非對稱流場流分離-超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜用于過敏原蛋白表位篩選

李 陽, 楊 奕, 邵 兵, 鄒 悅, 宋 宇, 舒 琳, 梁啟慧, 韓南銀*

(1. 北京大學藥學院, 北京 100191; 2. 北京市疾病預防控制中心, 北京 100013)

場流分離(field flow fractionation, FFF)技術(shù)是近年來新興發(fā)展的一種分離分析方法,主要應用于大分子,因其具有溫和、廣譜的分離特性,同時分離過程不會改變被分析物的結(jié)構(gòu)形態(tài)和生物活性,尤其適合生物大分子的分析應用,從而引起越來越多的關(guān)注[1-4]。非對稱流場流分析(asymmetrical flow field flow fractionation, AF4)是場流技術(shù)中應用最廣泛的一個分支,也是目前可信賴的納米顆粒分離和表征的方法。AF4類似于液相色譜,區(qū)別在于其沒有固定相,僅由通道流(channel flow)和垂直于通道的交叉流(cross flow)組成。AF4的分離在如圖1所示的領(lǐng)帶形的可滲透超濾膜(截留相對分子質(zhì)量通常為10或30 kDa)通道中進行[5]。在分離的過程中,載液在通道中的層流作用下在通道的橫截剖面上形成拋物線形輪廓,向前移動。離上下壁越近的載液移動速度越慢,越靠近通道中心的載液移動速度越快。與此同時,被分析物在cross flow的帶動下,向著下方的積累壁移動。被分析物由于自身的擴散作用產(chǎn)生一個和cross flow方向相反的力,使顆粒偏向于拋物線的中心即流速最快的點。顆粒的大小及尺寸不同,所產(chǎn)生的擴散力不同。顆粒越小,擴散作用越明顯,越靠近拋物線中心。根據(jù)顆粒的流體動力學性質(zhì)在AF4通道中產(chǎn)生流速分級,小粒越靠近中心位置,相較于大顆粒更快地被洗脫[6,7]。

圖 1 AF4分離通道Fig. 1 Separate channel of the asymmetrical flow field flow fractionation (AF4)

食物過敏通常是由食物中的蛋白質(zhì)引起的,這種蛋白質(zhì)稱為過敏原蛋白。而過敏原蛋白參與過敏反應的往往只有氨基酸序列中的一小段抗原決定簇(數(shù)個至數(shù)十個氨基酸),又被稱為“表位”[8]。傳統(tǒng)的表位研究方法有酶解技術(shù)、肽掃描技術(shù)等,20世紀90年代發(fā)展起來的質(zhì)譜技術(shù)是目前表位定位應用較多的一種方法[9-11]。表位預測主要是采用生物信息學方法,不管是酶解法、構(gòu)建噬菌體展示文庫篩選法以及生物信息學預測方法等,這些方法大都需要預先設(shè)計肽段的氨基酸序列然后進行合成,之后再將這些合成的肽段與免疫球蛋白E(IgE)進行結(jié)合,測定活性以篩選表位,其針對性差,繁瑣,效率低下[11]。

蝦蟹等甲殼類動物是聯(lián)合國糧農(nóng)組織提出的八大類過敏食物中重要的一類。研究發(fā)現(xiàn),蝦的主要過敏原是一種相對分子質(zhì)量約為32 kDa的酸性糖蛋白----原肌球蛋白(TM), TM的等電點在4.5左右,其氨基酸組成中沒有色氨酸,酪氨酸和苯丙氨酸的含量也較少[12,13]。雖然蝦原肌球蛋白的結(jié)構(gòu)比較清楚,但是其引起食物過敏的表位研究還較少,1993年Shanti等[14]第一次利用過敏患者和對照者血清發(fā)現(xiàn)了兩個過敏原表位,分別為第50-66位和第153-161位的氨基酸殘基。為了進一步研究蝦過敏原蛋白的空間表位,Ayuso等[15,16]利用36段有重復序列的多肽,用18位蝦過敏患者血清進行檢測時,發(fā)現(xiàn)了5個肽段具有IgE結(jié)合活性。

