Zfy干擾基因?qū)伤固古Ｐ詣e控制的效果

袁立崗，席繼峰，柳煒，徐建平

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師畜牧獸醫(yī)工作站，烏魯木齊 830009；2.新疆石河子大學(xué)，石河子 832000； 3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二師畜牧獸醫(yī)工作站，鐵門關(guān) 841007）

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，采取不同方法利用人工手段控制動物性別的技術(shù)逐步成熟，并應(yīng)用于生產(chǎn)。在奶牛養(yǎng)殖生產(chǎn)中，為了加快奶牛群的擴(kuò)繁速度，提高奶牛的繁殖力和利用價值，通過人工性控技術(shù)，改變公母比例，從而獲得較多的母牛。目前常用的方法是在體外利用先進(jìn)儀器，對所采出的公牛精液進(jìn)行X、Y分離，從而取得性控精液[1]。這種方法雖然母犢率較高，但成本大，凍精在使用過程中對受配母牛的條件要求較高，受胎率較低（僅45%）[2，3]，而且所產(chǎn)母犢體質(zhì)較差，因此實際生產(chǎn)中較難推廣。

Zfy被稱為與Y染色體相關(guān)的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子 (Y chromosome linked zinc-finger protein transcriptional factor)，是位于Y染色體短臂上能夠編碼鋅指蛋白的基因，其基因家族還包括位于X染色體上的Zfx和位于常染色體上的Zfa。該基因家族對DNA、RNA起特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，因此Zfy基因被應(yīng)用于哺乳動物的性別鑒定。最近的研究表明，Zfy基因參與哺乳動物的單倍體生精細(xì)胞的更新分化和發(fā)育，對于減數(shù)分裂和精子生成至關(guān)重要，這為特異性干擾或控制單一的X或Y精子，從而從源頭上控制動物性別提供了新的思路[4]。

本次試驗研究應(yīng)用的性控凍精是采用RNA干擾技術(shù)，通過對公牛睪丸進(jìn)行Zfy干擾基因載體連續(xù)注射后，采集其精液并制成性控凍精。為與其他性控凍精區(qū)分，筆者把這種方法制作的性控凍精取名為“多產(chǎn)母犢”凍精。本試驗研究了這種凍精在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用效果，并與普通凍精進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 凍精的來源與品質(zhì)

“多產(chǎn)母犢”凍精的制作方法由石河子大學(xué)科研人員研究提供，“多產(chǎn)母犢”凍精和對照組使用的普通凍精均由新疆天山畜牧有限公司生產(chǎn)。

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《牛冷凍精液》GB-4143-2008要求，檢驗試驗用冷凍精液的品質(zhì)。經(jīng)對“多產(chǎn)母犢”凍精有關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測，各項指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)，即：活力≥35%，劑量≥18mL，畸形率≤18%，直線運動精子數(shù)≥800萬，菌落數(shù)≤800個。詳見表1。

表1 “多產(chǎn)母犢”凍精品質(zhì)檢測結(jié)果

1.2 試驗動物

適配母牛選擇烏市近郊養(yǎng)殖小區(qū)兩個養(yǎng)殖大戶的健康和繁殖力好的成母牛，每戶設(shè)試驗組與對照組，試驗組72頭、對照組64頭，試驗組使用“多產(chǎn)母犢”凍精，對照組使用普通凍精，試驗組與對照組的適配母牛不分胎次，同一圈飼養(yǎng)。

1.3 授精方法

采用人工授精方法，試驗牛均由同一個人工授精員授精。授精部位為宮頸口。實行一個情期二次配種，即早上發(fā)情下午配，第二天上午10點加配一次；晚上發(fā)情第二天上午配，下午 6點鐘加配一次。對所有試驗?zāi)概Ｔ诋a(chǎn)后20d用“清宮液”進(jìn)行產(chǎn)道處理，配種前對精液的品質(zhì)（密度、活力）進(jìn)行測試，密度、活力較低時采用一次輸精用二劑凍精。

1.4 所產(chǎn)后裔的體重、體尺測定

對試驗組與對照組所產(chǎn)母犢在13月齡時進(jìn)行體重、體尺測定，評價其生長發(fā)育狀況。測定指標(biāo)和方法：用測杖測量體高，用專用卷尺測量胸圍和體斜長。體高為鬐甲最高點到地面的垂直距離，胸圍為肩胛后角處體軀的垂直周徑，其松緊度以能插入食指和中指自由滑動為準(zhǔn)，體斜長為從肩胛骨前緣到同側(cè)坐骨結(jié)節(jié)后緣間的距離[5]。

體重估測公式：體重=胸圍2（m）×體斜長（m）×90。測量體尺的時間在下午5點牛上槽之后10min開始。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗結(jié)果

試驗組兩戶人家共配牛72頭，其中受胎52頭，生產(chǎn)母犢40頭；對照組二戶人家共配牛64頭，其中受胎48頭，生產(chǎn)母犢23頭。詳見表2。

表2 配種試驗結(jié)果

表3 奶牛13月齡體尺、體重測量表

2.2 后裔發(fā)育狀況

經(jīng)對試驗組與對照組所產(chǎn)母犢在13月齡時的體重體尺測定，體重分別為439.8kg和367.7kg，胸圍為177.1cm和166.3cm，體高為129.5cm和127.3cm，體斜長為140.6cm和138.3cm。詳見表3。

