響應(yīng)法優(yōu)化提取酸漿籽中蛋白質(zhì)的研究

于開源，鞠曉峰，鄭麗娜

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

酸漿Physalis alkekengil，茄科植物，又名錦燈籠、掛金燈、紅菇。我國(guó)主要產(chǎn)地為內(nèi)蒙古呼倫貝爾盟和黑龍江大興安嶺地區(qū)[1-2]。果實(shí)不僅有很好的藥用價(jià)值，而且還有很高的食用價(jià)值，酸漿味酸、苦，性寒。具有清熱解毒、利咽化痰、利尿等作用[3]。酸漿籽中的蛋白質(zhì)含有多種氨基酸，人體必需的氨基酸俱全，它不僅擁有許多藥用價(jià)值，而且還是一種很好的保健品，酸漿籽中的蛋白質(zhì)是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，具有很大的發(fā)展前景，有待于進(jìn)一步開發(fā)和利用。酸漿蛋白的研究很少，漿果含酸漿醇A、B；種子中含禾本甾醇、鈍葉醇、環(huán)木菠蘿烷醇、環(huán)木菠蘿烯等[4-5]。目前對(duì)于植物種籽中蛋白質(zhì)的提取方法很多，有熱水提取法、超聲提取法、酶法等[6-9]。但這些工藝都不是很成熟，最成熟的方法是采用堿提酸沉法。加酸至等電沉淀蛋白法是從提取液中分離蛋白的最簡(jiǎn)單的方法，它能確保提取液中的蛋白最大程度的沉淀，采用此方法可以將材料中含量很少的蛋白提出來，酸漿中的蛋白質(zhì)的含量極少，對(duì)于其它的提取方法均不能有效的將其提取并測(cè)試出來，故在論文中選擇了堿提酸沉法作為酸漿籽蛋白的提取工藝[10]。論文主要是研究經(jīng)過超臨界萃取后的酸漿籽粕為原料，通過響應(yīng)面優(yōu)化確定提取蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)，由于響應(yīng)法優(yōu)化準(zhǔn)確率很高，誤差小，現(xiàn)被廣泛采用[11-12]，因此在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上主要采用響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以為酸漿籽中蛋白質(zhì)的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)和幫助，為進(jìn)一步開發(fā)其相關(guān)產(chǎn)品奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

酸漿果實(shí)，購(gòu)于黑龍江省建三江農(nóng)管局（七星農(nóng)場(chǎng)）；超臨界CO2萃取后的脫脂酸漿籽粕（黑龍江八一農(nóng)大學(xué)食品學(xué)院自制）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 堿提酸沉法籽粕工藝流程

酸漿脫脂籽粕——堿液浸提——離心（4 000 r·min-1、20 min）——過濾——清液——加HCL 調(diào)pH 至等電點(diǎn)——離心分離——沉淀——冷凍干燥——酸漿籽蛋白質(zhì)

1.2.2 pH 對(duì)酸漿籽粕蛋白提取的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 g 粉碎后酸漿籽粕5 份，用NaOH 調(diào)整磷酸二氫鉀—磷酸氫二鈉浸提液的pH分別至7、8、9、10、11，然后按料液比1∶25，分別加入pH 為7、8、9、10、11 的磷酸二氫鉀—磷酸氫二鈉浸提液，在40 ℃下攪拌浸提1 h，將上清倒入離心管中離心20 min（4 000 r·min-1），用凱氏定氮法測(cè)定其中的蛋白質(zhì)提取率及確定最佳pH。

1.2.3 溫度對(duì)酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 g 粉碎后酸漿籽粕，按1∶25 的料液比加入前述試驗(yàn)中確定的最佳pH 值浸提液，至于30，35，40，45，50 ℃下攪拌浸提1 h，同上，測(cè)定蛋白質(zhì)的提取率及確定最佳溫度。

1.2.4 料液比對(duì)酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 g 粉碎后酸漿籽粕，按1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 的料液比，加入最佳pH 的浸提液，在最佳溫度條件下攪拌浸提1 h，同上，測(cè)定蛋白質(zhì)的提取率及確定最佳料液比。

1.2.5 提取時(shí)間對(duì)酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取2.000 g 粉碎后酸漿籽粕，選取最佳料液比及最佳pH 浸提液，在最佳溫度下分別浸提20、30、40、50、60 min，同上測(cè)定蛋白質(zhì)的提取率及確定最佳提取時(shí)間。