非對稱流場流分離技術(shù)已經(jīng)成功應用于多種蛋白質(zhì)的分析,但對過敏原蛋白的分析研究較少[17-19]。受到Schachermeyer等[20,21]運用AF4對IgE和適配體等結(jié)合檢測的啟發(fā),擬引入AF4和UPLC-QTOF-MS聯(lián)用建立過敏原蛋白表位的快速篩選方法。本實驗使用非對稱流場流分離技術(shù)將選擇的過敏原蛋白蝦TM的酶解肽段與IgE孵育后的免疫復合物分離,收集AF4流出的組分,經(jīng)濃縮后進行UPLC-QTOF-MS檢測,匹配已經(jīng)建立的過敏原蛋白肽譜,尋找過敏原蛋白的抗原表位,實驗流程見圖2。此方法可以反映過敏原蛋白和IgE在體外的結(jié)合情況,為過敏原蛋白表位篩選提供了一種新方法策略,同時擴展了非對稱流場流技術(shù)的應用。

圖 2 實驗流程Fig. 2 Experimental processesIgE: immunoglobulin E.

1 實驗部分

1.1 儀器、材料與試劑

Eclipse AF4非對稱流場流分離儀購自美國懷亞特(Wyatt)公司;Agilent 1200系列四元泵、脫氣裝置、自動進樣器和UV/Vis檢測器(美國安捷倫公司);超高效液相色譜(ACQUITY UPLC)-離子淌度飛行時間質(zhì)譜儀(Vion IMS QTOF)、ACQUITY UPLC?BEH300 C4色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)均購自美國Waters公司。電子分析天平(BS 210S,德國Sartorius公司),空氣浴振蕩器(HZQ-C,常州朗越公司),微型冷凍離心機(5418R, Eppendorf公司),超濾離心管(Amicon Ultra-5, 10 kDa),再生纖維素膜(RC膜,截留相對分子質(zhì)量30 kDa)購自Wyatt公司;水系聚醚砜微孔濾膜(0.2 μm)購自津騰公司。

蝦TM標準溶液(1 mg/mL)購自美國Indoor公司,人IgE標準溶液(1 mg/mL)購自美國Abcam公司,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)、二硫蘇糖醇(DTT,純度99%)、乙酸鈉(3 mol/L)購自碧云天,RapiGest SF表面活性劑購自美國Waters公司,乙腈(含 0.1%(v/v)甲酸，LC-MS 級)、胰蛋白酶(蛋白組學級)、鹽酸(質(zhì)量分數(shù)36%～38%)、碘乙酰胺(IAA,純度98%)、甲酸(純度99%)、碳酸氫銨(純度99%)、三氟乙酸(純度99%)購自美國Fisher Scientific 公司,NaCl、MgCl2、KCl、K2HPO4、Na2HPO4512H2O、NaH2PO452H2O、NaOH、磷酸、NaN3均為分析純,購自美國Fisher Scientific公司。試驗用水由Milli-Q Plus水凈化系統(tǒng)制備(電阻率18.2 MΩ·cm)。

碳酸氫銨溶液(0.05 mol/L):準確稱取碳酸氫銨0.395 0 g,置于100 mL容量瓶中用超純水溶解并定容至100 mL。碳酸氫銨溶液(0.05 mol/L,含0.1% RapiGest SF):準確稱取1 mg RapiGest SF試劑加入到1 mL碳酸氫銨溶液(0.05 mol/L)中,充分溶解。碘乙酰胺溶液(1 mol/L):準確稱取碘乙酰胺1.85 g于10 mL棕色容量瓶中,用超純水溶解并定容至10 mL,于2～8 ℃避光保存。胰蛋白酶溶液(1 mg/mL): 將20 μg胰蛋白酶固體加入20 μL鹽酸(0.001 mol/L)中充分溶解,-80 ℃保存。DTT溶液(1 mol/L): 將3.09 g DTT加入20 mL 乙酸鈉溶液(0.01 mol/L)充分溶解，過濾除菌后于-20 ℃保存。

