耐酸乳酸桿菌物種特異性引物設計及其在古井貢酒窖泥酒醅質量評價中的初步應用

劉倩倩，李俊薇，曹潤潔，張會敏,何宏魁*，李安軍，張治洲*

1(哈爾濱工業(yè)大學(威海) 海洋科學與技術學院,山東 威海,264209)2(安徽古井貢酒股份有限公司,安徽 毫州,236800)

白酒是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，有著悠久的歷史，從古至今一直備受青睞[1]。中國傳統(tǒng)白酒是以富含淀粉質的糧谷類為原料，以酒曲為糖化劑，采用固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵，經(jīng)蒸餾、貯存和勾調而成的乙醇飲料[2]。由于白酒的釀造廠區(qū)建設時間以及地域的差異，不同窖池中酸類物質組成成分和含量有較大差異[3]，其中乳酸桿菌(Lactobacillus)的含量在新窖池和老窖池之間存在較大差異[3-5]；該菌屬的含量超過一定閾值后將嚴重影響酒質[6]。在濃香型白酒領域，乳酸桿菌及其具體系列物種的生物學功能、尤其是其在固態(tài)發(fā)酵各個階段中的具體功能，尚未得到充分的探索。

在白酒生產中，乳酸菌在白酒口味及香味上發(fā)揮很重要的作用。乳酸菌能發(fā)酵糖類生成乳酸，在酒醅內通過酯化作用產生乳酸乙酯，乳酸乙酯被蒸入酒中，使白酒具有獨特的香味[7]。乳酸桿菌也是窖泥中主要的微生物之一，往往與丁酸菌、己酸菌、甲烷菌、硫酸鹽還原菌、硝酸鹽還原菌等菌類共存“共生”，當乳酸菌混入入窖的料醅后，會爭奪葡萄糖等糖類物質為發(fā)酵原料而生成乳酸。有的乳酸菌還同時生成少量的乙酸、乙醇、丙酸、丁酸、丙酮酸等物質[8]，共同調節(jié)酒體風味。在酒類發(fā)酵過程中由于酒精含量等環(huán)境壓力使微生物的生長受限，少數(shù)種類的細菌在這種條件下保持活力，可能被認定為酒類腐敗微生物。L.acetotocerans被證實是一種培養(yǎng)較困難，且經(jīng)常出現(xiàn)在中國南方的釀酒廠中的一種微生物；它具有產生乳酸的能力[9]。一方面，白酒的生產需要適量的乳酸；另一方面，這種菌含量過多時帶來的綜合效果嚴重影響酒類口感[6]。啤酒類發(fā)酵對于該菌的研究也不在少數(shù)，乳酸桿菌是啤酒發(fā)酵過程中常見的菌種[10-11]。我國四川理工學院四川省釀酒生物技術及應用重點實驗室通過對四川某濃香型白酒股份有限公司20年窖齡的窖池上、中、下取樣后分析得到，其中優(yōu)勢菌群Clostridiumdiolis及Lactobacillusacetotolerans在上、中、下層窖泥中所占比例分別為34.9%和39.8%、25.2%和20.6%以及23.8%和36.6%[12]。2015年Elsevier B.V.公司發(fā)表了一篇文章[13]，從日本清酒中分離出LactobacillusacetotoleransRIB 9124 (NBRC 13120)株菌，在這篇報道中首次公開了L.acetotoleransstrain的全基因組序列，并對其進行命名[9]。該文章公開的L.acetotocerans全基因組序列為本實驗中物種特異性引物設計奠定了基礎。

根據(jù)古井貢酒窖泥和酒醅樣本中已獲悉的菌群信息[14-18]，我們發(fā)現(xiàn)其中L.acetotocerans在酒醅中占主導地位，含量非常高，且明顯高于窖泥中L.acetotocerans的含量。國內外對該乳酸桿菌的研究已經(jīng)很多，主要針對微生物的功能性研究，而通過特異性引物對該菌含量的快速檢測方法報道非常少。另外，數(shù)據(jù)庫中顯示Lactobacillus這個屬不同的物種已經(jīng)有70多個基因組全序列，這為本研究中設計L.acetotocerans的物種特異性引物提供了更多的背景信息，而PRIMER-BLAST這個引物設計平臺可以把這70多個全基因組全部考慮進去，這樣設計的引物就會有更好的特異性，可以用于窖泥酒醅等發(fā)酵樣本中L.acetotocerans含量的快速測定，其數(shù)據(jù)可為窖泥等釀酒樣本質量評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

