水茄組織培養(yǎng)技術(shù)體系的建立

李棟，孫亮亮，羅曉梅，白麗麗，亢秀萍，徐進(jìn)

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2.青海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，青海 西寧 810008；3.普洱學(xué)院 農(nóng)林學(xué)院，云南 普洱 665000；4.中國(guó)科學(xué)院 西雙版納熱帶植物園， 云南 勐臘 666300)

水茄 (Solanumtorvum)也稱野茄子，是茄科、茄屬灌木，分布于中國(guó)云南、廣西、廣東、臺(tái)灣。喜生長(zhǎng)于熱帶地方的路旁，荒地，灌木叢中，溝谷及村莊附近等潮濕地方，果實(shí)可食，具明目、治瘡毒等功效[1]。水茄淡香微苦，略有回甘，風(fēng)味獨(dú)特，且生長(zhǎng)期較長(zhǎng)，全年均可采收，可增加蔬菜花色品種，豐富老百姓“菜籃子”。云南很多地區(qū)都有食用水茄幼果的習(xí)慣，還因其味苦稱之為小苦子[2]。

茄子是一種重要的蔬菜作物。在其農(nóng)業(yè)栽培中，人們以水茄作為茄子砧木，采用嫁接的方法，提高了茄子的抗蟲(chóng)、抗病性，因而極大提高了茄子產(chǎn)量?，F(xiàn)在水茄的繁殖多采用種子和扦插技術(shù)，但是由于水茄種子發(fā)芽慢，發(fā)芽率低，不整齊，初期生長(zhǎng)緩慢，苗齡長(zhǎng)[3]，這些因素限制了茄子嫁接技術(shù)的應(yīng)用推廣。為了解決這一問(wèn)題，一些學(xué)者就如何促進(jìn)水茄種子發(fā)芽，以及通過(guò)扦插進(jìn)行無(wú)性繁殖進(jìn)行了研究[4～6]，雖然取得了一定的成績(jī)，但并沒(méi)有從根本上解決問(wèn)題。對(duì)于一些難于繁殖的植物，通過(guò)組織培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖已成為現(xiàn)代生物技術(shù)的重要內(nèi)容[7]。 Takeda等研究發(fā)現(xiàn)，水茄還是一個(gè)典型的重金屬低累積植物。將普通茄子嫁接到茄子砧木水茄上，可以有效減少茄子果實(shí)中Cd的含量 (降低了75%)，提高了蔬菜和藥材的安全性[8]；Mori等的研究也證明，在水茄中根到芽的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)水平低于茄子[9]。因此，水茄在茄子栽培上具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

在植物基因工程技術(shù)中, 多數(shù)成功的轉(zhuǎn)化體系都是建立在良好的愈傷誘導(dǎo)組織培養(yǎng)系統(tǒng)基礎(chǔ)之上的。張紅以水茄帶芽莖段為外植體，對(duì)其組培快繁技術(shù)體系進(jìn)行了研究[10]，然而這一體系并不適合于農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化。因此建立水茄下胚軸或子葉外植體的愈傷誘導(dǎo)植株再生體系，是建立水茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)。方巖巖以水茄子葉為外植體進(jìn)行了水茄組培快繁再生體系的研究，其愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100%，不定芽誘導(dǎo)率為85%，平均芽數(shù)6個(gè)[11]，由于水茄發(fā)芽率低，生長(zhǎng)不整齊等因素，增加了取材難度。選擇合適的外植體既是水茄再生體系建立的關(guān)鍵，更是為后期農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化提供有利平臺(tái)。以水茄下胚軸段為外植體，與子葉外植體相比，增加了外植體取材的數(shù)量，優(yōu)化外植體分化強(qiáng)度，更適合遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。但水茄下胚軸再生體系的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究的目的旨在建立高效的水茄下胚軸組織培養(yǎng)愈傷誘導(dǎo)和再生植株體系，為進(jìn)一步建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以采集于西雙版納當(dāng)?shù)氐囊吧逊N子為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌種子苗的培養(yǎng)

