利用熒光定量技術檢測生鮮乳中黃曲霉毒素M1

鄭君杰，方芳，孫志偉，賈濤，李征，何月新

（北京市飼料監(jiān)察所，北京 100107）

黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）是多種霉菌（如黃曲霉和寄生曲霉）產生的有毒代謝物，是人類癌癥的一個重要致癌原。至今已分離出的黃曲霉毒素及其衍生物有20多種，自然界中主要包含四種亞型（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2）。動物進食發(fā)霉飼料后，黃曲霉毒素一部分蓄積在動物體內，另一部分則會轉化到乳汁和尿液中，轉化率一般為3.45%～11.39%，排出AFM1的量為AFB1攝入量的1%～3%[1]。黃曲霉毒素B1可通過羥基化轉化為黃曲霉毒素M1，因此牛奶中就會含有黃曲霉毒素M1，目前各毒素亞型已知毒性大小順序為AFB1＞AFM1＞AFG1＞AFB2＞AFG2[2]。黃曲霉毒素M1相對穩(wěn)定，常規(guī)處理方法如巴氏殺菌不會對其產生影響，因此如果生鮮乳中存在黃曲霉毒素M1，其終端產品中也將存在，所以很多國家對乳及乳制品中黃曲霉毒素M1含量進行了限制。

本試驗使用熒光定量檢測卡及高通量實時熒光定量檢測儀測定生鮮乳中黃曲霉毒素M1含量，檢測原理是以熒光素作為發(fā)光物質來標記抗體，檢測樣本中相應的目標物。熒光定量檢測技術檢測速度快、操作簡單、成本低廉，已經在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測等領域得到廣泛應用[3]。通過計算機輔助半抗原合理設計，采用雜交瘤、熒光標記等技術，獲得了熒光定量快速檢測卡，檢測卡中的硝酸纖維素膜（NC）含有固定于測試區(qū)（T）的包被抗原、控制區(qū)（C）的多克隆抗體和固定于結合釋放墊上的熒光素標記抗體。當將待測樣品滴加在加樣區(qū)時，樣品中的目標物在毛細滲移過程中與熒光素標記的特異性單克隆抗體結合，抑制了抗體和T區(qū)包被抗原的結合，使T區(qū)熒光減弱；反之，T區(qū)熒光增強。采用熒光讀數儀讀取T線熒光強度，借助儀器內置的標準曲線即可計算出樣品中目標物含量。

1 材料和方法

1.1 材料

黃曲霉毒素M1熒光定量檢測卡。

1.2 儀器

微量移液器；計時器；熒光免疫定量分析儀（北京維德維康生物技術有限公司，型號：FQ-S1）。

1.3 樣品的制備

空白樣品：生鮮乳。

添加樣品：向空白樣品加入黃曲霉毒素M1標準品至所需濃度。

表1 空白樣品測定結果統(tǒng)計表 單位：μg/L

表2 準確度和精密度

1.4 試驗方法

1.4.1 最低檢測限測定

取20份空白樣品，按照黃曲霉毒素M1熒光定量檢測卡操作說明書方法進行檢測，計算出其平均值，再加上3倍標準差，即為最低檢測限。

1.4.2 準確度和精密度

準確度是指測定值與真實值的符合程度。取空白生鮮乳樣品按0.05μg/L、0.1μg/L黃曲霉毒素M1標準品進行添加，每個添加5個平行，使用黃曲霉毒素M1熒光定量檢測卡進行檢測。

