發(fā)光二極管熒光顯微鏡在基層實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分枝桿菌的價(jià)值

張學(xué)志 林百豐 裴新發(fā) 陳麗 彭英 唐鷺

萋爾-尼爾遜染色(簡稱“萋-尼染色”)為涂片染色鏡檢的標(biāo)準(zhǔn)方法，此方法因其快速、易操作、價(jià)格低廉、特異度高等優(yōu)點(diǎn)成為結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室廣泛使用的主要診斷技術(shù)之一。但該方法敏感度較低，并且閱片時(shí)間較長，容易對(duì)患者造成漏診。研究發(fā)現(xiàn)，熒光染色法較該方法的敏感度提高了約8%[1]，而特異度與其相當(dāng)，鏡檢時(shí)間明顯縮短，特別適用于標(biāo)本量較大的基層結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室。熒光染色法的主要缺點(diǎn)是傳統(tǒng)熒光顯微鏡價(jià)格昂貴，需要暗室進(jìn)行檢測(cè)，影響其廣泛應(yīng)用。近年來，新的光源發(fā)光二極管(LED)應(yīng)用于熒光顯微鏡上很好地解決了普通熒光顯微鏡的這些缺點(diǎn)。為探索在基層實(shí)驗(yàn)室推廣使用此項(xiàng)技術(shù)的前景，筆者選擇8個(gè)縣級(jí)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)(簡稱“結(jié)防機(jī)構(gòu)”)對(duì)此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行了多中心評(píng)估，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料和方法

1.研究對(duì)象：連續(xù)納入2017年7月至2018年10月黑龍江省阿城、尚志、驗(yàn)收、賓縣、杜蒙、林甸、泰來、甘南8個(gè)縣級(jí)結(jié)防機(jī)構(gòu)的初診肺結(jié)核可疑癥狀者，共3770例，每例患者留取2～3份痰標(biāo)本，共9079份，全部進(jìn)行痰結(jié)核分枝桿菌固體培養(yǎng)。

2.試劑和儀器：各縣級(jí)結(jié)防機(jī)構(gòu)使用的熒光染色液、萋-尼染色液和酸性羅氏培養(yǎng)基均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；LED熒光顯微鏡為寧波舜宇儀器有限公司生產(chǎn)的EX30型。

3.試驗(yàn)方法：(1)痰涂片鏡檢：每份痰標(biāo)本涂2張?zhí)低科?，分別用萋-尼染色法和熒光染色法進(jìn)行染色，操作方法參見文獻(xiàn)[2]，同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)并將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行登記，并記錄鏡檢所用時(shí)間。由省級(jí)結(jié)核病預(yù)防控制中心每月抽取陽性涂片進(jìn)行復(fù)核。(2)培養(yǎng)：對(duì)納入的痰標(biāo)本全部進(jìn)行分枝桿菌簡單法固體分離培養(yǎng)，操作方法參見文獻(xiàn)[3]。(3)痰涂片保存：熒光染色涂片和萋-尼染色涂片正常保存在室溫條件下，避免陽光直射。(4)質(zhì)量控制：為保證鏡檢的質(zhì)量，在正式啟動(dòng)前對(duì)8個(gè)縣區(qū)的實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行嚴(yán)格培訓(xùn)，使其能夠準(zhǔn)確報(bào)告結(jié)果，培訓(xùn)結(jié)束后試運(yùn)行1個(gè)月，并對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行室間質(zhì)量評(píng)價(jià)和室內(nèi)質(zhì)量控制，全部達(dá)標(biāo)后才正式開始試驗(yàn)。

結(jié) 果

1.初診患者陽性檢出情況：萋-尼染色法和熒光染色法涂片鏡檢陽性率分別為11.41%(430/3770)和12.79%(482/3770)，固體培養(yǎng)陽性率為17.14%(646/3770)，三種方法檢測(cè)陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5602.10，P<0.01)。

2.兩種染色方法的診斷價(jià)值評(píng)價(jià)：以痰培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，萋-尼染色法和熒光染色法涂片鏡檢分枝桿菌的敏感度分別為61.46%和66.72%，特異度分別為 98.94%和98.37%。 萋-尼染色法約登指數(shù)為0.604，熒光染色法約登指數(shù)為0.651，見表1。

3.讀片時(shí)間比較：兩種不同的染色方法鏡檢每份痰涂片所用的時(shí)間不同，LED熒光顯微鏡鏡檢所用的時(shí)間明顯低于普通光學(xué)顯微鏡鏡檢所用時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5670.80，P<0.01)，見表2。

4. 熒光染色陽性涂片常溫避光保存情況：將LED熒光顯微鏡檢測(cè)的1179張陽性級(jí)別不同的熒光染色涂片放入不透光的玻片盒內(nèi)常溫(22～25 ℃)存放，并避免陽光直射，進(jìn)行4個(gè)月的連續(xù)觀察，其中1～9條/50個(gè)視野涂片82張，+級(jí)328張，++級(jí)202張，+++級(jí)282張，++++級(jí)285張。第1～4個(gè)月出現(xiàn)定性錯(cuò)誤[2]的依次為5張(0.42%；均為幾條菌)、13張(1.10%；均為幾條菌)、21張(1.78%；20張為幾條菌，1張為+級(jí))、27張(2.29%；25張為幾條菌，2張為++級(jí))。第1～4個(gè)月出現(xiàn)定量誤差[2]的依次為10張(0.85%)、33張(2.80%)、65張(5.51%)、72張(6.11%)。