1.2 過敏原蛋白酶解

取50 μL TM標準溶液于1.5 mL離心管中,加入50 μL碳酸氫銨溶液(0.05 mol/L,含0.1% RapiGest SF),混勻后加入0.5 μL DTT (1 mol/L)溶液,在95 ℃下孵育10 min,冷卻至室溫后加入1.5 μL IAA(1 mol/L),室溫避光放置45 min后加入1 μL胰蛋白酶液(1 mg/mL), 37 ℃振搖酶解12 h。加入0.5 μL三氟乙酸,37 ℃下振搖30 min后以14 000 r/min離心10 min,取上清液待分析。

1.3 體外結(jié)合實驗

將TM標準溶液和IgE標準溶液等體積混合,孵育30 min進行體外結(jié)合實驗,孵育后的溶液進行AF4分析。將TM標準溶液按照1.2節(jié)的酶解條件進行酶解,進行TM水解肽段與IgE的體外結(jié)合實驗,用于研究TM的抗原表位。具體操作如下:將酶解肽段與IgE標準溶液等體積混合,孵育30 min。孵育后的溶液進樣AF4進行分析,在IgE的出峰時間收集流出的組分,并用10 kDa超濾管于4 ℃離心15 min,將收集到的流出組分進行濃縮,之后加入1 μL DTT(1 mol/L)用于UPLC-QTOF-MS分析。

1.4 分離條件

1.4.1AF4實驗條件

AF4通道的幾何參數(shù):長度153 mm,最大寬度22 mm;使用350 μm墊片作為通道厚度,以截留相對分子質(zhì)量30 kDa的再生纖維素膜作為積累壁膜,以PBS作為載液,使用前經(jīng)過0.2 μm水系聚醚砜微孔濾膜過濾,現(xiàn)用現(xiàn)配。在進樣前,載液先沖洗、平衡通道至少30 min,確保通道的潔凈和實驗的重復性。進樣量:10 μL;紫外檢測波長為215 nm。儀器操作和數(shù)據(jù)處理均使用安捷倫Open lab軟件。AF4洗脫參數(shù)檢測器流(detector flow)、聚焦流(focus flow)、進樣流(inject flow)和cross flow設(shè)置見表1。

表 1 AF4洗脫條件Table 1 Elution conditions of AF4

1.4.2UPLC-QTOF-MS條件

色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);色譜柱溫度為80 ℃;進樣體積為1 μL;流速為0.3 mL/min;流動相A: 0.1%(v/v)甲酸-水,流動相B: 0.1%(v/v)甲酸-乙腈,梯度洗脫條件:0～1 min, 98%A; 1～5 min, 98%A～50%A; 5～10 min, 50%A～5%A; 10～16.5 min, 5%A; 16.5～17 min, 5%A～98%A; 17～20 min 98%A.

電噴霧離子源(ESI+);離子源接口電壓為3 kV;霧化氣為氮氣,流速為2.0 L/min;加熱氣為空氣,流速為15 L/min;干燥氣為氮氣,流速為5 L/min;碰撞氣為氬氣;離子源接口溫度為100 ℃;脫溶劑管溫度為300 ℃;加熱模塊溫度為250 ℃;掃描模式為多反應監(jiān)測(MRM);延遲時間為3 ms。

2 結(jié)果與討論

2.1 AF4分析方法的建立

2.1.1紫外檢測波長的選擇

通常蛋白質(zhì)的紫外檢測波長設(shè)定為280 nm, 280 nm波長下的紫外吸收主要來自于蛋白質(zhì)樣品中的酪氨酸和色氨酸[22],然而TM的氨基酸組成中沒有色氨酸,酪氨酸的含量也較少[12],因此TM在280 nm下的紫外吸收較弱。215 nm是肽鍵的特征紫外吸收,更適合于小分子多肽和不含酪氨酸、色氨酸的相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)[23]。實驗中發(fā)現(xiàn)TM在215 nm下的吸收和峰形與280 nm相比均較優(yōu),因此最終設(shè)定紫外檢測波長為215 nm。

