犬惡絲蟲絲氨酸蛋白酶抑制劑特性分析與診斷價(jià)值的初步評(píng)價(jià)

李春燕，蘭景超，羅 娌，黃文俊，張浩杰，董曉薇，古小彬，謝 躍，楊光友*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/ 動(dòng)物寄生蟲病研究中心，四川成都611130；2.成都大熊貓繁育研究基地，四川成都610081)

犬惡絲蟲病(Dirofilariasis)是一種以犬惡絲蟲(Dirofilaria immitis)為病原，蚊為中間宿主的，主要危害犬科、貓科動(dòng)物的人畜共患寄生蟲病，在亞洲、非洲、大洋洲、歐洲南部和美洲等蚊蟲聚集地廣泛分布，引起一系列的公共安全問題[1]。蟲體主要寄生于動(dòng)物的右心室及肺動(dòng)脈，有時(shí)也可見于動(dòng)物的胸腔和支氣管。動(dòng)物患病早期可能不表現(xiàn)明顯的臨床反應(yīng)或僅表現(xiàn)皮膚瘙癢等皮炎癥狀，患病后期根據(jù)蟲體寄生部位和寄生數(shù)量的不同也可能表現(xiàn)出不同的臨床癥狀。犬惡絲蟲少量寄生時(shí)，動(dòng)物常呈隱性感染，癥狀不明顯；當(dāng)寄生于心臟和肺臟的蟲體數(shù)量較大時(shí)動(dòng)物可能表現(xiàn)出身體消瘦、皮膚黃染、少動(dòng)、咳嗽，劇烈運(yùn)動(dòng)中突然出現(xiàn)呼吸困難，猝死等癥狀。人也可以被含有感染期幼蟲(L3)的蚊叮咬感染該病，主要侵害人的肺臟，引起咳嗽、胸悶和胸疼等癥狀，有時(shí)也可寄生于人的皮下、眼部和陰囊[2]。

絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin)屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族，主要通過滅活或抑制同源的絲氨酸蛋白酶活性來調(diào)節(jié)蛋白酶介導(dǎo)的活動(dòng)，參與多種生理活動(dòng)，如血液凝固、補(bǔ)體激活和腫瘤抑制等。此外，Serpin 也是生物體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠介導(dǎo)宿主20 多種抗炎作用，起到增強(qiáng)或抑制免疫的作用[3]?，F(xiàn)已證實(shí)Serpin 蛋白在線蟲病和吸蟲病中具有一定的診斷價(jià)值[4]。

目前，犬惡絲蟲病的診斷主要包括常規(guī)診斷方法(直接血涂片檢查法、改良柯氏法等)、免疫學(xué)診斷方法(間接ELISA 檢測(cè)循環(huán)抗原、免疫層析等)和分子生物學(xué)診斷方法(PCR 鑒定)，但由于蟲體“隱性感染”的存在，這些方法均存在一定的缺陷，敏感性不高[5]。本實(shí)驗(yàn)首次擴(kuò)增犬惡絲蟲的Di-Serpin基因片段，原核表達(dá)并純化重組蛋白rDi-Serpin，通過western blot 和間接免疫熒光(IFA)定位探究其生物學(xué)特性，并初步評(píng)價(jià)了rDi-Serpin 的診斷價(jià)值，為犬惡絲蟲病早期診斷方法的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 蟲株、菌株、載體及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 犬惡絲蟲蟲體采自四川省自然感染并剖檢的犬，蟲體自犬心臟分離后使用PBS 清洗，參照有關(guān)文獻(xiàn)資料，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為犬惡絲蟲。大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)、pET-32a(+)載體和pMD19-T 載體購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；犬惡絲蟲的蟲體粗提蛋白由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲病研究中心提供。2只3 月齡～4 月齡雌性健康新西蘭兔，體質(zhì)量1.5 kg～2.0 kg，購(gòu)自成都達(dá)碩生物有限公司。