2.3 中試應(yīng)用結(jié)果

2018年，在烏魯木齊市近郊的三個奶牛養(yǎng)殖小區(qū)，選擇飼養(yǎng)條件較好的24家養(yǎng)殖戶，共計1 485頭成母牛進(jìn)行了“多產(chǎn)母犢”凍精的中試應(yīng)用，共配母牛1 048頭，受胎685頭，受胎率65.4%。共產(chǎn)母犢484頭，母犢率71.6%。詳見表4。

表4 “多產(chǎn)母犢”凍精中試應(yīng)用效果統(tǒng)計表

2.4 對結(jié)果的分析

2.4.1 多產(chǎn)母犢凍精試驗效果，受胎率達(dá)到72.2%，母犢率達(dá)到76.9%，后裔13月齡體重平均達(dá)到439.8kg。而對照組受胎率75%，母犢率47.9%，與試驗組相比，母犢率相差29個百分點，后裔13月齡體重平均為367.7kg，與試驗組相比相差了72.1kg。中試應(yīng)用效果：受胎率平均達(dá)到65.4%，母犢率平均達(dá)到71.6%，無論試驗效果還是應(yīng)用效果均比較明顯。

2.4.2 在應(yīng)用效果中，小區(qū)一的母犢死亡率達(dá)到22.5%，死亡的主要癥狀是拉稀、咳嗽，雖然沒有對死亡母犢進(jìn)行及時診斷，但結(jié)合發(fā)病季節(jié)（多發(fā)生在4～5月份）、發(fā)病后抗菌藥物治療效果差，以及小區(qū)疾病的流行情況分析，死亡原因可能與牛病毒性腹瀉（BVDV）或其他病毒性疾病感染有關(guān)。通過與同一時期同一小區(qū)應(yīng)用普通凍精所產(chǎn)母犢的死亡率比較，兩者相差不明顯，因此判斷與所使用的“多產(chǎn)母犢”凍精關(guān)系不大。

2.4.3 在同一飼養(yǎng)環(huán)境下，通過對試驗組與對照組相同月齡（13月齡）牛的體尺測試，后者比前者體重相差72.1kg（P＞0.05）、體高相差2.2cm（P＞0.05）、胸圍相差10.8cm（P＞0.05）、體斜長相差2.3cm（P＞0.05）。

3 討論

3.1 探索安全高效廉價的生物技術(shù)，合理定向控制動物性別對于快速擴(kuò)繁動物種群數(shù)量，優(yōu)化動物繁育體系，促進(jìn)育種進(jìn)程，提高群體中與性別相關(guān)的生產(chǎn)性狀（如毛皮性狀、產(chǎn)肉性狀）獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益有重大意義。對決定動物性別的相關(guān)基因及其調(diào)控機(jī)制的研究一直以來都是動物科學(xué)領(lǐng)域和動物遺傳育種與繁殖專業(yè)的研究熱點。由于絕大多數(shù)動物都是雌雄異體，參與動物性別決定、分化和性腺發(fā)育的相關(guān)基因及其調(diào)控機(jī)制復(fù)雜多變。但是有一個基因的功能自始至今都備受關(guān)注，即Zfy基因。雖然Zfy基因一直以來備受關(guān)注，但是性別控制中的作用機(jī)理尚不完全清楚[4]，在動物性別控制，尤其是在哺乳動物精子生成過程中的作用機(jī)理還需進(jìn)一步探索研究。本次試驗進(jìn)一步證明利用生物技術(shù)控制奶牛性別的方法的可行性，但這種技術(shù)還需進(jìn)一步成熟轉(zhuǎn)化。

3.2 與在體外用儀器對公牛精液進(jìn)行X、Y分離的控制性別的方法不同，本次試驗和應(yīng)用的性控精液是在體內(nèi)通過分子生物學(xué)技術(shù)，特異精準(zhǔn)地定向干擾Y精子的發(fā)育和生成，從而改變X/Y精子比例，達(dá)到從源頭上控制動物性別的目的。近年來為達(dá)到盡快擴(kuò)繁的目的，利用X、Y精子分離技術(shù)生產(chǎn)的常規(guī)性控凍精多用于現(xiàn)代化的高產(chǎn)奶牛規(guī)模場，一般受配母牛多是1～2胎牛，且每一個情期只使用一次，返情后則換用普通凍精。由于其成本較高，國內(nèi)產(chǎn)品150～200元/劑、國外產(chǎn)品300～500元/劑，而且對受配母牛條件要求高[6～8]，雖然母犢率高，但受胎率低、精子密度和活力低。因此管理水平低、生產(chǎn)水平低的規(guī)模場，特別是養(yǎng)殖小區(qū)以及其他的散養(yǎng)戶則更多使用普通凍精?！岸喈a(chǎn)母犢”凍精的研發(fā)其優(yōu)勢介于性控凍精和普通凍精之間，雖然母犢率比常規(guī)性控凍精低20%左右，比普通凍精高20%左右，但其受胎率高、成本低，控制奶牛性別的方法簡單、方便易操作，使用后所產(chǎn)母犢生長發(fā)育較好，從而填補(bǔ)了性控凍精和普通凍精的不足，其推廣應(yīng)用的前景和價值較大。