Tet蛋白在阿爾茨海默病疾病進(jìn)程中的作用研究進(jìn)展

張弘，劉昊晨，何華，柳曉泉

（中國(guó)藥科大學(xué)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究中心，江蘇 南京 210009）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種慢性神經(jīng)退行性疾病[1]。AD的疾病成因至今尚未被闡明[2]，但隨著神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物模型研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)某些早期環(huán)境改變誘導(dǎo)的DNA甲基化水平變化可導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白（amyloid-β peptide，Aβ）表達(dá)上調(diào)，從而將AD發(fā)病與DNA甲基化聯(lián)系起來[3]。此后，人們開始在全基因組水平和基因特異性水平上展開了對(duì)AD樣本DNA甲基化的研究[4]。同時(shí)，作為DNA甲基化的重要標(biāo)志物5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC），其含量在AD患者多個(gè)腦區(qū)的顯著變化引起了研究者的注意[5-6]，這表明DNA甲基化和去甲基化的動(dòng)態(tài)變化可能在AD疾病進(jìn)程中起重要作用。作為介導(dǎo)DNA去甲基化的重要催化酶，Tet蛋白家族（teneleven translocation proteins，Tets）的研究受到越來越多的關(guān)注，本文對(duì)Tet蛋白在AD疾病進(jìn)程中的作用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為尋找AD的早期診斷方法與新的治療策略提供參考。

1 Fe2+、α酮戊二酸依賴的Tet蛋白家族

過去普遍認(rèn)為，DNA甲基化是細(xì)胞為了自身發(fā)展而沉默一些基因組的不必要基因的過程。在去甲基酶發(fā)現(xiàn)之前，DNA甲基化被認(rèn)為是一種轉(zhuǎn)錄沉默中重要的不可逆機(jī)制，該觀點(diǎn)在發(fā)現(xiàn)Tets具有DNA去甲基化能力之后被推翻，這意味著在生物體的整個(gè)生命過程中DNA甲基化是一種高度動(dòng)態(tài)平衡過程[7]。Tet蛋白最初是在急性髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞白血病的罕見病例中被發(fā)現(xiàn)[8]。在哺乳動(dòng)物中Tet蛋白存在3個(gè)亞型即Tet1、Tet2和 Tet3。

所有Tet蛋白均含有一個(gè)C端催化域，由一個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域和一個(gè)雙鏈螺旋狀結(jié)構(gòu)組成（見圖 1）[9]，其是二價(jià)鐵離子（Fe2+）和α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，AKG）依賴的雙加氧酶超家族；Tets需要Fe2+作為輔因子，AKG作為輔底物來催化其反應(yīng)。鐵結(jié)合位點(diǎn)的基因突變可以消除Tets的活性。在氧化反應(yīng)中，一個(gè)Tet蛋白將一個(gè)氧原子從氧分子（O2）轉(zhuǎn)移至底物的羥基（羥基化），將另一個(gè)氧原子結(jié)合到AKG，從而導(dǎo)致AKG的脫羧作用，釋放CO2并產(chǎn)生琥珀酸鹽[10]。Tet蛋白可以反復(fù)氧化DNA的5mC生成 5hmC、5-甲酰胞嘧啶（5-formylcytosine，5fmC）和5-羧基胞嘧啶（5-carboxylcytosine，5caC）（見圖2）。一方面，5fC和5caC可由胸腺嘧啶DNA糖基酶（thymine DNA glycosylase，TDG）進(jìn)一步催化，進(jìn)行堿基基礎(chǔ)切除修復(fù)（base excision repair，BER），該過程被稱為DNA的主動(dòng)脫甲基化[11]；另一方面，在DNA復(fù)制過程中，5hmC不能被DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）識(shí)別，5mC到5hmC的轉(zhuǎn)換將停止，維持現(xiàn)有的DNA甲基化模式，并導(dǎo)致增殖細(xì)胞中的DNA被動(dòng)甲基化減少。因此，通過促進(jìn)主動(dòng)DNA脫甲基化和減少DNA被動(dòng)甲基化從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，可以動(dòng)態(tài)地調(diào)節(jié)全局或特定細(xì)胞的5mC和5hmC水平[12]。

圖1 Tet蛋白結(jié)構(gòu)和Tet1空間結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖Figure 1 Schematic diagrams of Tet proteins and schematic spatial structure of Tet1

圖2 DNA甲基化、去甲基化修飾示意圖Figure 2 Schematic diagram of DNA methylation and demethylation