1.2 血 清 20 份犬惡絲蟲陽性血清采自四川省自然感染的犬(經(jīng)剖檢在心臟內(nèi)查到犬惡絲蟲蟲體)；24 份犬惡絲蟲陰性血清采自春季，經(jīng)體內(nèi)外驅(qū)蟲處理后糞檢鑒定無寄生蟲感染的3 月齡犬。8 份人工感染豆?fàn)顜Ы{蟲(Taenia pisiformis)的犬血清樣品、9份人工感染多頭帶絳蟲(Taenia multiceps)的犬血清樣品、9 份自然感染犬鉤口線蟲(Ancylostoma caninum)的犬血清樣品、19 份自然感染犬弓首蛔蟲(Toxocara canis)的犬血清樣品和5 份自然感染等孢球蟲(Isosporasp.)的犬血清樣品均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物寄生蟲病研究中心提供。以上血清樣本均經(jīng)糞檢和死亡剖檢確認(rèn)，為單一蟲種感染。兔陰性血清采自四川省某兔場(chǎng)1 月齡～2 月齡的仔兔。

1.3 主要試劑 總RNA 抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒和HRP-DAB 底物顯色試劑盒、TMB 底物顯色液均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker、Protein Marker、限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ、EcoRⅠ)、T4 DNA 連接酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；羊抗兔HRP-IgG、兔抗犬HRP-IgG、羊抗兔FITC-IgG 購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ni2+螯合親和層析柱、HiTrap Protein A 預(yù)裝柱均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.4 犬惡絲蟲Di-Serpin 基因的克隆、表達(dá)與純化從液氮中取出犬惡絲蟲蟲體，研究后根據(jù)總RNA抽提試劑盒說明提取犬惡絲蟲的總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明獲得合成cDNA。參照犬惡絲蟲成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的Serpin 基因序列unigene 979，切除信號(hào)肽后利用軟件Primer premier 6.0 設(shè)計(jì)引物(上游： 5'-CGCGGATCCAAAGTTGTAAAATTACCCTA-3'，含BamHⅠ酶切位點(diǎn)；下游：5'-CCGGAATTCTTAGATTCTCCAAATAAACTGCGG-3'，含EcoRⅠ酶切位點(diǎn))。以制備的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃1 min、50.4 ℃45 s、72 ℃30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；8 ℃儲(chǔ)存。PCR 擴(kuò)增完成后，構(gòu)建pET-32a(+)-Serpin 重組表達(dá)質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21 中，經(jīng)菌液PCR 鑒定后測(cè)序。引物合成及目的基因測(cè)序均由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。擴(kuò)大培養(yǎng)測(cè)序正確的pET-32a(+)-Serpin 表達(dá)菌，在優(yōu)化的最佳誘導(dǎo)條件(IPTG 誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間)下大量表達(dá)，使用Ni2+螯合親和層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物，得到純化后的重組蛋白rDi-Serpin，使用SDS-PAGE 對(duì)純化后的rDi-Serpin 進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 Di-Serpin 基因的生物信息學(xué)分析 根據(jù)擴(kuò)增得到的犬惡絲蟲Di-Serpin 基因序列，利用在線軟件Translate(https://web.expasy.org/translate/)推測(cè)其氨基酸序列；軟件Yaspin(http://www.ibi.vu.nl/programs/yaspinwww/)預(yù)測(cè)Di-Serpin 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。采用軟件Clustal W 比對(duì)Di-Serpin 蛋白的同源序列后利用DNAMAN 軟件進(jìn)行序列相似性分析、 MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Maximum Likelihood 法)。

1.6 兔抗rDi-Serpin-IgG 血清的制備與純化 將純化后的rDi-Serpin 與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑按1∶1 比例混合制成油包水的乳制劑，蛋白濃度約為1 mg/mL。分別對(duì)兩只新西蘭兔皮下多點(diǎn)注射，蛋白量為200 μg/只，每次間隔2 周，共免疫4次。以兔免疫前血清為陰性對(duì)照，PBS 為空白對(duì)照，測(cè)得兔多抗血清效價(jià)大于1∶1 200 后對(duì)其心臟采血并分離血清。獲得的兔多抗血清經(jīng)飽和硫酸銨粗提純，0.45 μm NC 膜過濾，HiTrap Protein A 預(yù)裝柱純化得到兔抗rDi-Serpin-IgG，使用SDS-PAGE 對(duì)純化后的兔抗rDi-Serpin-IgG 進(jìn)行檢測(cè)。參照上述方法純化得到兔陰性血清IgG。

