補(bǔ)充維生素D3協(xié)同第二代抗組胺藥物治療慢性自發(fā)性蕁麻疹的臨床療效觀察和作用機(jī)制研究

易 紅 宋玉杰 江 珊 史 贏 萬 靜 雷鐵池

近60%～70%的慢性自發(fā)性蕁麻疹(chronic spontaneous urticaria，CSU)很難找到確切致敏原因[1]。第二代抗組胺藥是治療CSU的主要藥物。然而，一些CSU患者對(duì)單一抗組胺藥物治療反應(yīng)較差，停藥后皮疹再發(fā)[2]。近年來發(fā)現(xiàn)約91.3%的CSU患者存在VD3不足甚至缺乏[3]。本研究比較CSU患者補(bǔ)充VD3后對(duì)抗組胺藥物治療反應(yīng)性的變化，旨在探討VD3在CSU發(fā)病中的作用以及協(xié)同治療CSU的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 90例CSU和21例CIndU患者均來自2017年10月至2018年10月武漢大學(xué)人民醫(yī)院皮膚科門診，另招募55名健康自愿者(均排除自身免疫性疾病和過敏性疾病等)作為健康對(duì)照組。三組人群性別和年齡構(gòu)成比基本相似。CSU患者的入選標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[3,4]。本研究經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組前所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限公司)，植物血凝素(PHA)、1α,25-(OH)2D3(美國Sigma公司)，胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，CCK-8試劑盒(廣州奕元生物科技有限公司)，RPMI 1640培養(yǎng)基、Trizol、RT-PCR試劑盒(美國Invitrogen公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(大連Takara公司)，CFX connect熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 分組與VD3補(bǔ)充治療 入組時(shí)所有入組患者和健康對(duì)照組進(jìn)行血清25-(OH)D3、D-dimer、FDP、ESR水平測定。入組患者填寫關(guān)于UAS7評(píng)分的量表。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[5], 25-(OH)D3<10 ng/mL被認(rèn)定為嚴(yán)重缺乏，10～20 ng/mL為缺乏，20～30 ng/mL為不足，≥30 ng/mL為正常。UAS7總分為42分，0～14分為輕度，15～28分為中度，29～42分為重度[6]。

將VD3嚴(yán)重缺乏及缺乏的CSU患者隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組，對(duì)照組僅用一種第二代抗組胺藥，治療組除第二代抗組胺藥外補(bǔ)充VD3。VD3嚴(yán)重缺乏組的治療組每天補(bǔ)充2400 IU VD3，6周后復(fù)測VD3并調(diào)整用量，再治療6周，而VD3缺乏組的治療組每天補(bǔ)充800 IU VD3，6周后減為400 IU維持治療6周。所有患者均在6和12周復(fù)診，進(jìn)行UAS7評(píng)分，并監(jiān)測不良反應(yīng)的發(fā)生。治療中如發(fā)現(xiàn)有25-(OH)D3>100 ng/mL，血鈣>2.52 mmol/L，停止補(bǔ)充VD3。

1.4 CCK-8法檢測PBMC增殖率 PBMC分離后，以(1～2)×106/mL濃度接種于96孔板中，加入不同濃度的PHA(終濃度分別為1、3、10、30、100 μg/mL)及空白組(培養(yǎng)基)，于37 ℃，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)69 h，每孔加入CCK-8 20 μL后繼續(xù)培養(yǎng)3 h，在酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光值(OD)。細(xì)胞增殖率(%)=(OD處理組-OD對(duì)照組)/OD對(duì)照組×100%。

1.5 PBMC分離與體外培養(yǎng) 抽取15例CSU及15名健康自愿者靜脈血10 mL，用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。1α,25-(OH)2D3溶解于DMSO。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和參照文獻(xiàn)[7],選用對(duì)細(xì)胞增殖無影響的兩個(gè)濃度(1 nM和10 nM 1α,25-(OH)2D3)處理體外培養(yǎng)的PBMC。將CSU患者PBMC分為3組，分別加入含10 μg/mL PHA(含等體積的DMSO)，10 μg/mL PHA +1 nM 1α,25-(OH)2D3和10 μg/mL PHA +10 nM 1α,25-(OH)2D3的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃，5% CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。離心后收獲細(xì)胞用于細(xì)胞總RNA抽提。

