦木和巴旦木皮具有改善人體血脂狀況，提高機體抗氧化的能力。當前最受歡迎的堅果類產(chǎn)品有核桃、銀杏果、葵花籽、松子、開心果等，但不同的堅果產(chǎn)品，其市售價也相差很大，如香榧(Torreyagrandiscv.merrillii)果仁的售價通常在150～250元/斤，遠高于核桃(JuglansregiaL.)、巴旦木(almonds)、銀杏果(GinkgobilobaL. seed)、花生(ArachishypogaeaLinn.)和葵花籽(HelianthusannuusL. seed)等常見堅果，而核桃和巴旦木的售價遠高于花生和葵花籽。不同堅果中活性成分的含量和抗氧化活性是否與其價格成正比這一科學問題還不明確。

因此，本文以總黃酮、總酚和總三萜含量為評價指標，以核桃、巴旦木、銀杏果、花生、葵花籽、野生和種植香榧仁為研究對象，對比其提取物中活性成分含量差異，同時通過分析提取物的DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力和鐵離子還原能力，評價7種堅果仁提取物的抗氧化活性，以期為堅果營養(yǎng)價值的評價提供可靠的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

種植香榧采自浙江諸縣，野生香榧采自江西黎川巖泉自然保護區(qū)，烘干未經(jīng)任何調味的核桃、巴旦木、銀杏果、花生、葵花籽，采購于江西省南昌市天虹超市；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和2,2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；Folin-Ciocalteu試劑、AlCl3、沒食子酸(gallic acid equivalent, GAE)、槲皮素(quercetin equivalent, QuE)、蘆丁等其他試劑，購自北京索萊寶科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DFY-500高速中藥粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司；KH-500DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；DUG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱，SXL-1008程控箱式電爐，上海精宏實驗設備有限公司；KDY-9820凱氏定氮儀，北京市通潤源機電技術有限責任公司；R404A冷凍離心機，上海艾本德生物技術國際貿(mào)易有限公司；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；LGJ-1D-80冷凍干燥機，北京亞泰科隆儀器技術有限公司；Synergy H1多功能微孔板檢測儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 營養(yǎng)成分測定

對堅果樣品去殼處理后，測定其水分、灰分、蛋白含量和脂肪含量。水分測定參照國標《GB5009.3—2016》，灰分測定參照國標《GB 5009.4—2010》，蛋白含量參照國標《GB50095》，脂肪含量的測定參照國標《GB5009.6—2016》。

1.3.2 活性成分提取

所有堅果樣品去殼后，采用粉碎機將堅果仁粉碎，然后采用超聲波輔助提取法提取其中的活性成分。準確稱取5.0 g堅果粉末與50 mL體積分數(shù)為70%的乙醇混合，500 W，50 ℃超聲處理1 h后，7 000 r/min離心7 min，收集上清液，殘渣再在相同條件下提取2次，合并所有上清液，減壓濃縮除去乙醇后再冷凍干燥。最后用體積分數(shù)為70%的乙醇配成10 mg/mL的溶液用于后續(xù)分析。每個樣品做3個平行。

1.3.3 總黃酮含量測定

參照前期實驗步驟，采用NaNO2-AlCl3-NaOH法[13]測提取物中的總黃酮含量，用蒸餾水代替10% AlCl3的反應體系為空白。以槲皮素(50～300 μg/mL)為標品繪制標準曲線，樣品中的總黃酮含量用毫克槲皮素當量每克干原料(mg QuE/g DM)表示。重復測3次，取平均值。

1.3.4 總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu法測定提取物中的總酚含量[14]，用0.3 mL蒸餾水代替200 g/L的Na2CO3的反應體系為樣品空白，以沒食子酸(20～100 μg/mL)為標品繪制標準曲線，樣品中的總酚含量用毫克沒食子酸每克干原料當量(mg GAE/g DM)表示。實驗重復3次，取平均值。

