谷子種子愈傷組織的誘導(dǎo)與植株再生

王曉璐，尹藝臻，溫銀元，原向陽(yáng)，王育選，趙娟

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

谷子(Setaritalica(L.) Beauv) 別稱粟，為一年生禾本科狗尾草屬植物，起源于中國(guó)，是世界上最古老的栽培作物之一，也是我國(guó)北方干旱和半干旱地區(qū)重要的區(qū)域性糧食作物，具有基因組穩(wěn)定、適應(yīng)性廣、抗逆強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，在我國(guó)的糧食安全中起重要作用[1～7]。脫殼后的谷子稱為小米,含豐富的蛋白質(zhì)，維生素，脂肪，鈣鐵鋅硒等微量元素，同時(shí)，谷子營(yíng)養(yǎng)均衡，是較好的飼料作物[8～11]。作為“五谷”之一的谷子是山西省主要栽培農(nóng)作物之一，播種面積在全國(guó)位居第二，種植品種以晉谷21號(hào)為主[12,13]。晉谷21號(hào)原名晉汾7號(hào),是經(jīng)南繁北育、多代選擇而培育成的谷子品種,其米色金黃發(fā)亮，細(xì)柔光滑，品質(zhì)和產(chǎn)量高，同時(shí)晉谷21號(hào)也是我國(guó)推廣面積最大、品牌名稱最多、小米加工企業(yè)利用最廣的優(yōu)質(zhì)谷子品種[14～19]。

新世紀(jì)以來(lái)，隨著世界人口的不斷增長(zhǎng)，對(duì)糧食的需求量也在持續(xù)的增加，Borlaug[20]推測(cè)在2025年主要糧食作物產(chǎn)量要提高4.5 t·hm-2。常規(guī)的作物育種技術(shù)已經(jīng)不能滿足人口日益增長(zhǎng)的需求,需要通過(guò)基因工程技術(shù),來(lái)提高谷子的產(chǎn)量和品質(zhì)，而建立一套高效、優(yōu)良的谷子再生體系,是利用基因工程方法選育、改良谷子品種、提高產(chǎn)量的前提條件[1～3]。目前，較之小麥、玉米等大作物，關(guān)于谷子組織培養(yǎng)方面的報(bào)道相對(duì)較少，現(xiàn)有相關(guān)報(bào)道中多以谷子幼穗、花藥等為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生，而幼穗等部位的取材常常受到地理環(huán)境、季節(jié)和發(fā)育階段等條件的嚴(yán)格限制[3]，影響其在很多方面的應(yīng)用。相比之下，谷子種子可常年保存，取材方便，是一種較理想的遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。但谷子種子再生體系的建立對(duì)基因型的依賴非常大，影響條件也較多，尚未見(jiàn)到關(guān)于晉谷21號(hào)種子再生體系建立的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)以晉谷21號(hào)成熟谷子的種子為外植體，研究了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度配比對(duì)晉谷21號(hào)谷子種子愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的影響，以期建立穩(wěn)定高效的谷子種子再生體系，為基因工程技術(shù)在谷子上的進(jìn)一步應(yīng)用及開(kāi)展谷子的相關(guān)育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

谷子品種“晉谷21號(hào)”由山西省農(nóng)科院經(jīng)作所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的獲得

挑選干凈、飽滿的成熟谷子種子，流水沖洗10 min后轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)，無(wú)菌水沖洗1次，用75%乙醇滅菌20 s后用0.1% HgCl2浸泡10 min，期間不斷振蕩。表面消毒后的種子用無(wú)菌蒸餾水清洗5次，放到無(wú)菌的濾紙上，吸干表面水分，然后將種子接種在誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上，(25±1) ℃暗培養(yǎng)。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

將處理好的成熟種子接種于附加不同激素濃度和配比的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種7個(gè)種子，在(25±1) ℃暗培養(yǎng)3周，期間計(jì)算種子的萌發(fā)率并觀察愈傷組織的誘導(dǎo)情況，計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2,4-D處理：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的2,4-D(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1)。NAA處理：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg·L-1)。6-BA處理：以篩選出的MS+2.0 mg·L-12,4-D為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA(0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 mg·L-1)。上述各處理均在培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂5 g·L-1，pH5.6～5.8。

1.2.3 愈傷組織的分化

選取誘導(dǎo)獲得的優(yōu)質(zhì)愈傷組織接種到附加不同激素種類和濃度的分化培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接12瓶，每瓶接種5個(gè)愈傷組織，在(25±1) ℃光下培養(yǎng)4周，光照時(shí)間為15 h·d-1，期間不斷觀察愈傷組織的生長(zhǎng)和分化情況并記錄，計(jì)算愈傷組織分化率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