采集當(dāng)年成熟飽滿的水茄果實(shí)，將種子取出，去除果肉等雜質(zhì)，曬干。種子先用75%酒精表面消毒50 s，無(wú)菌水沖洗2～3遍，置于0.1%HgCl2中浸泡8 min，再用無(wú)菌水沖洗5遍。將種子置于滅菌濾紙上吸干水分后，均勻播種在1/2MS培養(yǎng)基(蔗糖15 mg·L-1)上(圖1A)，4 ℃冰柜中春化3 d后，放入培養(yǎng)室中萌發(fā)。培養(yǎng)條件均為：光照強(qiáng)度3 000～5 000 lx，光照時(shí)間16/8 h，溫度25 ℃[12]。

圖1 水茄再生體系的建立Fig.1 Establishment regeneration system of Solanum torvum注：A: 播種； B:萌發(fā)7 d的水茄幼苗；C: 接種外植體； D: 愈傷組織和不定芽分化；E: 不定芽增殖培養(yǎng)； F: 繼代培養(yǎng)；G: 再生苗生根； H: 再生苗馴化移栽。[13]Note：A: Sowing;B: 7 d germination Solanum torvum seedlings;C: Inoculation explants;D: Callus and adventitious bud differentiation;E: Culture of adventitious bud proliferation;F: Subculture;G: Rooting of regeneration buds;H: Regenerative seedling domestication and transplantation.[13]

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生

取萌發(fā)7～15 d的水茄幼苗為材料(圖1B)，分別切取長(zhǎng)約5 mm下胚軸段做外植體 (不包括生長(zhǎng)點(diǎn)部位)(圖1C)，平鋪在25個(gè)不同濃度不同的激素配方的培養(yǎng)基上 (表1)進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化培養(yǎng)(圖1D)。經(jīng)過(guò)2周不定芽增殖培養(yǎng)(圖1E)，統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖數(shù)，計(jì)算增殖率及增殖系數(shù)；同時(shí)進(jìn)行繼代培養(yǎng)(圖1F)。培養(yǎng)條件同種子萌發(fā)。

表1 愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化培養(yǎng)基Table 1 Callus induction and shoot regeneration medium

1.2.3 潮霉素篩選壓的確定

選擇5個(gè)不同潮霉素濃度 (0,4,8,10,15 mg·L-1)，用無(wú)菌苗的莖段在篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，選擇能夠有效抑制外植體生長(zhǎng)的潮霉素濃度。

1.2.4 生根培養(yǎng)

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)2周后統(tǒng)計(jì)生根率。將試管生根苗(圖1G)揭蓋煉苗3 d，流水洗凈根表面附著的培養(yǎng)基，移栽至1/2營(yíng)養(yǎng)土+1/2蛭石。覆膜保持濕度，同時(shí)注意適當(dāng)通風(fēng)。移栽苗(圖1H)大約8 d后揭去覆膜。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基激素配比的增殖效應(yīng)

將外植體培養(yǎng)2周時(shí)，由表2和圖2可知：

B2培養(yǎng)基中外植體愈傷較少，呈淡黃色，出芽多且正常，長(zhǎng)勢(shì)較好；

B3 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體，形態(tài)學(xué)下端愈傷較多，呈淺黃色，最先出芽，但后期愈傷膨大，生長(zhǎng)遲緩，芽不能長(zhǎng)大；

B3N0.1培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體愈傷多，愈傷中間堅(jiān)實(shí)，綠色，周圍松軟，后期芽雖然能長(zhǎng)大，但是誘導(dǎo)出的芽很少；

B2I0.2培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體，形態(tài)學(xué)下端愈傷較多，呈白色，后期愈傷膨大，芽能夠長(zhǎng)大，但形態(tài)不正常，玻璃化較為嚴(yán)重；