1.3.5 總三萜含量的測定

根據(jù)張露等[14]的方法測定樣品中總三萜的含量。500 μL適宜濃度的樣品與0.5 mL 50 g/L的香草醛—冰醋酸和1.0 mL高氯酸混合并于60 ℃ 反應20 min，冰水冷卻15 min后加入3.0 mL冰醋酸，室溫反應10 min，最后測定樣品在547 nm下的吸光值，用冰醋酸代替質量濃度50 g/L香草醛-冰醋酸的溶液為空白。以齊墩果酸(20～100 μg/mL)為標品繪制標準曲線，樣品中的總三萜含量用毫克齊墩果酸(oleanolic acid equivalent, OAE)當量每克干原料(mg OAE/g DM)表示。實驗重復3次，取平均值。

1.3.6 DPPH·清除能力

參照FU等[15]的方法比較7種堅果提取物清除DPPH·的能力。50 μL樣品與150 μL 0.15 mmol/L DPPH·溶液于室溫避光反應30 min，然后采用酶標儀測定反應體系在517 nm的吸光值，以甲醇代替DPPH·溶液的反應體系為樣品空白，分別以70%乙醇和甲醇代替樣品和DPPH·溶液的反應體系為空白，計算DPPH·清除能力，樣品的DPPH·清除能力用IC50值(半抑制濃度，即樣品清除自由基的能力達到50%時所需的提取物濃度)表示。實驗重復3次。

1.3.7 ABTS+·清除能力

采用ABTS+·清除能力實驗評價7種堅果提取物的總抗氧化能力[16]。首先配制5 mL含有19.2 mg ABTS和3.317 mg過硫酸鉀的ABTS+·儲存液，室溫避光反應12～16 h，使用前用甲醇稀釋至溶液在734 nm處的吸光值為0.7±0.2。分別取30 μL適宜濃度的樣品與170 μL ABTS+·溶液于96孔酶標板中混合，避光反應6 min后于734 nm測吸光值。以甲醇代替ABTS+·溶液的反應體系為樣品空白，分別以70%乙醇和甲醇代替樣品和ABTS+·溶液的反應體系為空白，計算ABTS+·清除能力，樣品的ABTS+·消除能力用IC50值表示。實驗重復3次。

1.3.8 Fe3+還原能力分析

參照AKBARI等[17]的方法比較7種堅果提取物的Fe3+還原能力。向0.2 mL不同濃度樣品中加入0.3 mL 10 g/L的K3[Fe(CN)6]溶液，50 ℃反應20 min后加入0.3 mL 100 g/L的三氯乙酸終止反應，再加入0.6 mL蒸餾水和0.15 mL 1 g/L的FeCl3，搖勻后于700 nm處測吸光值，吸光度越高，表示樣品的還原能力越強。用0.15 mL蒸餾水代替1 g/L的FeCl3作為樣品空白，以槲皮素為陽性對照，樣品的Fe3+還原能力用毫克槲皮素當量每克提取物表示(mg QuE/g E.)。實驗重復3次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗均重復3遍，結果用平均值±標準偏差表示，利用SPSS 19.0軟件分析數(shù)據(jù)間的顯著性差異，P<0.05則認為樣品間具有顯著性差異。IC50值為樣品清除50%的自由基所需要的提取物濃度(mg E./mL)，采用Origin 8軟件中的多項擬合計算樣品清除DPPH·和ABTS+·的IC50值。

2 結果與分析

2.1 營養(yǎng)成分測定結果

7種堅果仁中主要營養(yǎng)成分含量測定結果如表1所示。由表1可知，7種堅果仁的水分含量相差較大，其中以葵花籽為最低，其水分含量為3.48%，而銀杏果則高達19.41%。不同堅果仁的灰分差異不大，為1.95%～3.57%。蛋白質含量中，葵花籽含量最高，為3.05 g/100g，野生香榧的蛋白質含量最低，為1.04 g/100g。7種堅果仁樣品中，核桃的脂肪含量最高(3.40 g/100g)，而銀杏的脂肪含量最低(0.54 g/100g)。

表1 七種堅果仁主要營養(yǎng)成分含量Table 1 The content of main nutrition components in seven nut samples