表1 萋-尼染色法和熒光染色法以痰培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)效能

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%

表2 不同級(jí)別鏡檢結(jié)果應(yīng)用兩種染色方法顯微鏡檢查讀片時(shí)間的比較

注萋-尼染色顯微鏡檢查結(jié)果分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：陰性：連續(xù)觀察300個(gè)不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌；條數(shù)：1～9條/300個(gè)視野；+：3～9條/100個(gè)視野，連續(xù)觀察300個(gè)視野；++：1～9條/10個(gè)視野，連續(xù)觀察100個(gè)視野；+++：1～9條/1個(gè)視野；++++：≥10條/1個(gè)視野。熒光染色LED顯微鏡檢查結(jié)果分級(jí)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)：陰性：0條/50個(gè)視野；條數(shù)：1～9條/50個(gè)視野；+：10～49條/50個(gè)視野；++：1～9條/1個(gè)視野；+++：10～99條/1個(gè)視野；++++：100條及以上/1個(gè)視野

討 論

本研究在黑龍江省8個(gè)縣區(qū)級(jí)結(jié)防機(jī)構(gòu)進(jìn)行了熒光染色液LED熒光顯微鏡和萋-尼染色液普通光學(xué)顯微鏡鏡檢痰涂片效果的比較。結(jié)果顯示，LED熒光顯微鏡鏡檢陽性率高于普通光學(xué)顯微鏡鏡檢，與丁北川等[5]的研究結(jié)果一致。同時(shí)，其他研究也顯示LED熒光顯微鏡鏡檢陽性率較普通光學(xué)顯微鏡增加9%[1,7-11]。

兩種鏡檢方法分別以痰培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)， LED熒光顯微鏡鏡檢敏感度為66.72%，普通光學(xué)顯微鏡鏡檢的敏感度為61.46%，與尚美等[6]報(bào)道結(jié)果一致；兩種方法的特異度相當(dāng)。而文獻(xiàn)也曾報(bào)導(dǎo)LED熒光顯微鏡比普通光學(xué)顯微鏡鏡檢的敏感度有一定的提高，特異度基本無變化[1]。宋媛媛等[4]也報(bào)道LED熒光顯微鏡比普通光學(xué)顯微鏡鏡檢的敏感度有一定的提高。LED熒光顯微鏡鏡檢與痰培養(yǎng)的一致率為92.94%，大于普通光學(xué)顯微鏡鏡檢一致率，表明LED熒光顯微鏡鏡檢與固體培養(yǎng)法檢測(cè)效能更接近。

對(duì)LED熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡鏡檢不同級(jí)別陽性痰涂片和陰性痰涂片的讀片時(shí)間進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，兩種方法的鏡檢時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，前者比后者總體鏡檢時(shí)間縮短。這與宋媛媛等[4]報(bào)道的結(jié)果一致。

對(duì)所有熒光染色陽性痰涂片進(jìn)行連續(xù)4個(gè)月的常溫避光保存觀察，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移有部分陽性涂片出現(xiàn)褪色的情況，出現(xiàn)褪色的有27張，但1～9條/50個(gè)視野痰涂片褪色的有25張，+級(jí)痰涂片褪色的有2張，對(duì)++～++++陽性級(jí)別的痰涂片幾乎無影響。熒光隨著時(shí)間的推移會(huì)出現(xiàn)淬滅現(xiàn)象，可能由于不同的菌體對(duì)熒光淬滅的快慢不同造成。痰涂片內(nèi)含菌量越少淬滅的速度越快。由于只是部分陽性級(jí)別低的涂片會(huì)出現(xiàn)熒光消失，這對(duì)使用LED熒光顯微鏡進(jìn)行常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室工作和痰涂片保存及質(zhì)量控制影響并不大。

經(jīng)過本次研究可以發(fā)現(xiàn)，LED熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡鏡檢相比敏感度有一定提高，特異度相當(dāng)；同時(shí)，LED熒光顯微鏡鏡檢可以提高痰涂片檢測(cè)的陽性率，并大幅度降低了閱片時(shí)間，減輕實(shí)驗(yàn)室人員的工作量。但值得注意的是，沒有閱讀熒光顯微鏡經(jīng)驗(yàn)的人員最好經(jīng)過系統(tǒng)性的培訓(xùn)，并在有經(jīng)驗(yàn)人員的協(xié)助下進(jìn)行閱片。在痰涂片質(zhì)量保證方面，由于北方溫度和濕度沒有南方高，只要避免陽光直射，直接將痰涂片放在不透明的玻片盒內(nèi)室溫保存，在進(jìn)行盲法質(zhì)量控制檢查出現(xiàn)定性錯(cuò)誤時(shí)對(duì)錯(cuò)誤的痰涂片進(jìn)行重新脫色復(fù)染即可。

綜上，LED熒光顯微鏡鏡檢不僅可提高檢測(cè)速度、檢測(cè)陽性率、對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員的要求不高、操作簡單，且儀器設(shè)備價(jià)格較為低廉，適合在基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行推廣。