白耙齒菌F036液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化及纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)初步研究

肖瑤，楊建遠(yuǎn)*，張炳火，王萍蘭，楊云仙，查代明

1(九江學(xué)院 藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江西 九江，332000)2(九江學(xué)院 旅游與國(guó)土資源學(xué)院，江西 九江，332000)

纖維素是廣泛現(xiàn)存于自然界中的天然可再生資源。然而纖維素為高分子難降解聚合物，其廢棄物難以被充分利用。中國(guó)每年農(nóng)作物秸稈廢棄物就有約8億多噸，其利用率十分有限，大量有機(jī)廢棄物造成能源的極大浪費(fèi)[1]。由于世界能源危機(jī)問(wèn)題日益嚴(yán)重，纖維素的酶法水解再利用成為酶學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[2-3]。纖維素酶是指能夠水解各種天然纖維素為葡萄糖的一組酶系總稱，主要由三類功能不同但又互補(bǔ)的酶組成，即內(nèi)切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D- glucanohydrolasease，Cx酶)、外切葡聚糖酶(cellobiohydrases，C1酶)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，βG酶)，每個(gè)組分又有若干亞組分組成[4-5]。它們可以將纖維素分解為單糖或低聚糖，如今已廣泛用于紡織、能源、造紙、印染、洗滌、飼料、食品、釀酒等多個(gè)行業(yè)[6]。產(chǎn)纖維素酶的微生物主要有細(xì)菌、放線菌、真菌和一些原生動(dòng)物，其中細(xì)菌所產(chǎn)纖維素酶以Cx酶為主，但產(chǎn)酶量較低，故很少作為纖維素酶的生產(chǎn)菌株。放線菌生產(chǎn)的胞外酶大多具有一定耐堿性，而堿性纖維素酶活力較低，因此國(guó)內(nèi)外對(duì)放線菌產(chǎn)纖維素酶的研究也相對(duì)較少[7]。目前，研究產(chǎn)纖維素酶的微生物以真菌為主，如木霉屬[8-9]、曲霉屬[10]、青霉屬[11-12]、孢霉屬[13-15]及脈孢霉屬[16]等。真菌菌絲生長(zhǎng)時(shí)可橫穿次生壁進(jìn)入胞腔，從內(nèi)部到外部降解纖維素，導(dǎo)致纖維被全面徹底破壞；同時(shí)，真菌具有較全的纖維素酶酶譜，所產(chǎn)纖維素酶可分泌到胞外，產(chǎn)量較大，易分離提取[17]。目前，被廣泛認(rèn)可的纖維素酶作用機(jī)制是內(nèi)切β-葡聚糖酶和外切β-葡聚糖酶的協(xié)同作用，即內(nèi)切β-葡聚糖酶首先作用纖維素的非結(jié)晶區(qū)，形成C1能夠作用的游離纖維素末端，然后由C1從多糖鏈的還原末端或非還原末端切下纖維二糖單位，最后由β-葡聚糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖[18-20]。

實(shí)驗(yàn)室分離到1株具有產(chǎn)香特性的真菌菌株(No.F036)，經(jīng)形態(tài)學(xué)及ITS序列鑒定為白耙齒菌(Irpexlacteus)。經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，該菌株能夠生產(chǎn)高活性纖維素酶及木質(zhì)素酶[21]。研究該菌株液態(tài)發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)纖維素酶各酶系的影響條件及所產(chǎn)纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)，能夠?yàn)槠溥M(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)香白耙齒菌F036，實(shí)驗(yàn)室保藏；濾紙、微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、水楊素及3,5-二硝基水楊酸等為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HH-4型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；CT15RT型高速冷凍離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；SKY-2102型搖床，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；UV-1200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，馬鈴薯(去皮)200.0 g，加水至1.0 L，自然pH。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：碎濾紙條10.0 g，蛋白胨10.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.8 g，加水至1.0 L，調(diào)pH 5.5～6.0。

1.2.2 粗酶液的制備

取培養(yǎng)的液態(tài)發(fā)酵物，按1∶1(體積比)的比例加入0.1 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉(pH=5.2)緩沖液，混勻后于4 ℃條件下1 775×g離心15 min，取上清液，即為粗酶液，備用。

1.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定參照文獻(xiàn)方法略有改動(dòng)[21]。取干燥的葡萄糖0.125 g，溶于250 mL蒸餾水中，配成0.5 g/L的葡萄糖溶液，再分別取0、10、20、30、40和50 mL于50 mL的容量瓶中，加蒸餾水定容至50 mL，以0號(hào)容量瓶中蒸餾水作為空白對(duì)照，各取0.5 mL于10 mL試管，加入3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)試劑2.5 mL后終止反應(yīng)，沸水水浴顯色5 min，去離子水定容至5.0 mL，于550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。以葡萄糖質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 纖維素酶活力的測(cè)定[21]