該試驗涉及的材料取自安徽省亳州市古井貢酒公司不同等級窖池的12個窖泥樣本和12個酒醅樣本。

利用基因組提取試劑盒提取上述樣本的宏基因組以及純菌種的基因組?；蚪MDNA經(jīng)紫外分光光度計測定濃度后統(tǒng)一稀釋為10 ng/μL用作PCR的模板以及QPCR的定量模板。

所用的純菌菌種均購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)。

Step-One Real-Time PCR系統(tǒng)(QPCR)、HC-3018R高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；JY-300C電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司；WD-9413凝膠成像儀，北京六一儀器廠；TP600(TaKaRa)Q-PCR儀、Ezup柱式基因組提取試劑盒(B518251)，上海生工；NPK02、NPK62 PCR試劑盒，威海曉東生物；pMD19-T kit TA克隆試劑盒，Takara。

1.2 利用Primer-Blast設計特異性引物

檢索EBI中Genome數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/genomes/)，檢索到70個除L.acetotocerans外的乳桿菌菌種，表1用作引物設計的背景序列，利用Primer-Blast[19]對L.acetotocerans的全基因組序列設計物種特異性引物，并用Blast對已設計的引物進行驗證，篩選出2對優(yōu)質引物。設計L.acetotocerans物種的特異性引物的目的一般基于兩個，一是鑒定該物種，以及檢測某一生物群落中是否包含該物種，二是確定該物種在整個微生物群落中的豐度[20-22]。

表1 EBI數(shù)據(jù)庫中71個有全基因組序列的乳酸桿菌菌株信息Table 1 71 Lactobacillus strains with whole genome sequences found in the EBI database

1.3 利用普通PCR檢測引物特異性

利用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)對兩對引物的特異性進行驗證。分別采用12個窖泥基因組、12個酒醅基因組DNA作為實驗模板， PCR反應體系為：NPK02 buffer(2×) 6 μL,物種特異性引物LA2(LA3)1.5 μL，模板0.5 μL,Taq酶0.3 μL，ddH2O 3.7 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃、4 min； 94 ℃、30 s，60 ℃(引物LA2) 或63 ℃(引物LA3)40 s， 72 ℃、40 s，37個循環(huán)；72 ℃, 2 min。取8 μL 反應液進行10 g/L瓊脂糖凝膠(120V，20 min)電泳。

1.4 利用PCR產物測序進行引物特異性評估

上述PCR產物可以直接用于TA克隆。pMD19-T載體 0.3 μL，LA2(或LA3)擴增的PCR產物0.5 μL，滅菌ddH2O 4.2 μL，Solution I 5 μL，混勻，室溫連接1小時后放入冰浴，加入冰冷的30 μL大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α并混勻，冰浴放置40 min。再加入1 mL普通LB培養(yǎng)基溶液，于37 ℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)活化1 h。將X-gal 40 μL(10 mg/mL)，IPTG 40 μL(10 mg/mL)， 160 μL dH2O混勻，涂布于LBA固體培養(yǎng)基，待其干燥，將活化的菌液200 μL繼續(xù)涂布于X-gal和IPTG干燥后的LBA固體培養(yǎng)基上。37 ℃ 恒溫過夜培養(yǎng)。篩選單克隆(圖1)。將篩選的單克隆37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行單菌落測序。利用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具，比對測序結果，根據(jù)測序結果鑒定篩選的單克隆是否含有L.acetotolerans的特異性DNA序列。

A-LA2;B-LA3圖1 利用兩對引物LA2和LA3擴增產物得到的TA克隆Fig.1 TA clones of PCR amplicons by primer pair LA2 and LA3

1.5 利用純Lactobacillus菌株驗證L. acetotolerans引物特異性

涉及到的純菌株為:(P1)耐酸乳桿菌Lactobacillusacetotolerans(實驗室自備)；(P2)植物乳桿菌Lactobacillusplantarum(CICC20265)；(P3)發(fā)酵乳桿菌Lactobacillusfermentum(CICC22808)；(P4)干酪乳桿菌Lactobacilluscasei(1.320 6)；(P5)嗜酸乳桿菌Lactobacillusacidophilus(1.334 2)；(P6)德式乳桿菌乳亞種Lactobacillusdelbrueckiisubsp. Lactis(1.262 5)。