B2I0.1培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體，形成的愈傷少，淡黃色，出芽多且形態(tài)正常，長(zhǎng)勢(shì)好；

B1K1.5I0.2培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體，分化出的芽少，愈傷較多且有褐化現(xiàn)象，后期長(zhǎng)勢(shì)慢且分化出根；

B1Z2I0.2培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體，下胚軸段兩端變白，變粗，分化出的愈傷少，也不能夠分化出芽；

BKN培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體，愈傷松軟且最多，呈白色至淺黃色團(tuán)狀，分化出大量根，無(wú)法分化出芽；

BT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體, 形態(tài)學(xué)下端愈傷較多，呈淡黃色，產(chǎn)生的芽形態(tài)不正常；

BKI培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體, 形成的愈傷較多，綠色堅(jiān)實(shí)塊狀，長(zhǎng)出的小芽生長(zhǎng)緩慢；

B1N0.2培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體, 形成大量的愈傷，呈灰白色，質(zhì)地松散，芽呈綠色小點(diǎn)，無(wú)法長(zhǎng)大，后期分化出少量根；

B2I0.3培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體，形成的愈傷部分松散呈白色，部分玻璃化，能夠分化出正常的芽，形成較多的根；

B4N0.1培養(yǎng)基中從外植體兩端形成綠色堅(jiān)實(shí)的愈傷，分化出少量的芽和根；

B3I0.1培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體愈傷多，愈傷中間緊密、淺綠色，周圍松軟，分化出少量的芽且生長(zhǎng)緩慢；

B4I0.1培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體一端形成的愈傷堅(jiān)實(shí)、淺綠色，一端玻璃化，芽呈綠色小點(diǎn)，生長(zhǎng)緩慢；

B3I0.05培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體形成的愈傷膨大，少量玻璃化，分化出畸形芽且發(fā)育緩慢；

B3N0.05培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體形成中間致密淺綠色愈傷，周圍松軟半透明愈傷，分化出少量畸形芽且不易長(zhǎng)大；

B2N0.1培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體形成致密白色至淺綠色愈傷，不能分化成芽，有少量根發(fā)生；

A0.05T0.005培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體一端形成少量淺黃色愈傷，一端分化出叢生芽且發(fā)育遲緩，有少量根發(fā)生；

T0.06培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體膨大形成愈傷，簇狀芽不易長(zhǎng)大；

N0.1Z3培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體變粗，幾乎不分化形成愈傷，也不能夠分化出芽；

I0.1Z1培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體一端膨大形成愈傷并伴有芽的發(fā)生，另一端的分化幾乎滯停；

B2N0.3G0.25培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體，愈傷松軟呈白色至淺黃綠色團(tuán)狀且膨大數(shù)倍，分化出大量根，無(wú)法分化出芽；

B2Z1I0.2培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體，形成少量的白色至淺黃色愈傷，下胚軸兩端都具有分化出芽的能力，形成的簇狀芽能夠正常長(zhǎng)大；

B1K0.5N1培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體，愈傷松軟呈白色至淺黃色團(tuán)狀且膨大數(shù)倍，分化出少量根，無(wú)法分化出芽。

表2中的數(shù)據(jù)表明，B2I0.1培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的外植體分化芽的增殖率和增殖系數(shù)均最高，分別為100%和6.62。綜合分化增殖系數(shù)和芽生長(zhǎng)狀態(tài)等情況，外植體在B2I0.1培養(yǎng)基中增殖系數(shù)最大，分化芽生長(zhǎng)健壯，葉片較綠。

2.2 潮霉素篩選壓的確定

為了摸索出合適的潮霉素篩選壓，為進(jìn)一步遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)，本研究還對(duì)外植體潮霉素篩選壓進(jìn)行了分析。培養(yǎng)15 d后，由表3可知，添加4 mg·L-1潮霉素仍可分化出少量芽并長(zhǎng)大。然而在含有8 mg·L-1潮霉素的培養(yǎng)基中，外植體早期能分化出少量芽，但很快就停止生長(zhǎng)并死亡 (圖2+hyg)。添加10、15 mg·L-1潮霉素后，外植體無(wú)法誘導(dǎo)愈傷并死亡。因此，8 mg·L-1是水茄較為合適的潮霉素篩選壓濃度。