在基因表達(dá)調(diào)控方面，Tet蛋白起著至關(guān)重要的作用。目前普遍認(rèn)為，Tet蛋白通過其甲基胞嘧啶雙加氧酶活性動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)DNA甲基化，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化水平與基因轉(zhuǎn)錄成反比。作為DNA去甲基酶，Tet蛋白可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)DNA甲基化水平：一方面，Tet蛋白通過結(jié)合到CpG富集區(qū)域來調(diào)節(jié)DNA甲基化，進(jìn)而抑制DNMT活性；另一方面，Tet蛋白通過其羥化酶活性將5mC轉(zhuǎn)換成5hmC以調(diào)控DNA甲基化[12]。

Tet蛋白可影響神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSC）和胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESC）的增殖分化（見圖3）[13]。多項(xiàng)研究表明Tet1影響成人神經(jīng)發(fā)育[14]，在Tet1敲除（Tet1 knockout，Tet1-KO）小鼠中，放射狀膠質(zhì)細(xì)胞（radial glia like cell，RGL）的增殖沒有變化，但中間神經(jīng)元祖細(xì)胞（neuronal intermediate progenitor cell，nIPC）的增殖減少，導(dǎo)致新生神經(jīng)元數(shù)量減少[15]。Tet2可與神經(jīng)轉(zhuǎn)錄激活因子Foxo3a（forkhead box O 3a）相互作用，參與成人神經(jīng)干細(xì)胞（adult neural stem cell，aNSC）關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄過程[16]。Moran-Crusio 等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，Tet2的耗竭刺激了aNSC的增殖，但減弱了aNSC 的分化。同時(shí)，過表達(dá)的Tet2和Tet3也推動(dòng)ESC的分化過程。在Sirt6敲除ESC中，抑制Oct4、Sox2和Nanog（Sirt6的下游基因）的表達(dá)，可上調(diào)Tet蛋白，導(dǎo)致ESC傾向于分化成神經(jīng)外胚層而非內(nèi)皮層或中胚層，這表明Sirt6調(diào)控的ESC分化是一種Tet蛋白依賴的調(diào)控方式[18]。

圖3 Tet蛋白影響神經(jīng)干細(xì)胞分裂分化過程示意圖Figure 3 Schematic diagram of the influence of Tet proteins on the division and differentiation of neural stem cells

此外，Tet蛋白表達(dá)還與認(rèn)知功能有關(guān)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，Tet1-KO動(dòng)物的海馬神經(jīng)元受損，學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能存在缺陷[15]。在與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的老年海馬體中，Tet2表達(dá)有所下降；在幼年小鼠海馬中模擬與年齡相關(guān)的Tet2損失，可以減少神經(jīng)元形成，損害認(rèn)知能力；在成熟的海馬體中恢復(fù)Tet2，可以恢復(fù)神經(jīng)元再生能力，增強(qiáng)認(rèn)知能力；這表明Tet2是認(rèn)知損傷恢復(fù)的關(guān)鍵分子介質(zhì)[20]。Tet2在整個(gè)大腦皮層處于高表達(dá)狀態(tài)，一項(xiàng)關(guān)于Tet2和大腦低灌注的研究表明：大腦皮層中Tet2的增加對(duì)于神經(jīng)元的存活至關(guān)重要。功能性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明：初生的皮質(zhì)神經(jīng)元Tet2耗竭容易導(dǎo)致細(xì)胞的死亡[21]。Tet3在原代皮層神經(jīng)元的表達(dá)具有活動(dòng)依賴性，在成人的前額皮質(zhì)中Tet3的表達(dá)是快速行為適應(yīng)的必要條件，并且在恐懼消退的記憶形成中起關(guān)鍵作用[22]。

2 Tet蛋白在AD疾病進(jìn)程中的作用

Tet蛋白在AD疾病進(jìn)程中主要具有三方面作用：1）Tet基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）可能與遲發(fā)型AD（late-onset AD，LOAD）具有一定聯(lián)系[23]；2）AD狀態(tài)下Tet活性改變可導(dǎo)致腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）表達(dá)調(diào)控異常從而損傷認(rèn)知功能[24]；3）AD疾病進(jìn)程中Tet蛋白活性改變可能導(dǎo)致海馬體區(qū)域DNA甲基化異常加重，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷[25]。