1.2.4.1 濾紙酶(filter paper activity,FPA酶)活的測(cè)定

以3片打孔器打出的濾紙小圓片(已滅菌)為底物，取粗酶液0.5 mL，50 ℃恒溫水浴30 min，添加DNS 2.5 mL終止反應(yīng)，沸水浴顯色5 min，去離子水定容至5.0 mL，550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，再折算成酶活力。

1.2.4.2 外切葡聚糖苷酶活的測(cè)定

以0.5 mL 10 g/L或10 mg微晶纖維素溶液為底物，加入粗酶液0.5 mL，50 ℃恒溫水浴60 min，添加2.5 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴顯色5 min，去離子水定容至5.0 mL，550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，再折算成酶活力。

1.2.4.3 內(nèi)切葡聚糖苷酶活的測(cè)定

以1.5 mL 10 g/L羧甲基纖維素鈉鹽溶液(CMC溶液)為底物，加入粗酶液0.5 mL，50 ℃恒溫水浴30 min， 添加2.5 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴顯色5 min，去離子水定容至5.0 mL，550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，再折算成酶活力。

1.2.4.4 β-葡萄糖苷酶活的測(cè)定

以0.5 mL 0.5%水楊素溶液為底物，加入粗酶液0.5 mL，50 ℃恒溫水浴30 min，添加2.5 mL DNS終止反應(yīng)，煮沸顯色5 min后立即冷卻，去離子水定容至5.0 mL，于550 nm 波長(zhǎng)下比色，測(cè)定OD值，再折算成酶活力。

酶活力測(cè)定均是以其還原糖表示酶活力，以1 mL 粗酶液1 min水解底物產(chǎn)生1 mg葡萄糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位，如公式(1)。

(1)

式中：M，還原糖的質(zhì)量，mg；t，反應(yīng)時(shí)間，min；D，稀釋倍數(shù)；Ew，粗酶液體積，mL。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)表示為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值(mean value)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，SD)，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并進(jìn)行Duncan’s組間多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以標(biāo)準(zhǔn)糖溶液測(cè)定葡萄糖含量與吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.025 3x-0.092 6(R2=0.999 2)。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線推算各酶活力。

2.2 液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶規(guī)律

2.2.1 不同氮源對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

將活化的菌絲體分別定量接種于氮源為硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、蛋白胨和豆粉的產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基上，氮源添加量均為10 g，培養(yǎng)基調(diào)初始pH值為5.2，培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，4 d后提取發(fā)酵液，制備粗酶液測(cè)定各酶活力，選定最佳氮源(圖1)。

圖1 液態(tài)發(fā)酵條件下不同氮源對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.1 Effect of different nitrogen sources on the activity of cellulase

由圖1可知，氮源為蛋白胨時(shí)，F(xiàn)PA酶、C1酶、Cx酶和βG酶活力達(dá)到最高，分別為2.199、1.438、152.821 和11.788 IU/mL。陸晨等[23]從湖北神農(nóng)架保護(hù)區(qū)的森林腐質(zhì)土壤中篩選分離后得到1株高產(chǎn)纖維素酶真菌B-5，當(dāng)?shù)礊榈鞍纂藭r(shí)，B-5能夠達(dá)到最高酶活力。然而，趙連娣等[24]研究顯示，以硫酸銨為氮源時(shí)，綠色木霉L4C液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶達(dá)到最佳酶活力?？梢?jiàn)，本實(shí)驗(yàn)分離到的白耙齒菌F036在產(chǎn)纖維素酶方面與從湖北神農(nóng)架保護(hù)區(qū)的森林腐質(zhì)土壤中分離到的真菌B-5結(jié)果類似。蛋白胨為有機(jī)氮源，營(yíng)養(yǎng)成分多種多樣，含有豐富的氨基酸和多肽，為微生物的生長(zhǎng)提供了充足的養(yǎng)分，豆粉營(yíng)養(yǎng)成分含量相對(duì)蛋白胨較低，而硫酸銨，氯化銨，硝酸銨這些無(wú)機(jī)氮源營(yíng)養(yǎng)成分單一。所以，蛋白胨相比于豆粉和這些單一氮源對(duì)酶生長(zhǎng)有良好的促進(jìn)作用。本菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中選用蛋白胨為氮源。

