人面果葉總黃酮的提取工藝研究

楊光忠，符元澤，劉慧，徐曉詩，陳玉

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074；2 中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，武漢 430074)

人面果(Garciniaxanthochymus)，也稱大葉藤黃、嶺南倒捻子、歪脖子果等，為藤黃科藤黃屬植物，主要分布于我國云南和廣西，長在溝谷和丘陵地潮濕的密林之中[1].作為一種傳統(tǒng)傣藥，人面果的莖、葉和種子具備清火退熱、驅(qū)蟲、解食物中毒的功效[2]，具有抗菌、抗HIV病毒、抗糖尿病和抗細胞毒素等廣泛的生物活性，多用于治療腹瀉、痢疾及肝膽疾病[3,4].近期研究發(fā)現(xiàn)，人面果葉的乙酸乙酯提取物顯示出良好的抗糖尿病和抗氧化活性[5,6].植物化學(xué)研究表明，其主要化學(xué)成分為黃酮類化合物，以雙黃酮類化合物含量最大，具有明顯的α-淀粉酶抑制活性[7]和糖原合成酶GSK-3抑制活性[8]，有降低血糖的功效.本文以人面果葉為實驗材料，通過單因素和正交實驗法，考察乙醇濃度、料液比和提取溫度等因素對總黃酮提取的影響，以干膏得率和總黃酮得率為評價指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取工藝，以期為后續(xù)抗糖尿病有效部位的純化和富集奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

人面果葉采自云南勐養(yǎng)，經(jīng)云南西雙版納民族醫(yī)藥研究所趙應(yīng)紅主任藥師鑒定為藤黃科藤黃屬植物人面果(Garciniaxanthochymus)葉.藤黃雙黃酮(fukugetin)對照品自制(純度≥98%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)過1H、13C-NMR和ESIMS確定)，水為超純水，其他試劑均為分析純(國藥集團化學(xué)試劑).

電熱恒溫水浴鍋(DK-98-II，天津市泰斯特儀器)；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-I A，上海衛(wèi)凱儀器設(shè)備)；萬分之一電子天平(CP224C，上海奧豪斯儀器).

1.2 人面果葉總黃酮的提取

精密稱取2 g人面果葉干燥粉末(過二號篩)置于圓底燒瓶中，采用不同濃度的乙醇，在預(yù)先設(shè)定的提取次數(shù)、提取溫度、料液比及提取時間下，加熱回流提取，趁熱過濾，減壓濃縮，回收溶劑后，定容至50 mL，得到人面果葉提取液.

1.3 提取工藝考察指標(biāo)的測定

1.3.1 對照品溶液的制備

取藤黃雙黃酮對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，配制成0.1 mg/mL的對照品溶液.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取對照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL置于10 mL容量瓶中，依次加入0.1 mol/L AlCl3乙醇溶液2 mL、pH 5.2的CH3COONa/CH3COOH緩沖液3 mL，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，室溫下放置15 min，以相應(yīng)試劑為空白，在波長415 nm處測定吸光度.以對照品質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)、吸光度(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.3 總黃酮得率的測定

精密量取1 mL供試品溶液置于10 mL容量瓶中，加入2 mL的0.1 mol/mL AlCl3乙醇溶液、3 mL的1 mol/mL pH為5.2的CH3COONa/CH3COOH緩沖溶液，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，室溫下放置15 min. 以相應(yīng)試劑為空白，在415 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮質(zhì)量.人面果葉總黃酮得率(%)=總黃酮質(zhì)量/人面果葉質(zhì)量×100%.

1.3.4 干膏得率的測定

精密量取25 mL人面果葉提取液，置恒重的蒸發(fā)皿中，水浴上蒸干，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，恒重，稱定質(zhì)量，計算總固形物質(zhì)量，即為干膏質(zhì)量，干膏質(zhì)量比總藥材質(zhì)量即為干膏得率.

1.4 單因素實驗

1.4.1 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

精密稱取2 g人面果葉粉末，共5份，置于100 mL圓底燒瓶，按料液比1∶20分別加入不同濃度的乙醇溶液(60%，70%，80%，90%，100%)，于80 ℃水浴中加熱回流提取1次，提取1 h，趁熱過濾，減壓濃縮，定容至50 mL量瓶中，取25 mL干燥恒重，稱重，計算干膏得率，同時取1 mL用甲醇稀釋至10 mL，測定吸光度，計算總黃酮得率.

1.4.2 料液比對總黃酮得率的影響

精密稱取2 g人面果葉粉末，共5份，置于100 mL圓底燒瓶，更改料液比(1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25)，加入70%的乙醇溶液，于80 ℃水浴中加熱回流提取1次，提取1 h，趁熱過濾，減壓濃縮，定容至50 mL量瓶中，取25 mL干燥恒重，稱重，計算干膏得率，同時取1 mL用甲醇稀釋至10 mL，測定吸光度，計算總黃酮得率.

1.4.3 提取溫度對總黃酮得率的影響

精密稱取2 g人面果葉粉末，共7份，置于100 mL圓底燒瓶，按料液比1∶20加入70%的乙醇溶液，改變提取溫度，分別于常溫24，40，50，60，70，80，90 ℃水浴中加熱回流提取1次，提取1h，趁熱過濾，減壓濃縮，定容至50 mL量瓶中，取25 mL干燥恒重，稱重，計算浸膏得率，同時取1 mL用甲醇稀釋至10 mL，測定吸光度，計算總黃酮得率.