表2不同培養(yǎng)基激素配比的增殖效應(yīng)

Table2 Proliferation effect of hormone ratio in different medium

編號(hào)No.增殖率/%Multiplication rate增殖系數(shù)Multiplication factorB21005.66B31004.85B3N0.11002.55B2I0.270.66.28B2I0.11006.62B1K1.5I0.21004.33B1Z2I0.200BKN00BT1003.83BKI1005.50B1N0.218.20.25B2I0.31005.92B4N0.127.30.45B3I0.177.83.44B4I0.192.34.35B3I0.0581.85.25B3N0.0588.93.1B2N0.100A0.05T0.005501.67T0.061004.5N0.1Z300I0.1Z185.75.13B2N0.3G0.2500B2Z1I0.21005.58B1K0.5N100

2.3 繼代與生根培養(yǎng)

經(jīng)過(guò)2周不定芽增殖培養(yǎng)后，將叢生芽切成一個(gè)一個(gè)獨(dú)立的芽，培養(yǎng)在MS+6-BA 2 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1新鮮培養(yǎng)基中，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。將生長(zhǎng)在B2I0.1培養(yǎng)基上的嫩芽從高度1.5 cm以上的部分切下，轉(zhuǎn)移至不添加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2周后，由表4可知，平均生根率可達(dá)90%以上。將生根苗從培養(yǎng)瓶取出，洗去根系表面的瓊脂，轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)土中，成活率基本達(dá)到100%。

表3不同濃度潮霉素篩選的不定芽分化數(shù)量

Table3 The number of adventitious buds differentiation on different congcentrations hygromycin

濃度 /mg·L-1Concentration接種苗數(shù)Inoculated shoots分化數(shù)量No. of differentiation0118411581231011015130

表4芽轉(zhuǎn)移至1/2 MS培養(yǎng)基中的生根率

Table4 The germination rate of shoots was transferred to 1/2MS medium

培養(yǎng)瓶編號(hào)No.接種苗數(shù)Inoculated shoots生根率/%Rootting rate15100251003580

3 討論與結(jié)論

水茄是優(yōu)良的茄子砧木，對(duì)病蟲(chóng)害抗性較高，也是一種典型的鎘低累積植物。水茄對(duì)鎘累積水平較低，但對(duì)于其它微量元素的累積并無(wú)明顯影響。因此在栽培重金屬低累積蔬菜中具有重要的應(yīng)用前景。隨著有關(guān)植物鎘累積現(xiàn)象數(shù)據(jù)的不斷積累，已有越來(lái)越多的研究者將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到植物低累積鎘所涉及的生物化學(xué)、分子生物學(xué)和植物生理學(xué)等研究領(lǐng)域。這些研究為栽培鎘低累積作物和蔬菜奠定了理論基礎(chǔ)，并提供了基因資源。擬南芥等是人們研究新基因功能的主要模式植物。然而，現(xiàn)有的模式植物不能滿足對(duì)重金屬累積和耐受這一特殊生理過(guò)程的研究需要。所以，運(yùn)用現(xiàn)代生物學(xué)研究技術(shù)，發(fā)展新的具有重金屬低累積的模式植物，并與低累積植物進(jìn)行比較研究，將使這一領(lǐng)域的研究規(guī)范化、深入化，達(dá)到事半功倍的效果。水茄蘊(yùn)藏著豐富的基因資源，利用基因工程技術(shù)挖掘和轉(zhuǎn)化其鎘低累積相關(guān)基因，通過(guò)生物技術(shù)手段培育出具有產(chǎn)業(yè)化潛力的低累積重金屬的植物品種，對(duì)于降低環(huán)境重金屬污染以及提高人類食品的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、增進(jìn)人類健康方面都具有重要應(yīng)用價(jià)值，并將產(chǎn)生積極的社會(huì)效益、生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)效益。水茄具備較低的鎘累積能力，并日益受到國(guó)內(nèi)外研究者的重視。目前，鮮見(jiàn)關(guān)于水茄高效的愈傷誘導(dǎo)及組織培養(yǎng)方法的報(bào)道。與茄子相比，我國(guó)在茄子砧木水茄基因工程的研究相對(duì)較少，尤其是轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，缺乏合適的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系。