2.1 Tet基因SNP與遲發(fā)型AD的關(guān)聯(lián)

Morgan等[23]收集了1 160名LOAD患者和1 389名對(duì)照組患者的DNA樣本和臨床數(shù)據(jù)，分析其10號(hào)染色體上已知基因的SNP發(fā)現(xiàn)， LOAD患者Tet基因（rs5030882）的SNP相較對(duì)照組有所降低，這表明Tet基因的SNP可能參與LOAD的疾病進(jìn)程。此外，Tet蛋白表達(dá)的下調(diào)引起神經(jīng)元形成減少?gòu)亩鴮?dǎo)致學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能障礙，可能是AD疾病進(jìn)程中重要的一環(huán)。

2.2 Tet介導(dǎo)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)調(diào)控異常

Tet活性改變導(dǎo)致相關(guān)BDNF表達(dá)調(diào)控異常，這在AD疾病進(jìn)程中起重要作用。BDNF基因的表達(dá)受到嚴(yán)格控制，其異常調(diào)節(jié)與AD和一系列神經(jīng)發(fā)育障礙有關(guān)，而BDNF啟動(dòng)子的表觀遺傳調(diào)控是由Tet1完成的，Tet1可通過控制BDNF啟動(dòng)子的可訪問性來調(diào)控BDNF的表達(dá)[24]。對(duì)Tet1-KO小鼠的分析發(fā)現(xiàn)，多個(gè)神經(jīng)元活動(dòng)調(diào)節(jié)基因（包括Npas4、c-cfo和Arc）呈下行調(diào)節(jié)，此外Tet1-KO小鼠也出現(xiàn)海馬區(qū)異常和記憶力減退，最終導(dǎo)致突觸可塑性受損、記憶減退，這表明神經(jīng)元Tet1可調(diào)節(jié)正常神經(jīng)細(xì)胞的甲基化水平，從而調(diào)控基因的表達(dá)[26]。

2.3 Tet介導(dǎo)的海馬體DNA甲基化異常

與正常對(duì)照組相比，臨床前AD（preclinical AD，PCAD）和晚期AD（late-stage AD，LAD）受試者的海馬-海馬旁回（hippocampus/parahippocampal gyrus，HPG）中5hmC水平顯著升高，表明HPG在疾病進(jìn)展早期開始主動(dòng)去甲基化，PCAD組和LAD組的HPG中Tet1顯著升高，其表達(dá)增加可能是導(dǎo)致5mC氧化明顯增加的原因[25]。研究發(fā)現(xiàn)，Tet1蛋白水平變化與5hmC水平變化之間不匹配，提示核定位的Tet蛋白的活性可能受到損害[25]?？傊贏D的臨床癥狀出現(xiàn)之前，易受攻擊的大腦區(qū)域的去甲基化模式已經(jīng)發(fā)生了改變，這表明在AD的發(fā)病機(jī)制中，DNA去甲基化過程起到重要作用[25]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Tet1缺乏，可減少海馬齒狀回的aNSC增殖，同時(shí)導(dǎo)致成人亞粒區(qū)神經(jīng)祖細(xì)胞減少。有研究表明：Tet1-KO小鼠顯示出海馬神經(jīng)受損，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶的損傷[13]。另有研究表明：在AD患者海馬體內(nèi)Tet1蛋白表達(dá)減少[26]，這可能是導(dǎo)致AD患者學(xué)習(xí)障礙產(chǎn)生的原因之一。

3 Tet蛋白代謝產(chǎn)物在AD疾病進(jìn)程中的作用

5hmC是5mC經(jīng)Tet蛋白催化得到的脫甲基化產(chǎn)物，其在大腦中廣泛存在，在發(fā)育過程和神經(jīng)元活動(dòng)中受到動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)[27]，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，5hmC在轉(zhuǎn)錄表觀遺傳調(diào)節(jié)中起著重要作用，能夠調(diào)節(jié)大腦發(fā)育和維持成人大腦的功能。因此，5hmC的分布或功能異?？赡苁巧窠?jīng)退行疾病的重要因素[28]。通過對(duì)不同去甲基化區(qū)域的基因進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，AD患者海馬體內(nèi)5hmC的改變影響了包括能量代謝、細(xì)胞功能、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)降解、細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等重要信號(hào)通路[29]。同時(shí)，5hmC在額顳上回的富集與AD的病理特征（包括神經(jīng)系統(tǒng)纏結(jié)、Aβ沉積和泛素負(fù)荷）呈正相關(guān)，這表明5hmC可能是參與AD疾病進(jìn)程的主要分子成分[30]。