1.4.4 提取時間對總黃酮得率的影響

精密稱取2 g人面果葉粉末，共4份，置于100 mL圓底燒瓶，按料液比1∶20加入70%的乙醇溶液，于80 ℃水浴中加熱回流提取1次，分別提取0.5，1，2，3 h，趁熱過濾，減壓濃縮，定容至50 mL量瓶中，取25 mL干燥恒重，稱重，計算浸膏得率，同時取1 mL用甲醇稀釋至10 mL，測定吸光度，計算總黃酮得率.

1.5 正交實驗法優(yōu)選最佳提取工藝

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇對總黃酮得率影響顯著的因素和水平設(shè)計正交實驗，優(yōu)選人面果葉總黃酮的提取工藝.

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y=3.2436X-0.0024，r=0.9999，總黃酮含量測定的線性范圍為0.0461～0.2766 mg.

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度對提取效果的影響

乙醇濃度對提取效果的影響結(jié)果見圖1.由圖1可知：干膏得率隨著乙醇濃度的增加而明顯減小，總黃酮得率隨著乙醇濃度的增加變化不顯著.乙醇濃度為70%時干膏得率較多為35.76%，且總黃酮得率為4.84%.在乙醇濃度減小到60%時，人面果葉中的水溶性成分如鞣質(zhì)、多糖等被提取出來，使干膏質(zhì)量明顯增大；隨著乙醇濃度增加，一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強的成分溶出量也增加，導(dǎo)致總黃酮得率下降.因此，本實驗選取的乙醇濃度為60%，70%，80%.

圖1 乙醇濃度對提取效果的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency

2.2.2 料液比對提取效果的影響

料液比對提取效果的影響結(jié)果見圖2.由圖2可知：料液比對干膏得率和總黃酮得率的影響不明顯，但料液比過大，后期溶劑回收時耗時較長且造成較大的能源損耗.因此，料液比選擇盡量較低為好，本實驗選取的料液比為1∶6，1∶9，1∶12.

圖2 料液比對提取效果的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction efficiency

2.2.3 提取溫度對提取效果的影響

提取溫度對提取效果的影響結(jié)果見圖3.由圖3可知：隨著溫度逐漸增高，干膏得率和總黃酮得率均逐漸上升，干膏得率隨溫度的變化比總黃酮變化的幅度更大.由于溫度升高，分子運動速度加快，滲透、擴散、溶解速度也隨之加快.隨著提取溫度的升高，黃酮浸膏得率升高，總黃酮擴散達到一定程度時，變化本文選取的提取溫度為.考慮到溫度過高會使雜質(zhì)的溶出量增加，本文選取的提取溫度為60, 70, 80℃.

圖3 提取溫度對提取效果的影響 Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

2.2.4 提取時間對提取效果的影響

提取時間對提取效果的影響結(jié)果見圖4.由圖4可知：提取時間0.5～1 h，總黃酮得率和干膏得率變化不明顯：提取時間超過1 h后，隨著提取時間的增加，總黃酮得率和干膏得率均逐漸降低.為節(jié)約成本，縮短工時，選擇較短的回流時間0.5 h.

圖4 提取時間對提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.2.5 提取次數(shù)對提取效果的影響

提取次數(shù)對提取效果的影響結(jié)果見圖5.由圖5可知：隨著提取次數(shù)的增多，總黃酮得率先增加后降低，干膏得率先降低后增加，且升降幅度不顯著.考慮到大規(guī)模生產(chǎn)節(jié)約成本原則，本文選取的提取次數(shù)為1次.

圖5 提取次數(shù)對提取效果的影響Fig.5 Effect of extraction times on extraction efficiency

2.3 正交實驗法優(yōu)選最佳提取工藝

根據(jù)以上實驗結(jié)果，確定提取時間為0.5 h，提取次數(shù)為1次.在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)作為影響因素，以人面果葉總黃酮得率為考察指標(biāo)，設(shè)計L9(33)的正交實驗，確定人面果葉總黃酮最佳提取工藝[9,10].其因素水平見表1，正交實驗結(jié)果見表2. 根據(jù)表2正交實驗結(jié)果可知：影響人面果葉總黃酮得率的因素按影響程度由大到小排列為乙醇濃度(A)>料液比(B)>提取溫度(C).并得到最佳提取工藝為A2B3C3，即為提取溫度80 ℃，料液比1∶12，乙醇濃度70%.由方差分析可見，乙醇濃度(A)、料液比(B)、 提取溫度(C)對總黃酮提取率均無顯著性影響(P<0.05).

在綜合節(jié)能、省時、省力原則之后，最優(yōu)提取工藝為：提取時間為0.5 h，乙醇濃度為70%，提取溫度為80 ℃，料液比1∶6，提取1次.

表1 正交實驗因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal design

表2 正交試驗表L9(33)及結(jié)果Tab.2 Orthogonal testTable L9(33) and results

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Variance analysis results

F0.05(2, 2)=19

2.4 工藝驗證實驗

按照上述最優(yōu)提取工藝進行提取，平行3次，結(jié)果見表4. 由表4可知：人面果葉干膏得率平均為36.55%，總黃酮得率平均可達4.96%，重現(xiàn)性良好，表明該工藝穩(wěn)定可行.因此，確定人面果葉總黃酮最優(yōu)提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度為70%，提取溫度為80 ℃，料液比為1∶6，提取時間為0.5 h，提取次數(shù)為1次.

表4 驗證實驗結(jié)果Tab.4 Results of validation experiment

3 結(jié)語

人面果葉總黃酮得率的影響因素依次為:乙醇濃度>料液比>提取溫度。人面果葉總黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度為70%，提取溫度為80 ℃，料液比為1∶6，提取時間為0.5 h，提取次數(shù)為1次.該提取工藝重現(xiàn)性良好，穩(wěn)定可行，總黃酮得率可達到4.96%.