組織培養(yǎng)誘導(dǎo)分化效果受各種因素影響，外植體的類型及植物生長(zhǎng)物質(zhì)對(duì)其的誘導(dǎo)效應(yīng)；激素的濃度、種類及其本身的雙重作用或者極性運(yùn)輸、向性反應(yīng)等特點(diǎn)；激素之間的促進(jìn)或抑制作用等，都是再生體系建立的關(guān)鍵。前人研究中以水茄帶芽莖段[10]、花藥[11]和子葉[12]為外植體，但綜合考慮其誘導(dǎo)效率及在遺傳轉(zhuǎn)化中的適用性和高效性，可以再作進(jìn)一步的優(yōu)化研究。本研究以水茄種子實(shí)生苗下胚軸作為外植體，分析了合適的激素配比對(duì)下胚軸外植體愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的影響，找到了最優(yōu)的愈傷誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，同時(shí)摸索了以潮霉素作為篩選壓的合適濃度。ZT和6-BA 是植物組織培養(yǎng)中，廣泛應(yīng)用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)[13]。不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)誘導(dǎo)的愈傷組織類型不一樣[14]，對(duì)芽分化的誘導(dǎo)效果也各不相同。本試驗(yàn)中，當(dāng)6-BA的濃度大于等于3 mg·L-1和NAA的濃度大于等于0.1 mg·L-1時(shí)，兩激素搭配的培養(yǎng)基上的外植體形成大量的愈傷，但是分化的芽很少；且NAA的濃度大于等于0.2 mg·L-1時(shí)形成的愈傷呈白色至淡黃色松軟團(tuán)狀，長(zhǎng)根早且根系較發(fā)達(dá)。6-BA的濃度大于等于3 mg·L-1時(shí)，抑制了IAA對(duì)芽的誘導(dǎo)分化。ZT的濃度大于等于2 mg·L-1，與其組合的激素配方抑制愈傷組織分化。TDZ誘導(dǎo)分化出叢生芽。B1K1.5I0.2、I0.1Z1等配方中的外植體其中一端分化幾乎滯停，可能是激素極性運(yùn)輸?shù)挠绊?。不同外植體再生能力的不同是組織培養(yǎng)中常見(jiàn)現(xiàn)象。理論上講，每一個(gè)植物細(xì)胞都有全能性，但并不是所有體細(xì)胞都能夠再生植株，不同分化程度體細(xì)胞脫分化能力相差很大[14]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)了這一點(diǎn)，在B1Z2I0.2、N0.1Z3、B2N0.3G0.25等配方中，下胚軸的分化能力很弱，甚至很難形成愈傷。

試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳的愈傷誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基為：MS+6-BA 2 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1，愈傷誘導(dǎo)率為100%，芽增殖率達(dá)100%，芽分化增殖系數(shù)為6.62；在繼代培養(yǎng)中，使用MS+6-BA 2 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1即可維持較高的增殖系數(shù) 6.62；最佳的生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，生根率可達(dá)90%以上，移栽成活率基本達(dá)到100%。這些研究，不但有利于今后利用生物技術(shù)培育水茄新品種，同時(shí)也為深入研究水茄重要功能基因，包括抗蟲(chóng)、抗病、重金屬低累積關(guān)鍵基因的功能研究提供了技術(shù)保障。