2.2.2 初始pH對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

在最佳氮源為蛋白胨的情況下，將產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基初始pH分別調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和 9.0， 其余成分不變，培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，4 d后提取發(fā)酵液測(cè)定酶活，選定最佳初始pH(圖2)。

由圖2可知，當(dāng)初始pH為5.0時(shí)，Cx酶和βG酶活力達(dá)到最高，分別為257.923和13.586 IU/mL；當(dāng)初始pH為6.0時(shí)，F(xiàn)PA酶和C1酶活力達(dá)到最高，分別為3.131和1.412 IU/mL。

可見(jiàn)，在偏酸性、中性、偏堿性條件下，該菌株都有產(chǎn)纖維素酶活性，但是在pH 9.0時(shí)，該菌株幾乎不產(chǎn)纖維素酶。曾青蘭等[25]在腐爛的稻草秸稈中分離到一株絲狀真菌Gibberellafujikuroi，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基pH為5.0～6.0時(shí)Gibberellafujikuroi產(chǎn)纖維素酶酶量達(dá)到最高，F(xiàn)PA酶和Cx酶活分別達(dá)到0.344和1.723 IU/mL。最適pH值與本研究的白耙齒菌F036的最適培養(yǎng)基初始pH值相近。因?yàn)?株菌都是耐酸性的真菌(本實(shí)驗(yàn)菌株F036的最適生長(zhǎng)pH為5.0～6.0)，在偏酸條件下生長(zhǎng)產(chǎn)酶較好，當(dāng)初始pH越接近酶的最適生長(zhǎng)pH，纖維素底物的消耗速率越高，發(fā)酵液中纖維二糖的產(chǎn)率也就越高[26]。此外，在選擇培養(yǎng)基適宜pH時(shí)，還要考慮到酶生長(zhǎng)代謝物對(duì)培養(yǎng)基的影響。因此，本菌最適產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵pH為5.0～6.0。

圖2 不同初始pH液態(tài)發(fā)酵條件對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.2 Effect of initial pH on the activity of cellulase

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

確定最佳氮源和初始pH的情況下，將活化的菌絲體分別定量接種于含有濾紙條誘導(dǎo)物的產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，每天同一時(shí)間取發(fā)酵液，制備粗酶液測(cè)定各酶活力，取樣至第8天，選定最佳培養(yǎng)時(shí)間(圖3)。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.3 Effect of culture time on the activities of cellulose

由圖3可知，3～4 d時(shí)，產(chǎn)酶量增加最為顯著(P<0.05)， 4 d后酶活趨于平穩(wěn)，可見(jiàn)4～7 d為主要產(chǎn)酶階段，在4 d時(shí)，F(xiàn)PA酶、Cx酶和βG酶酶活達(dá)到最高，分別為2.058、174.536和3.079 IU/mL，在5 d 時(shí)，C1酶酶活達(dá)到最高，為1.401 IU/mL，其中Cx酶酶活顯著高于(P<0.05)FPA酶、C1酶和βG酶，此現(xiàn)象也出現(xiàn)在宋賢沖等[27]篩選的木霉屬菌株F01中，菌株F01的FPA酶、C1酶和Cx酶活力分別為0.12、 0.10和4.00 IU/mL。而甄靜等[28]研究的球孢枝孢菌GC2-2所產(chǎn)的CMC酶(Cx酶)活力卻低于FPA酶活力，同樣的現(xiàn)象在黃春凱等[29]研究的菌株中也有報(bào)道。纖維素酶系作用的底物不同表現(xiàn)出酶活力會(huì)有不同，該菌液態(tài)發(fā)酵的酶液中，當(dāng)作用的底物為羧甲基纖維素鈉時(shí)酶活力達(dá)到最高，而以濾紙、微晶纖維素為底物時(shí)酶活力都更低。這可能的原因?yàn)闉V紙和微晶纖維素的結(jié)構(gòu)與天然纖維素更為相似，而羧甲基纖維素鈉卻是纖維素的衍生物，與天然纖維素相比會(huì)暴露出更多與纖維素酶結(jié)合的位點(diǎn)[27]。同時(shí)，該菌所產(chǎn)Cx酶酶活力明顯高于已報(bào)道的多數(shù)菌株。例如，韓愈杰等[30]篩選的枝頂孢屬菌株H-3，優(yōu)化后Cx酶活為13.57 IU/mL；韓樹(shù)英等[31]獲得的褐腐真菌CY-2012，Cx酶酶活最高為21.71 U/mL；鄒瀟瀟等[32]分離的草酸青霉DF14101菌株的發(fā)酵液中的Cx酶酶活力最高為43.98 U/mL。從其發(fā)酵時(shí)間影響條件下所產(chǎn)纖維素酶活力曲線趨勢(shì)看，F(xiàn)PA酶、C1酶、Cx酶及βG酶的產(chǎn)酶趨勢(shì)基本一致，液態(tài)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)4 d時(shí)，纖維素酶活逐漸下降，這是因?yàn)榘l(fā)酵后期已生產(chǎn)的酶失活或分解，及菌體自身的衰老，故產(chǎn)酶量有所下降。因此，本菌產(chǎn)纖維素酶最佳培養(yǎng)時(shí)間為4 d。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 反應(yīng)溫度對(duì)纖維素酶酶活力的影響