1.6 qPCR檢測PBMC IL-6和VDR mRNA水平 用Trizol法抽提PBMC總RNA。取1.5 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：37℃ 10 min，37℃ 50 min，70℃ 15 min，4℃維持。引物序列：人IL-6，正義，5-TCAGCCCTGAGAAAGGAGACAT-3；反義，5-GCTCTGGCTTGTTCCTCACTACT-3；人VDR，正義，5-CAAGGACAACCGACGCCA-3；反義，5-TCCCTCCACCATCATTCACAC-3；內(nèi)參GAPDH，正義，5-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3；反義，5-GGAAGATGGTGATGGGATTTC-3。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火40 s，70℃延伸30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。熔解曲線的反應(yīng)條件為：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。

1.7 其他檢測方法 血漿D-dimer、FDP(免疫比濁法)，ESR(快速血沉法)，血清25-(OH)D3水平(超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法)等均由本院臨床檢驗(yàn)中心完成。自體血清皮膚試驗(yàn)(ASST)和自體血漿皮膚試驗(yàn)(APST)參照本實(shí)驗(yàn)室以前報(bào)道的方法[8]。

2 結(jié)果

2.1 受試者血清25-(OH)D3水平， 3個(gè)炎性指標(biāo)和蕁麻疹嚴(yán)重程度UAS7評(píng)分之間相關(guān)分析 與健康對(duì)照組相比，血清25-(OH)D3水平測定結(jié)果顯示90例CSU患者(U=1189,P<0.0001)和21例CIndU患者(U=357.0,P<0.05)均呈明顯降低，但3個(gè)炎癥指標(biāo)(D-dimer、FDP、ESR)僅在CSU組中均增高明顯，見表1。在CSU患者中，25-(OH)D3嚴(yán)重缺乏者占 31%(28/90)，缺乏者56%(50/90)；在CIndU患者中，嚴(yán)重缺乏者占14%(3/21)，缺乏為57%(12/21)；55名健康對(duì)照中，嚴(yán)重缺乏者僅占4%(2/55)，缺乏為35%(19/55)。我們的數(shù)據(jù)還顯示3個(gè)炎癥指標(biāo)(D-dimer、FDP、ESR)與UAS7呈正相關(guān)，結(jié)果提示部分CSU患者可能存在VD3嚴(yán)重缺乏和全身性炎癥。

2.2 CSU患者與健康對(duì)照組IL-6 mRNA和VDR mRNA表達(dá)水平比較 15例CSU患者中，IL-6 mRNA表達(dá)水平有7例患者明顯高于健康自愿者，1例明顯低于健康志愿者，7例無明顯差異；VDR mRNA表達(dá)水平有13例患者較健康自愿者明顯增加，2例無明顯差異，見表2。體外培養(yǎng)PBMC試驗(yàn)顯示隨著VD3處理濃度增加，IL-6 mRNA表達(dá)水平減低，而VDR表達(dá)水平增加(圖1)。結(jié)果提示VD3能抑制淋巴細(xì)胞釋放促炎因子IL-6，增加VDR表達(dá)。

2.3 補(bǔ)充與未補(bǔ)充VD3的CSU患者蕁麻疹嚴(yán)重程度UAS7評(píng)分變化 14例VD3嚴(yán)重缺乏的CSU患者與未補(bǔ)充對(duì)照組比較，在治療后12周UAS7評(píng)分明顯下降(P<0.0001)(圖2)。而25例VD3缺乏的CSU患者與未補(bǔ)充對(duì)照組治療后6、12周UAS7評(píng)分均下降不明顯(P>0.05)。

表1 慢性自發(fā)性蕁麻疹、慢性可誘導(dǎo)性蕁麻疹及健康對(duì)照組25-(OH)D3、D-二聚體(D-dimer)、纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)、ESR的檢測結(jié)果[M(P25,P75)]

注：a：與健康對(duì)照組比較P<0.0001；b：與健康對(duì)照組比較P<0.01；c：與健康對(duì)照組比較P<0.05

圖1 不同濃度的1α,25-(OH)2D3處理后CSU患者PBMC IL-6(a)、VDR mRNA(b)表達(dá)(注：*：P<0.05，**：P<0.01)