2.2 總黃酮含量分析

7種堅果中的總黃酮含量如表2所示。不同堅果中的總黃酮含量差異明顯(P<0.05)，葵花籽仁具有最高的總黃酮含量，其含量高達35.16 mg QuE/g DM，其次為種植香榧(15.17 mg QuE/g DM)，銀杏果中的總黃酮含量最低，僅為1.36 mg QuE/g DM。野生香榧中的總黃酮含量遠低于種植香榧，為2.98 mg QuE/g DM，只有種植香榧的19.6%。李鈞敏等[18]報道長葉榧種子中總黃酮含量為1.06～2.65 mg/g；ZHANG等[19-20]研究表明江西種植香榧仁中的總黃酮含量為0.17 mg QuE/gDM，不同的總黃酮含量可能是由于樣品的品種、生長環(huán)境、采集季節(jié)的差異以及含量測定方法的不同所引起。但總體上可以得出，種植香榧中的總黃酮含量高于野生香榧，以及銀杏果、巴旦木、花生和葵花籽仁。

表2 七種堅果中總黃酮、總酚和總三萜含量Table 2 Total flavonoids, total phenolics and total triterpenoids content in seven nut samples

注：同一列右上角的相同字母(a、b、c等)代表樣品間的數(shù)值不存在顯著性差異(P> 0.05)。

2.3 總酚含量分析

7種堅果中的總酚含量如表2所示，不同堅果中的總酚含量變化差異與總黃酮的不同，7種測試堅果中總酚含量的變化趨勢為：核桃>種植香榧>葵花籽>花生>野生香榧>銀杏果>巴旦木。核桃中的總酚含量最高，為9.69 mg GAE/g DM，種植香榧的總酚含量次之，為8.99 mg GAE/g DM，巴旦木的總酚含量最低，僅為核桃的3.63%。與總黃酮含量相同，野生香榧中的總酚含量遠低于種植香榧，僅為后者的23.9%。

2.4 總三萜含量分析

由表2可知，不同堅果的總三萜含量存在差異性，種植香榧具有最高的總三萜含量，為4.37 mg OAE/g DM，目前已從香榧子中鑒定的萜類化合物有grandione[19]、β-谷甾醇、紫杉醇和胡蘿卜苷[20]。核桃仁中總三萜含量僅次于種植香榧(2.47 mg OAE/g DM)；銀杏果中的總三萜含量最低，為0.57 mg OAE/g DM，只有種植香榧的13%?？ㄗ押突ㄉ目側坪坎淮嬖陲@著性差異(P>0.05)，分別為1.45 mg OAE/g DM和1.49 mg OAE/g DM。

2.5 抗氧化活性評價

2.5.1 DPPH·清除能力

采用DPPH·清除能力實驗比較不同堅果提取物的體外抗氧化性能力，結果見圖1，其IC50值見表3。

圖1 七種堅果提取物的DPPH·清除能力Fig.1 DPPH· scavenging ability of seven nut extracts

表3 七種堅果提取物的DPPH·和ABTS+·清除能力的IC50值和槲皮素當量還原能力Table 3 The IC50 values of DPPH· and ABTS+·scavenging ability and quercetin equivalent reducing ability of seven different nut samples

注：*表示該數(shù)值用μg/mL表示；Q-槲皮素；同一列右上標的不同字母(a、b、c等)表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異(P<0.05)。

在測試濃度(0.05～10 mg DM/mL)，種植香榧、核桃、葵花籽和花生仁均具有較好的DPPH·清除能力，且其活性均隨樣品濃度的增加逐漸增加，而野生香榧、巴旦木和銀杏果的DPPH·清除能力較弱，當樣品濃度大于2 mgE./mL時才具有明顯的量效關系。7種堅果提取物的DPPH·清除能力均低于陽性對照(IC50值為0.01 mg E./mL)，但是相對于其他樣品，種植香榧表現(xiàn)出了最高的DPPH·清除能力，其IC50值為0.08 mg DM/mL，其次為核桃(0.14 mg E./mL)，銀杏果清除DPPH·的能力最低，其IC50值(11.45 mg E./mL)約為種植香榧葉的143倍。同時，野生香榧提取物清除DPPH·的能力遠低于種植香榧，其IC50值約為種植香榧的68.5倍。樣品的DPPH·清除能力變化趨勢與其總酚含量相似，因此種植香榧和核桃提取物中較高的DPPH·清除能力可能是由于其較高的總酚含量所致。植物提取物中總酚含量的高低對DPPH·清除能力具有顯著的影響，這一現(xiàn)象在多項研究中被發(fā)現(xiàn)，CALLI等[21]以DPPH·清除能力為導向，從核桃仁提取物中分離鑒定了香草酸、沒食子酸、原兒茶酸等7個酚類化合物。ZHAO等[22]對蘭花忍冬(LoniceracaeruleaL.)不同極性溶劑提取物的抗氧化活性進行研究時發(fā)現(xiàn)，樣品的DPPH·清除能力的強弱與總酚含量完全一致，即總酚含量越高，DPPH·清除能力也越強。ILAIYARAJA等[23]在對象橘(Feronialimonia)生物活性成分的提取條件進行優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，DPPH·清除能力與總酚含量的改變是呈正相關的。