以優(yōu)化后的產(chǎn)酶條件進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，制備粗酶液。將酶促反應(yīng)溫度分別設(shè)置為30、40、50、60、70 和80 ℃，按1.2.3方法在各個(gè)溫度下進(jìn)行4個(gè)酶的酶促反應(yīng)，測(cè)定各酶活力，選定最佳反應(yīng)溫度(圖4)。

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)產(chǎn)纖維素酶活力的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on the activities of celluloses

由圖4可知，從40 ℃增加到50 ℃時(shí)，各酶酶活力增加最為顯著(P<0.05)，并且均達(dá)到最高。FPA酶、C1酶、Cx酶和βG酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，其酶活力分別為3.663、2.217、587.530和23.290 IU/mL，這與趙萍等[33]從枯葉下的土壤中分離得到的羊毛狀青霉(Penicilliumlanosum)PL2的酶學(xué)性質(zhì)類似，該菌株在反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)Cx酶活力最高，達(dá)到26.50 mg/L。βG酶的溫度耐受泛圍相對(duì)較大，在70 ℃下還能保持較高的酶活，這與梁翠誼等[34]從枯葉下的土壤中分離篩選得到得肉座菌Hyppcreasp. W63所產(chǎn)βG酶相似。隨著反應(yīng)溫度繼續(xù)增加到80 ℃，各酶酶活力也逐漸下降并不斷趨近于0。因?yàn)闇囟冗^(guò)高會(huì)使酶失活，而溫度太低不能達(dá)到酶的最適反應(yīng)條件?？梢?jiàn)，該菌株所產(chǎn)纖維素酶最佳酶促反應(yīng)溫度為50 ℃。

2.3.2 反應(yīng)pH對(duì)纖維素酶酶活力的影響

配制pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，pH為分別7.0、8.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液，用不同pH緩沖液稀釋粗酶液，并分別用各pH緩沖液配置10 g/L微晶纖維素溶液、10 g/L羧甲基纖維素鈉(CMC)溶液、5 g/L水楊素溶液。按1.2.3方法在各個(gè)pH下進(jìn)行4個(gè)酶的酶促反應(yīng)，測(cè)定各酶活力，選定最佳反應(yīng)pH(圖5)。

圖5 反應(yīng)pH對(duì)產(chǎn)纖維素酶活力的影響Fig.5 Effect of reaction pH on the activities of celluloses

由圖5可知，隨著pH的增加，產(chǎn)纖維素酶(FPA酶、C1酶、Cx酶和βG酶)活力呈現(xiàn)明顯的先增加后下降的趨勢(shì)。反應(yīng)pH為5.0時(shí)FPA酶、C1酶、Cx酶和βG酶活力都達(dá)到最高，分別為2.309、0.483、118.881和4.181 IU/mL，這與聶志強(qiáng)[35]于土壤中分離到的一株高產(chǎn)纖維素酶的綠色木霉菌S5相似，綠色木霉菌S5與白耙齒菌F036同為耐酸菌，反應(yīng)pH為5.5 時(shí)，S5所產(chǎn)纖維素酶相對(duì)酶活達(dá)到100%，在高于和低于5.5時(shí)，相對(duì)酶活均在100%以下。其原因在于pH值的改變會(huì)影響酶活性部位的解離，在最適反應(yīng)pH值時(shí)，纖維素酶分子上活性基團(tuán)所處的解離狀態(tài)最容易和底物相結(jié)合，當(dāng)高于或低于最適pH值時(shí)，纖維素酶活性基團(tuán)的解離狀態(tài)發(fā)生了變化，酶和底物結(jié)合的作用力隨之降低[36]，導(dǎo)致纖維素酶催化反應(yīng)的速率降低?？梢?jiàn)，白耙齒菌F036所產(chǎn)纖維素酶的最適反應(yīng)pH為5.0。