1.6 QPCR測定

使用篩選出來的兩對特異性引物對12個窖泥樣本和12個酒醅樣本基因組DNA做QPCR定量實驗。根據(jù)標準曲線、熔解曲線、指數(shù)增長曲線，以及copy數(shù)計算來對L.acetotolerans的含量做初步檢測及綜合質量評估。以用于測序的PCR純化產物連續(xù)稀釋10倍作為標準。陰性對照、每個用于制作標準曲線的標準樣本以及待測樣本均重復3次。使用的PCR擴增體系為NPK62(含熒光染料)6 μL，特異性引物1.5 μL，Taq酶0.25 μL，基因組模板4.25 μL。QPCR條件為94 ℃,4 min (94 ℃,30 s;57 ℃,40 s;72 ℃,40 s)，42個循環(huán)，72 ℃,2 min。

2 結果與分析

2.1 引物設計與分析

通過對L.acetotolerans全基因組進行物種特異性引物設計，在1435181處設計上游引物LA2F：5′-GTG CAG CTT AAG GGC TTC CT-3′(20 bp)，在1435320處設計下游引物LA2R：5′- ATC TGT GCA GAT TGT TCC CTT-3′(21bp)，擴增片段長度194 bp；在1702025處設計上游引物LA3F：5′- AGA GTG TCC CGA GTA GTC CC-3′(20bp)，在1702133處設計下游引物LA3R：5′- AAC TGC TCA AGA AGG GAC CG-3′(20bp)，擴增片段長度為150 bp。

2.2 PCR擴增兼TA克隆/測序鑒定引物特異性

使用TA克隆技術手段對古井實際樣本做了特異性引物驗證并挑選陽性克隆，并對陽性克隆進行單菌落測序，測序結果如表2、表3所示。結果顯示，對LA215個克隆進行測序，克隆序列均為目標序列，有效序列的成功率為100%；對LA314個克隆進行測序，克隆序列均為目標序列，有效序列的成功率也是100%。

2.3 利用乳桿菌純菌株進一步驗證引物特異性

以LA2、LA3這兩對物種特異性引物分別對上述6株乳酸桿菌純菌基因組(樣本順序依次為A，B，C，D，E，F(xiàn))進行PCR擴增實驗，結果如圖2，兩對引物均只從P1樣本(L.acetotolerans)中擴增出來目的條帶，說明引物的特異性較好。

表2 引物LA2 TA克隆Blast結果Table 2 Primer LA2 TA cloning blast results

表3 引物LA3 TA克隆Blast結果Table 3 Primer LA3 TA clone Blast results

圖2 L.a菌特異性引物LA2(A)和LA3(B)對6株乳酸桿菌純菌基因組的PCR擴增實驗Fig.2 PCR amplification using L.a-specific primer LA2 (A) orLA3 (B) and genomic DNA of 6 pure Lactobacillus strains注：M-DL2000 DNA marker (2 000, 1 000, 750,500,250和100 bp)，圖3同。

2.4 使用2對特異性引物對窖泥和酒醅中L.acetotolerans進行檢測

PCR擴增結果(圖3)顯示，在相同的擴增條件下(其中PCR熱循環(huán)數(shù)為37)，普通窖泥的條帶較優(yōu)質窖泥更清晰明亮，普通酒醅的條帶較優(yōu)質酒醅更清晰明亮，酒醅條帶較窖泥更清晰明亮，與理論預期一致。

A-窖泥樣品LA3；B-窖泥樣品LA2；C-酒醅樣品LA3；D-酒醅樣品LA2圖3 兩對引物的普通PCR擴增結果Fig.3 PCR results of two pairs of primers注：A、B代表老窖池，C代表新窖池;N代表窖泥樣，P代表酒醅樣本。

結果為酒醅中該菌含量明顯多于窖泥，普通酒醅中該菌含量明顯多于優(yōu)質酒醅，普通窖泥中該菌含量明顯多于優(yōu)質窖泥。在循環(huán)數(shù)較小的前提下，使用普通PCR可以對樣本中的L.acetotolerans含量進行半定量。

2.5 利用QPCR定量比較樣本中L.acetotolerans含量的相對多寡

作為兩對引物在古井發(fā)酵樣本質量評估中的初步應用，將古井貢酒12個窖泥樣本和12個酒醅樣本進行QPCR實驗，以此來對窖泥和酒醅樣本中L.acetotolerans的含量進行檢測，結果如圖4所示。熔解曲線(未提供)均為比較集中接近的單峰，說明這兩對引物特異性符合QPCR的定量要求。兩對引物的定量結果總體趨勢一致，即酒醅中L.acetotolerans的相對含量明顯高于窖泥，尤其是遠高于老窖泥。