2.5.2 ABTS+·清除能力

采用ABTS+·清除能力試驗比較不同堅果提取物的總抗氧化活性，結果如圖2所示，其IC50值如表3所示。

圖2 七種堅果提取物的ABTS+·清除能力Fig.2 ABTS+· scavenging ability of seven nut extracts

由圖2和表3結果可知，樣品的ABTS+·清除能力的變化趨勢總體上與其DPPH·清除能力相似，當百分清除率低于90%時，所有樣品的ABTS+·清除能力均表現(xiàn)出良好的劑量關系。不同堅果提取物清除ABTS+·的IC50值的變化趨勢為：核桃(0.07 mg E./mL)≈種植香榧(0.07 mg E./mL)<葵花籽(0.22 mg E./mL)<花生(0.43 mg E./mL)<銀杏果(0.92 mg E./mL)≈野生香榧(0.98 mg E./mL)<巴旦木(2.02 mg E./mL)。核桃和種植香榧具有最高的ABTS+·清除能力，且兩者之間不存在顯著性差異(P>0.05)，野生香榧和銀杏果的ABTS+·清除能力也不存在顯著性差異(P>0.05)。 前期研究也表明，核桃提取物[24]和香榧仁提取物[14]具有較高的ABTS+·清除能力。巴旦木的ABTS+·清除能力最低，其IC50值為核桃和種植香榧的28.9倍，但所有樣品的ABTS+·清除能力均低于陽性對照品槲皮素。

2.5.3 Fe3+還原能力

不同堅果提取物的Fe3+還原能力如圖3所示，其槲皮素當量還原能力(mg QuE/g E.)如表3所示。

圖3 七種堅果提取物的Fe3+還原能力Fig.3 Fe3+ reducing ability of extracts from seven nut extracts

當樣品濃度為0.3～2.4 mg E./mL時，核桃、種植香榧和葵花籽提取物的還原能力隨樣品濃度的增加呈明顯的量效關系，而巴旦木、花生和野生香榧提取物的還原能力隨樣品濃度的提高增加不明顯，其在700 nm處的吸光值僅由0.018增加到0.254。核桃提取物具有最高的Fe3+還原能力，其次為種植香榧，其槲皮素當量值分別為115.25和54.60 mg QuE/g E.。銀杏果提取物的還原能力最弱，當樣品濃度為0.475～2.375 mg E./mL時，其還原能力不隨樣品濃度的增加逐漸增加，700 nm處的吸光值僅由0.036增加到0.086。野生香榧提取物的Fe3+還原能力與銀杏果提取物沒有顯著性差異(P>0.05)，其Fe3+還原能力同樣弱于其他5種堅果提取物，其槲皮素當量值為0.49 mg QuE/g E.，約為核桃和種植香榧的1/235 和1/111。由此可見，種植香榧是一種較好的天然還原劑。

3 結論

本文首次將核桃、巴旦木、銀杏果、花生、葵花籽、野生和種植香榧等常見堅果進行比較，評價其活性成分含量及其抗氧化能力。研究結果表明，葵花籽中的總黃酮含量最高；核桃仁有最高的總酚含量，而種植香榧具有最高的總三萜含量?；钚苑治鲲@示，核桃和種植香榧提取物的體外抗氧化能力顯著高于巴旦木、銀杏果、花生、葵花籽和野生香榧，其中種植香榧提取物具有最高的DPPH·和ABTS+·清除能力，而核桃提取物的Fe3+還原能力最強，其次為種植香榧。因此，種植香榧是優(yōu)于巴旦木、銀杏果、花生、葵花籽和野生香榧的天然抗氧化劑資源，測試7種堅果的售價與其活性成分含量和生物活性不具有明顯的正向關系。本文可為人們選擇適合的堅果提供參考。