圖2 VD3嚴(yán)重缺乏組治療效果的比較

表2 慢性自發(fā)性蕁麻疹及健康對(duì)照組IL-6 mRNA和VDR mRNA表達(dá)[M(P25，P75)]

3 討論

表皮基底層和棘層角質(zhì)形成細(xì)胞中的7-脫氫膽固醇經(jīng)UVB介導(dǎo)的光化學(xué)作用合成內(nèi)源性VD3是人體VD3來源的主要途徑[9]。然而，過度皮膚防曬、戶外運(yùn)動(dòng)減少、肥胖等可能是內(nèi)源性VD3合成不足的主要原因[10,11]。本研究結(jié)果顯示31% CSU，14% CIndU和4%正常人血清VD3水平呈嚴(yán)重缺乏，且蕁麻疹嚴(yán)重程度UAS7評(píng)分與3個(gè)炎癥指標(biāo)(D-dimer、FDP、ESR)呈正相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)CSU患者中65%為女性，女性患者VD3水平明顯低于男性。Woo等[12]報(bào)道UAS7評(píng)分與血清VD3水平呈負(fù)相關(guān)，他們還觀察到10例VD嚴(yán)重缺乏的急性蕁麻疹患者有5例最后發(fā)展成為CSU。以上高度提示VD3嚴(yán)重缺乏可能是CSU疾病發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。

有研究顯示CSU患者可能存在一種低水平或亞臨床的全身性炎癥反應(yīng)[13]。VD3通過上調(diào)MKP-1途徑來抑制單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞中p38的活化以及IL-6和TNF-α的表達(dá)，發(fā)揮一定的抗炎作用[14]。我們用qPCR技術(shù)測定15例CSU外周血分離PBMC的IL-6和VDR mRNA表達(dá)水平，與正常人PBMC進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CSU患者的IL-6和VDR mRNA均高于健康對(duì)照組，體外PBMC的1α,25-(OH)2D3處理組與未處理組比較，IL-6 mRNA表達(dá)減低而VDR mRNA增加。這一結(jié)果也支持了我們的假設(shè)，VD3在CSU治療中可能存在一定的抗炎作用。越來越多的研究證實(shí)經(jīng)VD與細(xì)胞核內(nèi)VDR結(jié)合后可能通過以下機(jī)制發(fā)揮抗炎、抗過敏作用：①VD可以刺激肥大細(xì)胞VDR表達(dá)，阻止了Lyn與FcεRI的β鏈以及MyD88的結(jié)合，抑制IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化，維持肥大細(xì)胞膜的穩(wěn)定[15]；②VDR與MKP-1基因上游的VDRE結(jié)合，可能影響MKP-1轉(zhuǎn)錄，上調(diào)MKP-1的表達(dá)[14]；③除1,25-(OH)2D3外，體內(nèi)可能還存在有與VDR結(jié)合尚未識(shí)別的分子，發(fā)揮抗炎活性[16]。

通過對(duì)CSU患者進(jìn)行蕁麻疹嚴(yán)重程度UAS7評(píng)分發(fā)現(xiàn)，VD3缺乏組與嚴(yán)重缺乏組的患者分別補(bǔ)充小劑量和大劑量的VD3，并與單用抗組胺藥組比較，在補(bǔ)充治療后第12周，VD3嚴(yán)重缺乏組UAS7評(píng)分較對(duì)照組顯著下降，同時(shí)測定血清VD3水平均較補(bǔ)充前明顯增加。VD3缺乏組UAS7評(píng)分與對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示這組患者可能還存在有其他致病因素如亞臨床炎癥和凝血功能紊亂等[13]。

綜上，血清VD3水平缺乏甚至嚴(yán)重缺乏是CSU病情發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。VD3通過與核內(nèi)VDR結(jié)合，抑制促炎因子如IL-6的釋放。補(bǔ)充VD3有助于控制CSU，尤其是VD3嚴(yán)重缺乏患者的臨床癥狀。我們還發(fā)現(xiàn)CSU患者PBMC的VDR表達(dá)水平較正常人明顯增高，推測可能是一種VD3配體不足所致的代償性增加，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步檢查。