1.2.6 酸沉等電點(diǎn)的確定

酸沉等電點(diǎn)的確定取50 mL 蛋白質(zhì)提取上清液7 份，分別用1 mol·L-1HCl 調(diào)節(jié)pH 值至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，靜置2～3 h，離心分離后，將上清液稀釋40 倍后進(jìn)行比色測(cè)定。

1.3 分析方法

蛋白質(zhì)的測(cè)定：采用凱氏定氮法（氮對(duì)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換系數(shù)取5.95）。按下式計(jì)算蛋白質(zhì)提取率和制品的純度。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定：采用比色法測(cè)定。

蛋白質(zhì)的提取率=提取液中蛋白質(zhì)含量/ 酸漿籽粕中蛋白質(zhì)含量×100%

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 不同單因素對(duì)酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響

2.1.1 浸提液pH 對(duì)酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響

不同pH 溶液處理對(duì)酸漿籽中蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 浸提液pH 對(duì)酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.1 Effect of extract pH of Physalis alkekengi seed meal protein extraction rate

在pH7～9 的范圍內(nèi)，隨著pH 的升高，蛋白質(zhì)的提取率升高，當(dāng)pH 為9 時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最大；隨后隨著pH 的升高，提取率反而下降，且樣品液體中有異味。當(dāng)pH 較高時(shí)，蛋白質(zhì)過度水解，提取率降低，同時(shí)氨基酸之間有可能發(fā)生縮合反應(yīng)，生成了異味物質(zhì)。有研究表明，堿性太強(qiáng)可引起脫氨、脫羧、肽鍵斷裂，引起胱賴反應(yīng)，將氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛卸净衔?。因此，提取酸漿籽粕蛋白質(zhì)的適宜pH 為9。

2.1.2 溫度對(duì)酸漿蛋白質(zhì)提取率的影響

以pH=9 和固液比1∶25 測(cè)定不同溫度對(duì)蛋白質(zhì)的提取率的影響，結(jié)果見圖2。

從圖2 知，在溫度50 ℃時(shí)酸漿籽粕中蛋白的提取率最大；30～50 ℃時(shí)，提取率隨溫度的升高而增加；這是由于隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象會(huì)發(fā)生微變，有利于蛋白質(zhì)分子和水分子的運(yùn)動(dòng)及其相互作用，溫度的升高對(duì)蛋白質(zhì)溶解起到了增溶作用，當(dāng)溫度由此點(diǎn)升高時(shí)，蛋白質(zhì)隨溫度的升高而降低，這是由于溫度過高可造成部分蛋白質(zhì)變性。因此，提取酸漿籽粕蛋白質(zhì)的適宜溫度為50 ℃。

圖2 溫度對(duì)酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of the temperature on protein extraction rate of Physalis alkekengi seed meal protein

2.1.3 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

不同料液比對(duì)酸漿蛋白質(zhì)提取率的影響，見如圖3。

圖3 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Material liquid ratio on protein extraction rate influence

從圖3 可知，蛋白質(zhì)的提取率隨料液比的增加而增大。當(dāng)料液比為1∶10 時(shí)，蛋白質(zhì)的提取率26.52%，遠(yuǎn)低于其它實(shí)驗(yàn)組，這是由于酸漿籽粕中含有一定量的膳食纖維，具有較強(qiáng)的吸水膨脹能力，使物料因流動(dòng)性差而難于攪拌，導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率低。當(dāng)料液比為1∶25 時(shí)，提取率為最大，隨著料液比的增大，提取率下降，由于料液比對(duì)其它影響考慮不是很明顯，故在響應(yīng)值設(shè)計(jì)時(shí)，不做考慮，提取酸漿籽粕蛋白質(zhì)的最佳料液比為1∶25。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

選取在溫度40 ℃，料液比1∶25，pH=9，提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)酸漿蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of Physalis alkekengi protein

從圖4 可知，在一定條件下，在提取時(shí)間為20～40 min 的范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，酸漿籽粕中蛋白質(zhì)的提取率升高，當(dāng)提取時(shí)間為40 min 時(shí)，蛋白質(zhì)的溶出率最高，蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最大；隨后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率反而下降。因此，提取酸漿籽粕蛋白質(zhì)的最佳提取時(shí)間為40 min。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取條件

根據(jù)Box-Behnken 的中心組合設(shè)計(jì)原理，以提取液pH、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)因素為自變量（分另為X1，X2，X3表示），以酸漿籽粕中蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素三水平共15 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，15 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為12 個(gè)析因點(diǎn)和3 個(gè)零點(diǎn)，每個(gè)試驗(yàn)因素水平選取如表1：