1.7 Western blot 分析 純化后的rDi-Serpin 和犬惡絲蟲的蟲體粗提蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分離后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素濾膜(NC 膜)上，5 %脫脂奶粉室溫封閉2 h 后分別利用犬的犬惡絲蟲陽性血清和陰性血清(1∶100 稀釋)、兔抗rDi-Serpin-IgG 和兔陰性血清IgG(1 ∶200 稀釋)作為一抗孵育rDi-Serpin，利用兔抗rDi-Serpin-IgG 和兔陰性血清IgG (1∶200 稀釋)作為一抗孵育犬惡絲蟲的蟲體粗提蛋白。充分洗滌后分別加入兔抗犬HRP-IgG 和羊抗兔HRP-IgG (1∶2 000 稀釋)作為二抗，western blot 檢測(cè)rDi-Serpin 與rDi-Serpin-IgG 的反應(yīng)原性。

1.8 犬惡絲蟲蟲體橫切面Serpin 蛋白的IFA 定位將4 %多聚甲醛固定的犬惡絲蟲雌性和雄性成蟲經(jīng)石蠟包埋、切片處理(4 μm/片)、光學(xué)顯微鏡下觀察篩選得到結(jié)構(gòu)完整的切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、檸檬酸緩沖液熱修復(fù)、3 % H2O2氧化修復(fù)后滴加5 %牛白蛋白溶液(BSA)室溫封閉1 h，分別滴加兔抗rDi-Serpin-IgG 和兔陰性血清IgG (1∶100 稀釋)作為一抗，羊抗兔FITC-IgG (0.1 %伊文氏藍(lán)1∶100 稀釋)作為二抗，4,6- 二脒基-2- 苯基吲哚(DAPI)染色劑對(duì)蟲體細(xì)胞核顯色，甘油緩沖液封片后熒光顯微鏡下觀察Serpin 蛋白在犬惡絲蟲蟲體橫切面上的分布并拍照記錄。

1.9 間接ELISA 方法的建立 以純化后的rDi-Serpin 為包被抗原，采用棋盤滴定法，對(duì)包被抗原濃度(3.75 μg/ 孔、1.87 μg/ 孔、0.94 μg/ 孔、0.47 μg/孔、0.23 μg/ 孔和0.12 μg/ 孔)、血清的稀釋度(1∶20、1 ∶40、1 ∶80、1 ∶160、1 ∶320、1 ∶640、1 ∶1 280 和1∶2 560)、封閉液(1 % BSA、5 % 脫脂奶粉和10%脫脂奶粉)、二抗的稀釋度(1 ∶1 000、1 ∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000)進(jìn)行優(yōu)化。使用優(yōu)化后的最佳包被抗原濃度4 ℃孵育過夜，封閉液封閉，以犬惡絲蟲陽性血清和陰性血清作為一抗，兔抗犬HRP-IgG 作為二抗，TMB 底物顯色液顯色，2 mol/L 的H2SO4終止后，酶標(biāo)儀測(cè)定其OD450nm值。

陰陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)采用Cut off 值法，即采用優(yōu)化后的反應(yīng)條件分別對(duì)24 份犬的犬惡絲蟲陰性血清的OD450nm值進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算算數(shù)平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)后根據(jù)公式臨界值=X+3SD 得到Cut off 值，當(dāng)檢測(cè)樣本OD450nm值大于且等于Cut off 值則判定為陽性。

利用優(yōu)化后的間接ELISA 方法對(duì)犬的20 份犬惡絲蟲陽性血清和24 份犬惡絲蟲陰性血清進(jìn)行檢測(cè)判定該方法的敏感性；同時(shí)，對(duì)犬的8 份豆?fàn)顜Ы{蟲陽性血清、9 份多頭帶絳蟲陽性血清、9 份犬鉤口線蟲陽性血清、19 份犬弓首蛔蟲陽性血清和5 份球蟲陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，判定該方法的特異性；將犬惡絲蟲陽性血清按1∶10～1∶12 800 做2 倍系列稀釋，判定血清最大稀釋倍數(shù)，確定該方法的靈敏度。根據(jù)公式敏感性=100 %×真陽性血清數(shù)/(真陽性血清數(shù)+假陰性血清數(shù))，特異性=100 %×真陰性血清數(shù)/(真陰性血清數(shù)+ 假陽性血清數(shù))確定該方法的敏感性和特異性。每次每板均設(shè)置陰、陽性血清對(duì)照和空白對(duì)照，以空白調(diào)零，通過批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)(CV= 標(biāo)準(zhǔn)方差/ 平均值)來檢測(cè)該方法的重復(fù)性。