圖4 利用兩對引物和QPCR測定12個窖泥樣本和12個酒醅樣本中菌的(相對)含量Fig.4 QPCR quantification results of L. acetotoleransin 12 pitmud and 12 Zaopei samples

3 討論

目前，窖泥的質量評估主要根據(jù)其色澤、氣味、手感以及質地等感官特征為判別的重要指標[23]，如優(yōu)質老窖窖泥質感細膩，氣味濃郁芳香，老化窖泥則較為干燥，容易板結成塊，無芳香氣味[24]。理化指標和菌群指標都可以用來衡量窖泥、醩醅等發(fā)酵樣本的質量特征，以避免使用感官特征對窖泥進行實時評估與檢測所對應的局限性。目前可以檢測菌群特征的技術非常多，比如PCR-SSCP法可對窖泥微生物群落結構進行分析[25]。通過檢測單一菌種來輔助判斷發(fā)酵樣本的質量好壞也是一種重要的方法，比如徐巖等設計了特異性引物可以對發(fā)酵食品中耐酸乳桿菌進行定性定量[26]，但是其設計的引物與本研究設計的引物在序列內容和在L.acetotolerans基因組中的位置均不同。

本文中的QPCR測定結果表明老窖泥中L.acetotolerans的含量明顯低于新窖泥，但是不是絕對的。個別新窖池的窖泥也具有很低的含量，原因尚不清楚，需要進一步觀察研究。但是如果L.acetotolerans在窖泥中的含量很高則肯定不是老窖泥。圖3中的NC3樣本(新窖池窖泥樣本)使用兩個引物對擴增的結果都很低，但是應該不是取樣誤差帶來的問題，因為每一個窖泥樣本都是一個窖池內進行9點等量取樣后再等量均勻混合得到的混合樣本[5]。另外，個別酒醅樣本利用LA2引物對測定的L.acetotolerans含量也較低，但是使用LA3測定的結果很高(如PC1樣本)。不過這些不一致暫時還說明不了LA2和LA3引物對到底哪個定量更準確，可以在使用的過程中逐步確定最佳的定量引物。

高通量測序結果顯示[3]，古井貢酒酒醅中至少含有49種不同的乳酸桿菌(Lactobacillus),它們中間85%以上都是L.acetotolerans。酒醅中如此分布的乳酸桿菌(Lactobacullus)之間如何相互作用是一個很有趣的問題，值得研究人員思索和探究。其他種類的乳酸桿菌也可以使用相同的方法設計物種特異性引物并測定各自在發(fā)酵過程中的含量變化。本研究設計的引物以71種不同的乳酸桿菌基因組為背景，所以本文中的兩對引物測定的絕大部分只是L.acetotolerans的含量，基本不包含其他乳酸桿菌的含量信息。

本研究中使用的12個窖池的出酒質量都經(jīng)過仔細的品評和香味成分分析[3]。白酒的質量總體上是B廠區(qū)(百年窖池)好于A廠區(qū)(40年窖池)，C廠區(qū)屬于新廠區(qū)，出酒質量排在最后?？傮w來講，窖泥中耐酸乳酸桿菌的含量與白酒品質存在明確的負相關關系。而酒醅中L.acetotolerans的含量與酒體質量之間的關系尚未見明顯的規(guī)律。C廠區(qū)不同池子的窖泥中L.acetotolerans的含量差異與酒體質量并不完全對應，提示新廠區(qū)的窖池整體菌群尚處于調整階段，菌群結構上不像老廠區(qū)那樣穩(wěn)定。這一點可能反映在L.acetotolerans含量的波動上。

徐巖等申報的專利[26]提供了一對L.acetotolerans的特異性引物，其設計方法的特異性驗證手段與本文類似。從其專利公開的數(shù)據(jù)來看，引物的特異性和QPCR定量效果都非常好。但是本文并沒有比較他們的這對引物與本文中2對引物在測定24個樣本中的特異性差異和QPCR定量結果差異。主要原因在于，不同白酒的不同發(fā)酵樣本中菌群的組成差異較大，L.acetotolerans的幾對引物面向不同的樣本中菌群基因組背景差異很大時，各自表現(xiàn)出來的物種特異性程度肯定是不同的?；蛘哒f，到底哪一對引物的物種特異性最好取決于使用的具體的樣本，研究人員需要在實際的測試過程中找到適合所用樣本的最佳引物。