1.4.3 與儀器方法比較

采用黃曲霉毒素M1熒光定量檢測卡和高效液相色譜法分別對50份生鮮乳盲樣進行測定，比較測定結果，以檢測限作為陰陽性判定值。

2 結果與分析

2.1 最低檢測限測定

結果表明，計算出的最低檢測限為0.047 μg/L（表1）。為保障產品的穩(wěn)定性，將黃曲霉毒素M1熒光定量檢測卡在生鮮乳中的檢測限定為0.05μg/L。

2.2 準確度和精密度

用3個批次的檢測卡測定，結果見表2。結果表明，所有樣品各添加濃度的回收率均在90.00%～110.00%之間。各添加濃度的批內、批間變異系數均低于15%。

2.3 與儀器方法比較

表3 與儀器方法比較結果 單位：μg/L

用該黃曲霉毒素M1熒光定量檢測卡和《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素M族的測定》（GB5009.24-2016）第二法[4]分別對50份生鮮乳盲樣進行測定，比較測定結果，以檢測限作為陰陽性判定值。小于黃曲霉毒素M1熒光定量檢測卡檢測限的檢測結果記為“-”，儀器結果記為“ND”；大于黃曲霉毒素M1熒光定量檢測卡檢測限的以實際檢測值表示（表3）。結果顯示，二者的符合率為100%。

3 討論

因為生鮮乳貯存條件特殊，不宜長時間運輸貯存，所以快速檢測方法對生鮮乳質量監(jiān)測具有重要意義，尤其是現(xiàn)場檢測，可以提高工作效率，加大監(jiān)測范圍和力度，保證生鮮乳及乳制品質量安全。目前實驗室常用的快速檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）和膠體金法。ELISA法可以定量但對實驗室條件要求比較高，適合大批量樣品同時檢測；膠體金法快捷簡便，但一般用于定性。這些方法均不能很好地滿足在奶站和奶車現(xiàn)場快速檢測、養(yǎng)殖場對個別奶牛連續(xù)監(jiān)測等方面的要求。而本文所采用的熒光定量檢測法具有以下幾個優(yōu)點：①試驗所需儀器設備少，只需要一臺配套熒光定量檢測儀即可，不需要離心機等多個輔助設備；②操作時間短，高通量實時熒光定量檢測儀在15min內即可完成檢測；③少量、大批量樣品篩查均適合，一次可以做1～10個樣品，可根據樣品量使用檢測卡，節(jié)省檢測成本，后續(xù)還可以進行數據實時上傳；④檢測卡可常溫保存，沒有酶標物、抗體、底物等材料，對保存條件要求低；⑤可以準確定量。

黃曲霉毒素M1熒光定量檢測卡在生鮮乳中的檢測限為0.05μg/L，農業(yè)部近兩年在全國生鮮乳專項監(jiān)測計劃中，要求快速方法的檢出限為不高于0.05μ g/kg。大多數國家都對食品或飼料中黃曲霉毒素含量進行了限制，如歐盟將牛奶和奶粉復原乳中黃曲霉毒素M1限量規(guī)定為0.05μ g/L或50ppt，嬰幼兒配方奶粉和嬰兒醫(yī)用特殊食品中的限量值為0.025μg/kg；我國《食品安全國家標準 食品中真菌毒素安全限量》（GB2761-2017）中規(guī)定乳及乳制品中黃曲霉毒素M1限量值為0.5μg/kg；美國食品與藥品監(jiān)督管理局（FDA）和日本規(guī)定的牛奶中黃曲霉毒素M1限量值也為0.5μg/kg[5]。從以上數據可以看出，熒光定量檢測卡在生鮮乳中黃曲霉素素M1快速篩查中，其檢測限能夠滿足我們國家專項監(jiān)測要求，同時低于或等于大多數國家安全限量值，也能夠滿足相關乳企質量安全檢測要求。

2016年，武瑞霞等[6]就國內外乳及乳制品黃曲霉毒素M1污染問題進行了綜述，認為乳及乳制品中黃曲霉毒素M1污染仍是一個全球尚未解決的問題，污染程度在地理分布上，總趨勢是從內陸向沿海、自北向南增高。我國是個乳品消費大國，因此對生鮮乳中黃曲霉毒素M1的控制更應該加強。本研究使用熒光定量檢測卡檢測黃曲霉毒素M1，各添加濃度回收率均在90.00%～110.00%之間；各添加濃度批內、批間變異系數均低于15%；黃曲霉毒素M1熒光定量檢測卡和儀器法盲樣測定符合率為100%。通過添加、盲樣測定、與儀器方法比較等試驗，表明該方法簡便快捷、檢測結果準確可靠，可以用于生鮮乳檢測機構及奶牛養(yǎng)殖場、奶站、奶車的現(xiàn)場黃曲霉毒素M1快速檢測。