1.10 Di-Serpin 診斷價(jià)值的初步評(píng)價(jià) 使用建立間接ELISA 方法對(duì)經(jīng)傳統(tǒng)方法- 飽和食鹽水漂浮法和貝爾曼法檢測(cè)犬糞便內(nèi)寄生蟲種類后剖檢犬心臟及腸道進(jìn)行寄生蟲檢查，確定的24 份無寄生蟲病感染的犬血清、20 份僅感染犬惡絲蟲病的陽性血清和50 份僅感染除犬惡絲蟲病的其它寄生蟲病的犬血清進(jìn)行檢測(cè)，比較該方法與傳統(tǒng)方法的差異，按公式總體符合率=100 %×(真陽性血清數(shù)+ 真陰性血清數(shù))/(真陽性血清數(shù)+ 假陽性血清數(shù)+ 真陰性血清數(shù)+假陰性血清數(shù))計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 Di-Serpin 基因的克隆、表達(dá)與純化 PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期的Di-Serpin 相符(圖1)，測(cè)序結(jié)果顯示Di-Serpin 基因片段長(zhǎng)363 bp，表明克隆結(jié)果即所求片段。擴(kuò)大培養(yǎng)測(cè)序正確的pET-32a(+)-Serpin/BL21 表達(dá)菌，37 ℃，經(jīng)0.8 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)12 h 后檢測(cè)，結(jié)果顯示，rDi-Serpin 正確表達(dá)(圖2 泳道2)，且該蛋白主要以包涵體的形式存在，大小約為32 ku (Di-Serpin 蛋白約14 ku，His標(biāo)簽約18 ku)。經(jīng)Ni2+螯合親和層析柱純化后，得到的rDi-Serpin 條帶較單一，表明該蛋白純度較好(圖2 泳道3)，具備進(jìn)一步研究的潛力。

圖1 Di-Serpin 基因的PCR 擴(kuò)增Fig.1 Amplification of Di-Serpin gene by RT-PCR

2.2 Di-Serpin 基因的生物信息學(xué)分析 分析結(jié)果顯示擴(kuò)增的基因片段共編碼121 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為13.56 ku，等電點(diǎn)為5.06，含有1 個(gè)Serine protease inhibitor 結(jié)構(gòu)域，2 個(gè)糖基化位點(diǎn)和2個(gè)豆蔻酰化位點(diǎn)，表明Di-Serpin 是Serpin 超家族中的一員?；谲浖﨑NAMAN 對(duì)不同來源的Serpin氨基酸序列進(jìn)行相似性分析，結(jié)果顯示犬惡絲蟲的Di-Serpin 與羅阿絲蟲(Loa loa)Serpin 氨基酸的序列相似性最高(78 %)，與旋毛蟲(Trichinella spiralis)和豬帶絳蟲(Taenia solium)的Serpin 氨基酸序列相似性較低(51 %和37 %)。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，犬惡絲蟲與羅阿絲蟲親緣關(guān)系較近，先與之聚類后再依次與馬來絲蟲(Brugia malayi)、班氏絲蟲(Wuchereria bancrofti)聚類，與旋毛蟲、豬帶絳蟲等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)，表明Di-Serpin 基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與該蟲的進(jìn)化關(guān)系一致。

圖2 基于rDi-Serpin 的SDS-PAGE 檢測(cè)與western blot 分析Fig.2 The SDS-PAGE detection and western blot analysis of rDi-Serpin

圖3 Di-Serpin 的系統(tǒng)進(jìn)化樹(ML 樹)Fig.3 The phylogenetic tree based on Di-Serpin gene(Maximum Likelihood tree)

2.3 兔抗rDi-Serpin-IgG 的制備與western blot 分析 純化后的兔抗rDi-Serpin-IgG 在約50 ku 和25 ku分別出現(xiàn)抗體的重鏈和輕鏈，且50 ku 條帶較清楚(圖2 泳道4)，表明純化后的rDi-Serpin-IgG 結(jié)構(gòu)完整且純度較好。Western blot 結(jié)果顯示，純化后的rDi-Serpin 能夠被自然感染犬惡絲蟲的犬陽性血清與純化后的兔抗rDi-Serpin-IgG 識(shí)別，不能被犬陰性血清和兔陰性血清IgG 識(shí)別(圖2 泳道5～8)，表明rDi-Serpin 具有較好的反應(yīng)原性。純化后的兔抗rDi-Serpin-IgG 能夠與犬惡絲蟲的蟲體粗提蛋白反應(yīng)，在約23 ku 位置能檢測(cè)到蛋白信號(hào)，大小與預(yù)測(cè)的Serpin 天然蛋白大小基本一致(圖2 泳道9)，表明rDi-Serpin 即犬惡絲蟲的Serpin 蛋白。