2.1.2分離參數(shù)的優(yōu)化

天然的過敏原蛋白粒徑偏小,通常在100 nm以下,AF4實驗洗脫參數(shù)中的cross flow值一般設(shè)定在3 mL/min才能保證過敏原蛋白緊貼積累壁,成功聚焦。cross flow和detector flow的比值會影響樣品的保留時間,通常情況下,cross flow/detector flow值設(shè)定為3。TM是一種十分易于聚集的蛋白質(zhì),其在分析過程中可能發(fā)生聚集,detector flow值設(shè)置得越小,縱向的流速則越慢,則將會增加樣品分子間的碰撞。focus flow值越高,聚焦的條帶越窄,也可能增加分子間的碰撞,因此應設(shè)定適宜的focus flow和detector flow以減少蛋白質(zhì)在分析過程中發(fā)生聚集。此外,載液條件如載液的種類、離子強度、pH等均會對過敏原蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)產(chǎn)生影響。同時,實驗中采用的再生纖維素膜的性質(zhì)也會因載液的不同而不同。課題組前期的工作中對載液條件進行了系統(tǒng)的研究,本實驗中載液條件的選擇參考梁啟慧等[24]的研究。綜上,最終確定TM的AF4分離條件(見表1)。

圖 3 TM標準溶液、IgE標準溶液及TM-IgE結(jié)合物的 AF4-UV流出圖Fig. 3 AF4-UV fractograms of TM reference, IgE reference and TM-IgE complex

2.2 TM與IgE體外結(jié)合的AF4分析

將TM標準溶液與IgE標準溶液等體積混合后孵育30 min,反應液經(jīng)AF4-UV分析檢測,考察是否形成TM-IgE復合體,從而研究TM與IgE是否可以在體外發(fā)生特異性結(jié)合。

圖3為蝦TM標準溶液、IgE標準溶液、TM標準溶液與IgE標準溶液孵育液的AF4-UV流出圖。TM的相對分子質(zhì)量約為32 kDa, IgE的相對分子質(zhì)量約為188 kDa,根據(jù)AF4的分離原理,相對分子質(zhì)量小的物質(zhì)會優(yōu)先出峰,由于TM和IgE相對分子質(zhì)量相差較大,理論上兩者在AF4中應具有良好的分離度。然而,由于TM自身的聚集效應很強,在溶液中主要以聚集體的形式存在,其在溶液中的分子尺寸較大,導致TM與IgE的出峰時間十分相近,難以達到很好的分離效果。盡管TM與IgE在AF4中不能完全分離,但由圖3可見保留時間約12 min的TM標準溶液和IgE標準溶液孵育液的出峰時間較TM標準溶液、IgE標準溶液略有延遲,表明孵育液的相對分子質(zhì)量較TM和IgE均有增加,說明TM標準溶液與IgE標準溶液可以在體外孵育形成TM-IgE復合物。

2.3 TM抗原表位的AF4-UPLC-QTOF-MS分析

2.3.1TM的肽譜分析

圖4為TM標準溶液的酶解指紋肽譜,肽譜分析采用UNIFI軟件結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫中TM的氨基酸序列數(shù)據(jù),自動檢索每一個酶解肽段的氨基酸序列。圖4肽譜分析中下劃線部分為本實驗中實際檢測到的肽段片段,計算得到TM標準溶液的水解肽段覆蓋率為95%,說明TM在實驗條件下基本水解完全,可以用于后續(xù)的酶解肽段與IgE的結(jié)合實驗。

圖 4 TM酶解指紋肽譜及肽譜分析(下劃線部分為 檢測到的片段)Fig. 4 Fingerprint peptide spectrum of TM and the analysis of peptide spectrum (The underscore parts are the detected fragments.)