研究表明：AD晚期幾個(gè)腦區(qū)5hmC水平較低[4,31]，如新皮質(zhì)、海馬、鼻內(nèi)皮和小腦。但亦有研究表明：在AD患者內(nèi)皮、海馬和顳回神經(jīng)中存在5hmC水平升高[6,32]。這些差異可能是由于研究者研究的腦群（例如鼻內(nèi)皮質(zhì)、海馬和顳回）以及測(cè)定手段 （例如免疫組織化學(xué)、蛋白免疫印跡）不同而產(chǎn)生的。

全基因組的研究發(fā)現(xiàn)，一些基因與AD患者前額皮質(zhì)異常的神經(jīng)形態(tài)和突觸功能有關(guān)，對(duì)死后的AD患者前額皮質(zhì)的5hmC進(jìn)行全基因組測(cè)序及轉(zhuǎn)錄測(cè)序發(fā)現(xiàn)，325個(gè)含有不同去甲基化位點(diǎn)（differentially hydroxymethylated loci，DhML）的基因[33]。這些基因的表達(dá)與神經(jīng)元投射發(fā)育和神經(jīng)發(fā)生的通路有關(guān)，由這些基因編碼的蛋白質(zhì)與AD相關(guān)的基因形成直接的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，從而擴(kuò)大了與AD相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)[33]。同時(shí)，在DhML中發(fā)現(xiàn)了與AD相關(guān)的SNP，表明這些SNP可能識(shí)別在AD發(fā)病機(jī)制中起作用的表觀遺傳基因調(diào)控區(qū)域[33]。通過全基因組捕獲和高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，與老年斑顯著相關(guān)的517個(gè)不同去甲基化區(qū)域（differentially hydroxymethylated region，DhMR）和60個(gè)與神經(jīng)纖維纏結(jié)相關(guān)的DhMR。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，基因體的DNA去甲基化主要與順式排列基因表達(dá)呈正相關(guān)[34]。通過觀察APP-PSEN1雙轉(zhuǎn)基因（DTg）小鼠的大腦皮層、小腦和海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)，在海馬體中5hmC的含量顯著下降，但在大腦皮層和小腦中并未發(fā)現(xiàn)5hmC含量下降；通過全基因組分析確定了DTg小鼠的DhMR，發(fā)現(xiàn)其在內(nèi)含子、外顯子和基因間區(qū)域中高度富集，同時(shí)在與神經(jīng)元發(fā)育/分化和神經(jīng)元功能/生存相關(guān)的多個(gè)信號(hào)通路中，與DhMR關(guān)聯(lián)的基因高度富集[35]。

總之，5hmC水平的變化不僅與正常的大腦功能和衰老有關(guān)，也與AD有關(guān)。雖然目前仍缺乏在關(guān)鍵腦區(qū)特定神經(jīng)元群體中去甲基化特定模式的信息，但研究發(fā)現(xiàn)通過DNA去甲基化過程可以控制AD轉(zhuǎn)錄變化以引起分子級(jí)聯(lián)的改變，最終導(dǎo)致AD出現(xiàn)或加速AD的形成[36]。

4 Tet蛋白應(yīng)用于AD治療的前景

現(xiàn)階段雖然沒有以Tet蛋白為靶點(diǎn)的AD治療藥物，但通過調(diào)節(jié)Tet蛋白表達(dá)來改善學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能或可成為潛在的改善或治療AD的可行方案。如在與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的老年海馬體中，Tet2表達(dá)和5hmC水平有所下降。在幼年的小鼠海馬中模擬與年齡相關(guān)的Tet2損失，可以減少神經(jīng)元形成，損害認(rèn)知能力[20]。在成熟的海馬體中過表達(dá)Tet2可以恢復(fù)神經(jīng)元再生能力，增強(qiáng)認(rèn)知能力，這表明Tet2是神經(jīng)元恢復(fù)的關(guān)鍵分子介質(zhì)[20]。在對(duì)5xFAD小鼠（一種過表達(dá)2個(gè)與AD相關(guān)的人源化基因APP和PS1的轉(zhuǎn)基因小鼠）進(jìn)行環(huán)境強(qiáng)化訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn)，Tet2蛋白表達(dá)上調(diào)，小鼠記憶和認(rèn)知能力有所改善[37]，表明Tet2可能是AD治療或輔助治療的潛在靶點(diǎn)。此外，有研究表明Tet3是調(diào)節(jié)焦慮、空間學(xué)習(xí)和短期記憶的關(guān)鍵參與者，Tet3的缺乏會(huì)導(dǎo)致關(guān)鍵神經(jīng)元活動(dòng)調(diào)節(jié)基因中的DNA超甲基化[38]。Tet3可以精準(zhǔn)地定位于涉及溶酶體功能、mRNA出路和基本切除修復(fù)途徑的關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，同時(shí)Tet3可作為5caC的調(diào)節(jié)劑，通過基礎(chǔ)切除修復(fù)，從大腦有絲分裂的神經(jīng)元主動(dòng)清除5mC的蓄積，從而起到預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的作用[39]。