6-BA處理：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1)；ZT處理：以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的ZT(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg·L-1)，上述各處理均在培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g·L-1瓊脂5 g·L-1，pH為5.6～5.8。

1.2.4 分化苗的生根培養(yǎng)

選取長(zhǎng)勢(shì)良好的分化苗并將其轉(zhuǎn)接到MS基本培養(yǎng)基上，觀察分化苗的生根情況。

1.2.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

分析成熟種子接種到誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基4 d后，統(tǒng)計(jì)種子的萌發(fā)數(shù)量，計(jì)算種子的萌發(fā)率； 21 d 后，統(tǒng)計(jì)種子的出愈數(shù)量，計(jì)算愈傷組織誘導(dǎo)率；愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基30 d 后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化的數(shù)量，計(jì)算愈傷組織分化率。每次試驗(yàn)重復(fù) 3 次。

種子萌發(fā)率/%=種子的萌發(fā)數(shù)/接種的種子總數(shù)×100

愈傷組織誘導(dǎo)率/%=誘導(dǎo)的愈傷組織種子數(shù)/接種的種子總數(shù)×100

愈傷組織分化率/%=分化幼苗的愈傷組織數(shù)/誘導(dǎo)的總愈傷組織數(shù)×100

使用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類、濃度的生長(zhǎng)素對(duì)谷子愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)情況的影響

由表1可知，將谷子種子接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，2～3 d種子開(kāi)始萌發(fā)，之后種子胚芽基部開(kāi)始膨大，1周左右開(kāi)始形成愈傷組織。在附加不同種類生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出的愈傷組織差異較大。培養(yǎng)基中附加2,4-D時(shí)，1周后可以觀察到透明粘稠狀的愈傷組織，2周后愈傷組織開(kāi)始變?yōu)榈S色，并達(dá)到最大，3周后愈傷組織開(kāi)始褐化，變得更加粘稠，并且隨著2,4-D濃度的增大，褐化速度加快；而附加了NAA的培養(yǎng)基中，1周后可以觀察到透明沙狀的愈傷組織，2周后愈傷組織有透明變?yōu)闇\白色，3周后愈傷組織變?yōu)榈S色，并達(dá)到最大，部分濃度的愈傷組織出現(xiàn)褐化，且隨著NAA濃度的增大，其褐化速度加快(圖1)。

表1 不同種類、濃度的生長(zhǎng)素對(duì)谷子愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)情況的影響Table 1 Effects of different concentrations of auxin on callus induction and growth of Millet

圖1 不同種類生長(zhǎng)素對(duì)谷子愈傷組織誘導(dǎo)和生長(zhǎng)情況的影響Fig.1 The situation of millet callus induction at different hormone注：(a：MS+2.0 mg·L-12,4-D 1周后； b：MS+2.0 mg·L-12,4-D 2周后； c：MS+2.0 mg·L-1NAA 2周后)Note:(a: MS+2.0 mg·L-12,4-D 1 week later; b: MS+2.0 mg·L-12,4-D 2 weeks later; c: MS+2.0 mg·L-1NAA 3 weeks later)

2.2 不同種類、濃度的生長(zhǎng)素對(duì)谷子愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2可知，添加的不同種類、濃度的生長(zhǎng)素對(duì)種子的萌發(fā)影響不大(2,4-D 69.43%，NAA 70.47%)，而添加不同種類的生長(zhǎng)素對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)影響較為明顯(2,4-D 81.14%，NAA 76.67%)，愈傷組織的誘導(dǎo)率都隨著2種生長(zhǎng)素濃度的增加都呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，2,4-D 2.0 mg·L-1、NAA 5.0 mg·L-1時(shí)均表現(xiàn)出最高的愈傷誘導(dǎo)率(2,4-D 88.57%，NAA 84.29%)，2種激素相比較而言，2,4-D誘導(dǎo)愈傷的效果要優(yōu)于NAA。綜上可知2,4-D2.0 mg·L-1為最佳的誘導(dǎo)愈傷組織的激素和濃度。

2.3 不同激素配比對(duì)谷子愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表3可知，6-BA與2,4-D配比使用促進(jìn)種子的萌發(fā)，培養(yǎng)基中單獨(dú)附加2,4-D 2.0 mg·L-1時(shí)，種子萌發(fā)率為68.57%，而2.0 mg·L-12,4-D

表2 不同種類、濃度的生長(zhǎng)素對(duì)谷子愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2 Effects of different kinds and concentrations of auxin on callus induction of millet

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters show significant difference in the same column (P<0.05).The same below.