2.4 Di-Serpin 蛋白的IFA 定位 IFA 檢測(cè)Serpin蛋白在犬惡絲蟲蟲體模切面上的分布，結(jié)果顯示，Di-Serpin 在雌性和雄性成蟲的表皮層、肌肉層、腸上皮、子宮、睪丸中均有表達(dá)，其中在表皮層和腸上皮表達(dá)水平較高，在蟲體的肌肉層、雄蟲睪丸的表面和雌蟲子宮表達(dá)量較低(圖4)，提示Di-Serpin可能是一種分泌性的蛋白。

圖4 雄性、雌性犬惡絲蟲橫切面Di-Serpin 蛋白的IFA 定位Fig.4 Tissue localization of the transverse sections of male and female D.immitis Di-Serpin protein detected by indirect immunofluorescence

2.5 間接ELISA 方法的建立 采用棋盤滴定法優(yōu)化結(jié)果顯示，rDi-Serpin 蛋白最佳包被濃度為0.47 μg/孔，血清的最佳稀釋度為1∶160，最佳封閉液為5 %脫脂奶粉，二抗的最佳稀釋度為1∶3 000。利用優(yōu)化后的反應(yīng)條件測(cè)定24 份犬的犬惡絲蟲陰性血清OD450nm值，結(jié)果顯示，OD450nm值的算數(shù)平均值為0.241，標(biāo)準(zhǔn)差為0.029，根據(jù)公式計(jì)算得到Cut off值為0.328，即當(dāng)OD450nm≥0.328 時(shí)，可判定為陽性，當(dāng)OD450nm＜0.328 可判定為陰性。

2.6 敏感性和特異性分析 利用建立的間接ELISA方法檢測(cè)20 份犬的犬惡絲蟲陽性血清和24 份陰性血清，結(jié)果顯示14 份陽性血清OD450nm＞0.328，6 份陽性血清和24 份陰性血清OD450nm＜0.328 (圖5A)，該方法的敏感性為70 % (14/20)，使用該方法進(jìn)行檢測(cè)可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。利用建立的間接ELISA方法檢測(cè)豆?fàn)顜Ы{蟲陽性血清、多頭帶絳蟲陽性血清、犬鉤口線蟲陽性血清、犬弓首蛔蟲陽性血清和球蟲陽性血清，對(duì)其它寄生蟲陽性血清結(jié)果顯示包被的rDi-Serpin 除與豆?fàn)顜Ы{蟲陽性血清交叉反應(yīng)較強(qiáng)外，與其它蟲種的陽性血清也存在部分交叉反應(yīng)(圖5B)，該方法的特異性為70 % (35/50)，使用該方法進(jìn)行檢測(cè)可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

圖5 重組蛋白rDi-Serpin 的間接ELISA 檢測(cè)犬惡絲蟲Fig.5 Indirect ELISA for the detection of the D.immitis in dog by using rDi-Serpin

2.7 靈敏度試驗(yàn) 利用間接ELISA 方法檢測(cè)經(jīng)1:10～1∶12 800 倍比稀釋后的犬惡絲蟲陽性血清，結(jié)果顯示，當(dāng)陽性血清1∶1 600 稀釋時(shí)OD450nm＞0.328，當(dāng)1∶3 200 稀釋時(shí)OD450nm＜0.328，因此該方法的靈敏度為1∶1 600，陽性血清稀釋1 600 倍后仍能被檢出。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 利用間接ELISA 方法進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)小于5%；批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)小于10%(表1)，表明該檢測(cè)方法重復(fù)性較好。

表1 間接ELISA 重復(fù)性試驗(yàn)(n=6)Table 1 Repeatability assay of the indirect ELISA (n=6)

2.9 符合率試驗(yàn) 20 份犬惡絲蟲陽性血清、24 份犬惡絲蟲陰性血清和50 份其它蟲種陽性血清均是經(jīng)過傳統(tǒng)方法確認(rèn)無誤后使用。間接ELISA 檢測(cè)結(jié)果表明，該方法對(duì)無寄生蟲感染的犬檢測(cè)正確率為100 %，但對(duì)僅感染犬惡絲蟲和僅感染其它寄生蟲的犬檢測(cè)正確率均為70 %，陰性符合率為79.7 %(59/74)，總體符合率為77.7 % (73/94)，表明該方法的正確率不高。