表1 酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取工藝三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Physalis seed meal protein extract process three factors and three levels of response surface analysis test design

實(shí)驗(yàn)以隨機(jī)次序進(jìn)行，將實(shí)驗(yàn)所得的多糖提取率用Minitab15.0 程序進(jìn)行分析，得出響應(yīng)面分析圖、回歸擬合方程以及方差分析表。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 堿溶酸提法提取條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Alkali and acid extraction condition optimizing the experimental design and results

表3 三因素三水平中心組合參數(shù)估計(jì)Table 3 Three factors and three levels center combination parameter estimation

利用Minitab 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由表3得出擬合二次多項(xiàng)式方程為：

Y=55.460 0-1.571 3 X1-0.362 5 X2-1.166 3 X3-16.000 0 X12-3.652 5 X22-3.145 0 X32+1.667 5 X1X2-2.970 0 X1X3+0.307 5 X2X3

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

由表3 知，對(duì)方程影響顯著程度由大到小依次為提取液pH、提取溫度、提取時(shí)間，其中提取液pH處理比提取溫度、提取時(shí)間對(duì)方程影響最為顯著，這說明提取液pH 對(duì)實(shí)驗(yàn)起關(guān)鍵作用，用堿液處理后，時(shí)間過長(zhǎng)物料可能變性，影響其提取率，并且得知方程一次項(xiàng)和二次項(xiàng)是極顯著的，所以各因素之間并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。由表4 知模型的回歸顯著，交互作用較好；失擬項(xiàng)F 值很小為0.32，表明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況好，實(shí)驗(yàn)誤差小。因此可以用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

同時(shí)做出中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)所得的三組響應(yīng)面曲面圖（圖5～圖7）。響應(yīng)面圖形是特定的響應(yīng)值Y（酸漿蛋白質(zhì)提取率）對(duì)應(yīng)的因素X1、X2、X3構(gòu)成的一個(gè)三維空間在二維平面上的等高圖，可以直觀地反映各因素的交互作用以及對(duì)響應(yīng)值的影響。圖中可看到擬合曲面有最大值，對(duì)擬合方程求偏導(dǎo)，可得出模型最大值，即為最優(yōu)的試驗(yàn)方案。

圖5 pH 值和溫度對(duì)酸漿籽粕蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of pH and temperature on Physalis alkekengi seed meal protein extraction rate

圖6 pH 值和提取時(shí)間對(duì)酸漿籽粕蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of pH and extract time on Physalis alkekengi seed meal protein extraction rate

圖7 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)酸漿籽粕蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.7 Effect of temperature and time on Physalis alkekengi seed meal protein extraction rate

為了進(jìn)一步確證最佳點(diǎn)的值，利用上述分析進(jìn)行最優(yōu)工藝的推導(dǎo)，對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)為零并整理得：

聯(lián)立上述（2）、（3）、（4）三個(gè)方程求解，得到X1=0.030 5，X2=0.033 5，X3=0.218 3。換算后得到最佳工藝條件是pH 為9.1、提取溫度為50.1 ℃、提取時(shí)間為42.2 min。由回歸方程預(yù)測(cè)酸漿蛋白質(zhì)提取的理論提取率為51.9%。

設(shè)計(jì)上為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果，采用上述優(yōu)化條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，將提取率工藝參數(shù)修正為：pH 為9.0，提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為42 min。在此條件下實(shí)際多糖提取率為49.1%，與理論預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)誤差約為0.41%，說明了回歸方程的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間具有較好的擬合度。

3 結(jié)論

3.1 對(duì)堿提工藝中影響蛋白質(zhì)提取率的提取液pH值、提取溫度、料液比、提取時(shí)間4 個(gè)單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：提取液pH 值、提取時(shí)間提取溫度對(duì)酸漿籽粕蛋白質(zhì)的提取率影響顯著，而料液比的影響不顯著。

3.2 采用響應(yīng)化優(yōu)化堿提工藝參數(shù)，以最終提取純蛋白質(zhì)為指標(biāo)，確定堿提最佳工藝參數(shù)為：提取液pH=9.0，提取溫度50 ℃，料液比1∶25，浸提42 min。按此工藝條件提取酸漿籽粕蛋白質(zhì)，提取率為49.1%。

3.3 通過驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)證明了響應(yīng)面優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件的可靠性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值具有較好的擬合，證明采用響應(yīng)法優(yōu)化對(duì)微波法輔助提取酸漿籽中蛋白質(zhì)的提取率實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠，具有可行性。

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