與不同濃度6-BA配比使用時(shí)，種子平均萌發(fā)率可達(dá)77.72%，其萌發(fā)率提高了9.15%；同時(shí)2,4-D與6-BA配比還可提高愈傷的質(zhì)量，且對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)產(chǎn)生影響，6-BA濃度過(guò)低或過(guò)高都會(huì)降低愈傷組織的誘導(dǎo)率，當(dāng)6-BA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)92.86%，隨著6-BA濃度的增加，愈傷組織的褐化速度越快。綜合考慮，0.2 mg·L-1的6-BA與2.0 mg·L-12,4-D配比有利于愈傷組織的誘導(dǎo)(圖2)。

表3 2,4-D與6-BA配比對(duì)谷子愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of 2,4-D and 6-BA on callus induction of millet

圖2 2,4-D與6-BA配比對(duì)谷子愈傷組織誘導(dǎo)影響Fig.2 Effects of 2.0 mg·L-1 2,4-D and 0.2 mg·L-1 6-BA on callus induction of milletMS+2.0 mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-16-BA

2.4 不同種類、濃度的細(xì)胞分裂素對(duì)谷子愈傷組織分化情況的影響

選取誘導(dǎo)獲得的優(yōu)質(zhì)愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織分化(表4)。3周左右愈傷組織分化產(chǎn)生綠芽，1個(gè)月左右分化產(chǎn)生不定芽，后期繼續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)各不同處理的培養(yǎng)基中都會(huì)出現(xiàn)愈傷組織生根的現(xiàn)象。當(dāng)6-BA濃度為0.5～1.5 mg·L-1和ZT濃度為0.5～1.0 mg·L-1時(shí)，愈傷組織都可以分化產(chǎn)生較多的綠芽，并且愈傷組織褐化速度也較慢。以6-BA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，愈傷組織產(chǎn)生的綠芽最多，且愈傷組織不易褐化，分化出的綠芽也可以正常的生長(zhǎng)，為誘導(dǎo)愈傷

組織分化的最適宜培養(yǎng)基(圖3)。ZT濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，愈傷組織產(chǎn)生的綠芽較同濃度6-BA少，但分化出的綠芽后期生長(zhǎng)更為健壯(圖4)。提高6-BA和ZT濃度則愈傷組織褐化加快，ZT濃度達(dá)到2.5 mg·L-1時(shí)，愈傷組織只分化根，且快速褐化(圖5)。

2.5 不同種類、濃度的細(xì)胞分裂素對(duì)谷子愈傷組織分化的影響

由表5可知，不同種類的細(xì)胞分裂素對(duì)谷子愈傷組織分化的影響是有差異的(6-BA6.67%，ZT4.00%)，愈傷組織的分化率會(huì)隨著6-BA濃度的增加呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，而ZT則沒(méi)有，隨著ZT濃度的增加，愈傷組織的分化率呈現(xiàn)出高低起伏的趨勢(shì)。當(dāng)6-BA的濃度為1.0 mg·L-1、ZT濃度為0.5 mg·L-1時(shí)均達(dá)到最高的愈傷分化率(6-BA13.33%，ZT10.00%)。2種激素相比較而言，6-BA對(duì)愈傷組織的分化效果要優(yōu)于ZT。因此，綜合考慮，6-BA1.0 mg·L-1為最佳的誘導(dǎo)愈傷組織的激素和濃度。

表4 不同種類、濃度的細(xì)胞分裂素對(duì)谷子愈傷組織分化情況的影響Table 4 Effects of cytokinin on callus differentiation of Millet

圖3 6-BA對(duì)谷子愈傷組織分化的影響MS+1.0 mg·L-16-BAFig.3 Effects of 6-BA on callus differentiation of Millet MS+1.0 mg·L-16-BA

圖4 ZT對(duì)谷子愈傷組織分化的影響MS+1.0 mg·L-1ZTFig.4 Effects of ZT on callus differentiation of Millet MS+1.0 mg·L-1ZT

圖5 愈傷組織褐化生根Fig.5 Browning and rooting of callus

2.6 分化苗的生根情況

將長(zhǎng)勢(shì)良好的分化苗接種到不附加任何激素的MS基本培養(yǎng)基上后，培養(yǎng)3～4周后所有的分化苗均可生根，且根系健壯，可用于移栽(圖6)。