2.3.3 不同金屬離子對(duì)纖維素酶酶活力的影響

分別配制0.3 mg/mL FeSO4、CuSO4、MnSO4、CoCl2、Fe2(SO4)3、K2SO4、ZnSO4、CaCl2和MgSO4溶液。按1.2.3方法在各酶反應(yīng)體系中添加各金屬離子溶液0.5 mL，空白對(duì)照組添加去離子水0.5 mL，進(jìn)行4個(gè)酶的酶促反應(yīng)，測(cè)定各種金屬離子對(duì)酶活力的影響(圖6)。

圖6 不同金屬離子對(duì)產(chǎn)纖維素酶活力的影響Fig.6 Effect of different metal ions on the activities of celluloses

由圖6可知，當(dāng)粗酶液中金屬離子質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL 時(shí)，對(duì)FPA酶活力的促進(jìn)作用的離子為Mg2+、Zn2+、K+、Ca2+、Co2+、Fe3+和Fe2+，其促進(jìn)率分別為15.93%、14.38%、12.36%、7.54%、6.14%、4.66%和4.35%，而抑制FPA酶活力的離子為Mn2+，抑制率為24.09%， Cu2+對(duì)FPA酶無(wú)明顯影響(P>0.05)；對(duì)C1酶活力促進(jìn)作用為Cu2+，其促進(jìn)率達(dá)8.07%，而對(duì)C1酶有抑制作用的離子為：Mn2+、Zn2+、Co2+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、K+和Ca2+，其抑制率分別為28.60%、16.41%、15.88%、12.35%、8.23%、5.77%、 4.60%和3.26%；對(duì)Cx酶有促進(jìn)作用的離子為：Fe2+、Co2+、K+和Ca2+，其促進(jìn)率分別為28.95%、11.69%、1.53%和1.19%，而對(duì)Cx酶有抑制作用的離子為：Zn2+、Cu2+、Mg2+和Fe3+，其抑制率分別為12.09%、11.03%、9.70%和6.83%，Mn2+對(duì)Cx酶無(wú)明顯作用(P>0.05)；對(duì)βG酶有促進(jìn)作用的離子為：Co2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、K+和Fe3+，其促進(jìn)率分別 為44.07%、28.12%、16.97%、6.07%、3.55%和1.82%，而Ca2+、Zn2+、Mg2+對(duì)βG酶活力無(wú)明顯作用(P>0.05)，未發(fā)現(xiàn)對(duì)βG酶有明顯抑制作用的離子。

在王金成[37]的研究中，添加4 mg/g的Fe2+和9 mg/g 的Mn2+均能達(dá)到最高糖化率。韓龍等[38]研究表明金屬離子對(duì)HD 1031的纖維素酶有正向促進(jìn)作用，Ca2+和Mg2+對(duì)酶的促進(jìn)作用明顯，而Mn2+對(duì)酶有抑制作用。某些金屬離子可能會(huì)導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響酶與底物的接觸面積，但對(duì)于不同離子，其影響酶的活力要求的濃度存在差異。離子種類及濃度的不同，對(duì)各酶活力有不同的影響，因此，添加適量的金屬離子有助于提高酶活力[34]。本實(shí)驗(yàn)在質(zhì)量濃度0.15 mg/mL下，有可能還未達(dá)到某些離子最適促進(jìn)酶活所需的濃度。

3 結(jié)論

白耙齒菌F036液態(tài)發(fā)酵最佳產(chǎn)纖維素酶條件為：培養(yǎng)基包含KH2PO4，MgSO4·7H2O及碎濾紙條，以蛋白胨為氮源，初始pH為5.0～6.0，發(fā)酵4 d。在此產(chǎn)酶條件下，發(fā)酵液中FPA酶、C1酶、Cx酶及βG酶活力最高可分別達(dá)到2.058、1.401、174.536、3.079 IU/mL，其中Cx酶活力明顯比FPA酶、C1酶及βG酶高?？梢?jiàn)，白耙齒菌F036菌株產(chǎn)Cx酶具有明顯優(yōu)勢(shì)。

白耙齒菌F036液態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)纖維素酶的FPA酶、C1酶、Cx酶及βG酶的最適反應(yīng)pH均為5.0；最適反應(yīng)溫度均為50 ℃；金屬離子質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL時(shí)，Mg2+對(duì)FPA酶有最大促進(jìn)作用，Cu2+對(duì)C1酶有較弱促進(jìn)作用，而Mn2+對(duì)FPA酶及C1酶有最明顯抑制作用，F(xiàn)e2+對(duì)Cx酶有最大促進(jìn)作用，Zn2+對(duì)Cx酶有最明顯抑制作用，Co2+對(duì)βG酶具有最顯著促進(jìn)作用。