此外，由于Tet蛋白具有神經(jīng)元親和性，越來越多的研究者將其作為腦靶向藥物的靶頭應(yīng)用于AD藥物。納豆激酶具有抗Aβ、抗纖維蛋白溶解和抗血栓活性，是針對(duì)Aβ的潛在藥物，通過納米封裝可改善其不穩(wěn)定性，但納米材料的親水性限制其通過血腦屏障，借助Tet1蛋白的神經(jīng)元親和性，將聚乳酸-共聚乙醇酸（PLGA）-包裹納豆激酶與Tet1蛋白結(jié)合，能在不影響其藥效的同時(shí)增強(qiáng)血腦屏障對(duì)藥物的通過率，實(shí)現(xiàn)納豆激酶的腦靶向性從而作為抗AD的有效治療藥物[40]。Jia等[41]研制出的由轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）和Tet-1蛋白功能化的雙腦靶向聚合體（Tf/Tet-1-POs）能夠促進(jìn)姜黃素進(jìn)入大腦并提供神經(jīng)保護(hù)。小鼠大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與神經(jīng)元共培養(yǎng)模型的細(xì)胞攝取結(jié)果表明：Tf/Tet-1-POs具有明顯的轉(zhuǎn)運(yùn)特性，對(duì)神經(jīng)元具有親和性，由Tf/Tet-1-POs包裹的姜黃素血腦屏障通過率明顯升高。

5 Tet相關(guān)生物標(biāo)志物用于AD診斷面臨的挑戰(zhàn)

研究人員通過全基因組捕獲并進(jìn)行高通量測(cè)序，研究5hmC在AD大腦內(nèi)特定基因組位點(diǎn)的全基因組分布發(fā)現(xiàn)，DNA去甲基化在AD病理過程中發(fā)揮重要作用[33-34]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，BDNF的外周血異常甲基化與AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[42]，提示外周血特定基因去甲基化位點(diǎn)可能與AD疾病進(jìn)程具有一定關(guān)系，這為DNA甲基化/去甲基化相關(guān)生物標(biāo)志物作為AD早期診斷生物標(biāo)志物提供可能。

現(xiàn)有的大多數(shù)DNA甲基化相關(guān)生物標(biāo)志物的臨床研究是針對(duì)死后的AD患者樣本進(jìn)行基因組甲基化和去甲基化的研究，并沒有將基因組甲基化和去甲基化相關(guān)生物標(biāo)志物與早期AD患者的神經(jīng)心理測(cè)試以及影像學(xué)建立聯(lián)系，這是目前DNA甲基化作為AD生物標(biāo)志物相關(guān)研究的局限[43]。若能對(duì)早期AD患者進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間跟蹤隨訪，定期監(jiān)測(cè)其外周血中5mC和5hmC含量的變化，通過外周血高通量測(cè)序分析不同位點(diǎn)DNA甲基化和去甲基化，并建立其與AD患者的神經(jīng)心理學(xué)以及影像學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)的聯(lián)系，找出相關(guān)性較強(qiáng)的甲基化或去甲基化位點(diǎn)加以驗(yàn)證，最終找出與AD疾病相關(guān)的血液DNA甲基化相關(guān)生物標(biāo)志物，這有可能成為AD早期診斷研究的一大突破。

6 結(jié)語與展望

基因表觀遺傳調(diào)控的改變可能在AD的神經(jīng)退化及認(rèn)知功能障礙中起關(guān)鍵作用。Tet蛋白的相關(guān)表達(dá)調(diào)控影響了神經(jīng)細(xì)胞的分裂和分化，進(jìn)而影響了機(jī)體的認(rèn)知功能，成為影響AD疾病進(jìn)程的重要環(huán)節(jié)。以Tet蛋白作為潛在治療靶點(diǎn)可能成為下一階段AD治療的研究方向之一。Tet蛋白作用于5mC得到的脫甲基化產(chǎn)物5hmC可作為獨(dú)立的表觀遺傳生物標(biāo)志物，5hmC在不同腦區(qū)的分布異常影響了AD患者的認(rèn)知功能，同時(shí)對(duì)外周血中特定基因的5mC及5hmC的測(cè)序用作AD早期診斷的研究也已不斷深入，相關(guān)生物標(biāo)志物有望成為AD早期診斷研究的新方向。