3 討論與結(jié)論

目前關(guān)于谷子組織培養(yǎng)的報(bào)道相對(duì)較少，現(xiàn)有研究中建立谷子再生體系時(shí)所用的外植體以幼穗最多，也有用花藥、莖尖和葉片等為外植體進(jìn)行培養(yǎng)的。日本學(xué)者研究通過(guò)培養(yǎng)處于四分體至單核小細(xì)胞子期的花藥成功誘導(dǎo)出愈傷組織，并獲得再生植株[22]；王寒玉等[23]研究用谷子的莖尖做外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并成功的獲得了再生植株；許智宏等[24]研究以谷子的幼穗為外植體進(jìn)行谷子愈傷組織的誘導(dǎo)和再生植株的獲得，并取得了成功；王節(jié)之等[25]利用谷子幼穗為外植體，篩選出了比較理想的適合愈傷組織誘導(dǎo)和分化的激素配比。上述研究表明幼穗、莖尖等部位都可以作為建立谷子再生體系的外植體，但幼穗、莖尖和花藥等部位的取材受到季節(jié)和發(fā)育階段等條件的限制，存在取材的局限性。相比較而言，谷子的成熟種子取材方便，不受季節(jié)和數(shù)量等的限制，摸索好建立再生體系的條件后可隨時(shí)取材隨時(shí)誘導(dǎo)，避免了再生植株長(zhǎng)期繼代后再生能力降低和發(fā)生變異的問(wèn)題。本試驗(yàn)以晉谷21的成熟種子為外植體，通過(guò)誘導(dǎo)篩選獲得了較高的愈傷組織誘導(dǎo)率，但愈傷組織的分化率相對(duì)偏低，仍需進(jìn)一步優(yōu)化提高愈傷組織的分化率。

表5 不同種類、濃度的細(xì)胞分裂素對(duì)谷子愈傷組織分化的影響Table 5 Effects of different types and concentrations of cytokinin on the differentiation of millet callus

圖6 生根培養(yǎng)Fig.6 Rooting culture

植物激素是影響谷子愈傷組織誘導(dǎo)和分化再生植株的重要因素，培養(yǎng)的外植體部位不同時(shí)，植物激素的種類和配比濃度也要隨之變化。王節(jié)之等[21]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同激素對(duì)谷子幼穗組培的作用不同，2,4-D可以促進(jìn)幼穗愈傷組織的誘導(dǎo)，KT可以促進(jìn)細(xì)胞的分裂，6-BA在幼穗愈傷組織分化成苗中起主導(dǎo)作用；王寒玉等[2]研究發(fā)現(xiàn)在含有2,4-D的培養(yǎng)基上加入細(xì)胞分裂素ZT和KT后在一定程度上提高了愈傷組織的誘導(dǎo)效率。尤其以種子為外植體時(shí)，不同基因型谷子種子誘導(dǎo)愈傷組織及再生植株時(shí)對(duì)激素種類和濃度的需求差異很大，李惠等[1]研究發(fā)現(xiàn)在谷子種子愈傷組織誘導(dǎo)的過(guò)程中，附加NAA的效果優(yōu)于2,4-D，且在培養(yǎng)基中添加低濃度的CTK，可以改善愈傷組織的質(zhì)量；袁進(jìn)成等[3]研究發(fā)現(xiàn)谷子在合適的2，4-D(2.0 mg·L-1)濃度的培養(yǎng)基中，4 種不同基因型的種子愈傷誘導(dǎo)率差異較大，從60.75%到12.75%，而且誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷狀態(tài)差異也較大，谷子誘導(dǎo)愈傷較好的激素配比是2，4-D+ZT，愈傷分化較優(yōu)的激素配比為NAA 和6-BA 的組合。本試驗(yàn)結(jié)果表明在愈傷組織的誘導(dǎo)過(guò)程中，MS培養(yǎng)基中加入不同濃度的2,4-D和NAA都可以促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)，但加入2,4-D的效果更佳，加入適合濃度的6-BA可以改善愈傷組織的質(zhì)量，誘導(dǎo)愈傷組織分化則以6-BA為好，這與上述報(bào)道結(jié)果有明顯差別。說(shuō)明谷子基因型是影響谷子種子再生體系建立的關(guān)鍵因素之一，尤其以成熟種子作為外植體時(shí)，不同品種間的差異較大，篩選適宜培養(yǎng)的基因型并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化才能建立穩(wěn)定高效的再生體系。