2.3.2TM抗原表位分析

將TM酶解肽段與IgE標準溶液混合孵育30 min,孵育液濃縮后經(jīng)UPLC-QTOF-MS分析,結(jié)果見圖5。根據(jù)AF4的分離原理,只有相對分子質(zhì)量大于30 kDa的化合物才能保留在分離通道內(nèi),隨洗脫液一起流出到達檢測器。而相對分子質(zhì)量小于30 kDa的化合物則會在cross flow的作用下直接濾過再生纖維膜至廢液,不能被檢測器所檢測到。本實驗中,只有在孵育過程中與IgE標準溶液發(fā)生結(jié)合的肽段才能以肽段-IgE復合物的形式跟隨洗脫液一起流出,而那些沒有與IgE標準溶液結(jié)合的肽段在通過AF4時會直接流出到廢液。因此,我們認為只有具有抗原表位活性的酶解肽段才能與IgE標準溶液結(jié)合形成肽段-IgE復合物,并以復合物的形式經(jīng)AF4流出被收集。通常酶解肽段含5～20個氨基酸,其相對分子質(zhì)量通常在500～2 000 Da之間。而IgE的相對分子質(zhì)量約為188 kDa,因此酶解肽段與IgE標準溶液復合物的相對分子質(zhì)量與IgE的相對分子質(zhì)量相比相差不大,從而導致了肽段-IgE復合物在AF4中的保留行為與IgE標準溶液基本一致。

圖 5 孵育后結(jié)合的TM肽段的UPLC-QTOF-MS色譜圖Fig. 5 UPLC-QTOF-MS chromatogram of the binding TM peptides after incubation

實驗發(fā)現(xiàn),與TM標準溶液的酶解肽譜相比,TM酶解肽段與IgE標準溶液結(jié)合后可以檢測到的肽段數(shù)量明顯減少。經(jīng)軟件分析,共檢測到12條肽段,這些肽段即是潛在的表位抗原,檢測到的肽段信息在表2中詳細列出。文獻[25]采用生物信息學方法預測TM的抗原表位,認為TM的12-25、47-60、87-105、112-128、131-147、155-167、187-203、221-239、243-259、263-280氨基酸殘基均是抗原表位。本研究共檢測到12條可能是抗原表位的氨基酸殘基,其中ADTLEQQNK(22-30)、IQLLEEDLER(92-101)、LAEASQAADESERMA(113-127)、EARFLAEEADR (150-160)、FLAEEADRK (153-161)、YDEVAR(162-167)、AETGESK(183-189)、IVELEEELR(190-198)、EQIK(223-226)、SVQKLQK(245-251)共計10條與文獻報道具有較高的一致性。

表 2 檢測到的與IgE結(jié)合的TM肽段Table 2 Peptide segments detected in combination with IgE

3 結(jié)論

本文采用非對稱流場流分離技術(shù)聯(lián)合超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜分析技術(shù)對過敏原表位的研究進行了初步的探索。通過AF4實驗證實了蝦TM標準溶液與IgE標準溶液可以在體外發(fā)生結(jié)合,通過將蝦TM標準溶液酶解成為肽段之后與IgE標準溶液進行結(jié)合,之后采用AF4-UPLC-QTOF-MS研究策略,分析了蝦TM的抗原表位。實驗共篩選得到12條可能含有抗原表位的肽段,其中10條肽段的氨基酸序列與文獻[25]所預測的蝦TM抗原表位基本一致。本實驗將AF4應用于過敏原蛋白表位的檢測,拓展了AF4技術(shù)的應用,同時為過敏原表位篩選提供了一種新的研究策略,通過進一步的研究有望建立起AF4-UPLC-QTOF-MS的過敏原蛋白表位篩選平臺。