3 討 論

犬惡絲蟲“隱性”感染的存在，即犬惡絲蟲感染早期宿主血液中幼蟲尚未發(fā)育成熟，或宿主體內(nèi)僅存在雄蟲，或宿主體內(nèi)發(fā)育成熟的雌蟲未產(chǎn)生循環(huán)微絲蚴，嚴(yán)重影響著犬惡絲蟲病診斷的準(zhǔn)確性，常規(guī)的診斷方法常出現(xiàn)假陰性的結(jié)果[2,5-6]，市場(chǎng)上現(xiàn)有的犬惡絲蟲病商品化檢測(cè)試劑盒對(duì)宿主體內(nèi)僅感染雄蟲或感染早期也無法準(zhǔn)確檢測(cè)[7-8]。由于宿主體內(nèi)犬惡絲蟲抗體比循環(huán)抗原能更早地被檢出，抗體檢測(cè)或許可以用于犬惡絲蟲病的早期診斷[9]。研究表明，使用純化后的犬惡絲蟲粗抗原檢測(cè)該病敏感性(91.7 %)和特異性均較高，但該方法存在蟲體粗抗原來源受限和蟲體各時(shí)期粗抗原的差異性較大的缺點(diǎn)[10-11]。蟲體的重組抗原由于具有穩(wěn)定的來源和較好的敏感性及特異性，現(xiàn)已成為該病診斷研究的方向之一，犬惡絲蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和分泌組數(shù)據(jù)的相繼公開，也為該病候選診斷抗原的篩選創(chuàng)造了可能。近期，有研究表明以犬惡絲蟲的重組蛋白二?；视图っ?DgK)作為抗原診斷該病，敏感性和特異性分別為92.5 %和87.5 %[12]。

Serpin 廣泛存在于寄生蟲中，是寄生蟲與宿主間發(fā)生相互作用的重要分子，可作用于宿主酶有利于蟲體從宿主獲取營(yíng)養(yǎng)，或抵抗宿主酶對(duì)蟲體的損傷，或調(diào)節(jié)宿主的炎癥及免疫應(yīng)答[4]。本研究首次對(duì)雌性和雄性犬惡絲蟲橫切面上Di-Serpin 蛋白的分布進(jìn)行研究，結(jié)果顯示Di-Serpin 的分布情況與旋盤尾絲蟲(Onchocerca volvulus)、華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)和多房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis)等蟲體上Serpin 的分布規(guī)律相似，主要分布于蟲體體表和腸上皮[13-15]。這提示Di-Serpin 可能是一種分泌性的蛋白，能夠分泌到蟲體外與宿主中的蛋白酶反應(yīng)，有利于幼蟲在宿主體內(nèi)的移行和長(zhǎng)期寄生，本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究其功能奠定了基礎(chǔ)。

寄生蟲的Serpin 具有良好的免疫反應(yīng)性，可以作為寄生蟲早期血清學(xué)診斷的候選抗原，現(xiàn)有研究已證實(shí)該蛋白在馬來絲蟲、旋毛蟲和旋盤尾絲蟲上具有較好的診斷價(jià)值[4]。本研究首次使用western blot 對(duì)rDi-Serpin 的免疫原性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有較好的免疫反應(yīng)性，可能具備犬惡絲蟲早期診斷候選抗原的潛力。雖然基于rDi-Serpin 建立的間接ELISA 方法靈敏度高達(dá)1∶1 600，對(duì)無寄生蟲感染的犬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)正確率達(dá)100 %，但對(duì)僅感染犬惡絲蟲病和僅感染其它寄生蟲的犬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)正確率不高，敏感性和特異性均為70 %，既存在假陰性結(jié)果，也存在假陽性結(jié)果。分析間接ELISA 方法敏感性較低的原因，一是本次擴(kuò)增的Di-Serpin 基因是犬惡絲蟲Di-Serpin 蛋白的一個(gè)片段[16]，可能未包含全部抗原決定簇，犬血清中針對(duì)該抗原決定簇的抗體含量較低；二是可能與犬血清中抗原-抗體復(fù)合物的存在有關(guān)，有研究表明血清中抗原-抗體復(fù)合物的存在會(huì)干擾抗原的檢測(cè)[17-18]。本研究結(jié)果顯示，該蛋白或許并不適合作為犬惡絲蟲病的候選診斷抗原。