組蛋白去乙?；敢种苿㎎NJ-26481585抗食管癌活性及其作用機制研究

鐘 磊，師健友，白 蘭

(1. 四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院藥學部；2. 電子科技大學附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院個體化藥物治療四川省重點實驗室，四川 成都 610072)

食管癌是最常見的惡性腫瘤之一，在中國人群中的致死率位居所有腫瘤的第5位[1]。大部分食管癌患者在發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，化療是這類病人的主要治療手段。近年來，有關食管癌治療靶點和藥物的研究已取得了不少進展，然而，食管癌患者預后仍然較差，發(fā)現(xiàn)有效的治療靶點和藥物仍是食管癌治療亟待解決的問題。

組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs)在多種類型的腫瘤中過表達，其表達量與腫瘤預后密切相關，被認為是多種腫瘤的治療靶點[2-4]。Nakagawa等[5]研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1/2/3/8在食管癌組織中的表達量要明顯高于正常組織；一項系統(tǒng)性評價和Meta分析的研究也顯示，胃腸道腫瘤的病人，包括食管癌患者，HDAC1表達水平與病人預后密切相關，較低的HDAC1表達量意味著較好的存活率[6]。由此可見，HDACs也是治療食管癌的潛在靶點。本研究探討了一種高活性的pan-HDAC抑制劑JNJ-26481585的抗食管癌作用及其部分作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 食管癌細胞株TE-1，購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.1.2藥物與試劑 JNJ-26481585、順鉑(cis-dichlorodiammineplatinum，DDP)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，購自美國Selleck公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶、MTT、結晶紫、DMSO，購自Sigma公司；胎牛血清，購自Corning公司；EdU增殖檢測試劑盒Cell-LightTMEdu Apollo 567 In Vitro Kit，購自廣州銳博生物科技有限公司；Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒，購自江蘇凱基生物技術有限公司；Ac-H3K9、P21抗體，購自英國Abcam公司；p-Akt、Akt、p-ERK、ERK抗體，購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3儀器 Heraeus BB15型細胞培養(yǎng)箱、Multiscan MK3酶標儀(美國ThermoFisher公司)；BHC-1000IIA/B3型生物安全柜(蘇凈安泰生物技術有限公司)；IX50型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國Becton Dicknson公司)；JY300C型電泳儀(北京君意東方電泳儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1MTT檢測細胞活力 在96孔板接種TE-1細胞，次日加入濃度為10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003 μmol·L-1的JNJ-26481585、DDP和5-FU處理細胞72 h，每個濃度設3個復孔。隨后加入20 μL濃度5 g·L-1的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，再加入50 μL濃度為200 g·L-1的酸性SDS溶液溶解甲臜過夜，最后采用酶標儀于570 nm波長檢測吸光度值。根據(jù)公式(X/C)×100%計算經(jīng)藥物處理后腫瘤細胞的存活率，其中，C和X分別代表溶劑對照組和藥物處理組的平均吸光度值，使用Graphpad Prism軟件做細胞存活率-藥物濃度曲線圖。

1.2.2克隆形成實驗 在12孔板接種TE-1細胞，每孔5000個。次日加入JNJ-26481585(1、0.1、0.01 μmol·L-1)處理細胞，2～3 d換液1次。作用10 d后棄上清，用甲醇固定細胞15 min，再用0.25%的結晶紫染液染色。

1.2.3EdU檢測細胞增殖 96孔板接種細胞，每孔8 000個。次日加入JNJ-26481585(1、0.3、0.1 μmol·L-1)處理細胞24 h，并設置溶劑對照組。后續(xù)EdU標記增殖細胞，按照試劑盒說明書進行。

1.2.4細胞周期檢測 6孔板接種細胞，次日加入JNJ-26481585(1、0.3、0.1 μmol·L-1)處理細胞24 h。收集細胞，并采用70%乙醇固定過夜，加入50 mg·L-1碘化丙啶(PI)、100 mg·L-1RNase和0.1% Triton X-100在暗處作用30 min，隨后上流式細胞儀檢測。

1.2.5Annexin V/PI染色檢測細胞凋亡 按“1.2.4”項方法接種和處理細胞，隨后按照試劑盒操作說明，向每管加入500 μL Binding buffer重懸細胞，再依次分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI，混勻，室溫避光反應5～15 min，及時上流式細胞儀檢測。

1.2.6劃痕實驗 24孔板接種細胞，待細胞融合度達80%左右時，用滅菌黃槍尖在每孔均勻劃痕，并加入JNJ-26481585(1、0.3、0.1 μmol·L-1)處理細胞。對照組細胞愈合時結束實驗，在倒置顯微鏡下拍照。

1.2.7Transwell細胞侵襲檢測 將Transwell小室插入24孔板，并鋪上一層按1 ∶6比例稀釋的基質膠。待基質膠凝固后，在小室內接種細胞，并加入無血清培養(yǎng)基稀釋的JNJ-26481585或溶劑對照共同孵育，小室外孔內加入含血清的完全培養(yǎng)基。24 h后用甲醇固定小室底部侵襲的細胞，再用0.05%結晶紫染色。

1.2.8Western blot實驗 收集經(jīng)JNJ-26481585處理18 h 后的TE-1細胞，RIPA裂解，超聲，提取總蛋白。采用SDS-PAGE分離蛋白，并轉至PVDF膜，脫脂奶粉封閉2 h，加入1 ∶1 000稀釋的一抗4 ℃孵育過夜。次日，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育1 h，隨后洗去過量抗體，加入顯影液曝光。

2 結果

2.1JNJ-26481585抑制TE-1細胞活力JNJ-26481585的結構見Fig 1A，采用MTT法檢測其對食管癌細胞TE-1活力的影響。如Fig 1B所示，JNJ-26481585可有效抑制TE-1細胞活力，且抑制作用具有濃度依賴性，IC50值為0.073 μmol·L-1。DDP和5-FU作為臨床食管癌化療一線用藥，對TE-1細胞的IC50均大于10 μmol·L-1，活性弱于JNJ-26481585。進一步采用克隆形成實驗檢測JNJ-26481585對TE-1細胞生長的影響，F(xiàn)ig 1C結果顯示，在0.1 μmol·L-1及以上濃度時，JNJ-26481585可明顯抑制TE-1細胞生長，無明顯細胞克隆產(chǎn)生。

2.2JNJ-26481585抑制TE-1細胞增殖進一步采用EdU染色檢測JNJ-26481585對TE-1細胞增殖的影響，EdU(紅色熒光)標記增殖活力強的細胞。如Fig 1D所示，藥物處理組EdU標記的細胞明顯少于溶劑對照組，表明JNJ-26481585具有較強的抗細胞增殖活性。

2.3JNJ-26481585誘導G2/M期細胞周期阻滯Fig 2A的流式細胞術檢測結果顯示，經(jīng)JNJ-26481585處理的食管癌細胞，處于G2/M期的細胞數(shù)量隨著藥物濃度的增加而逐漸增多，在較低濃度(0.1 μmol·L-1)時即可明顯誘導TE-1細胞G2/M期阻滯。

2.4JNJ-26481585誘導TE-1細胞凋亡如Fig 2B所示，與溶劑對照組相比，藥物處理組均可明顯增加Annexin V陽性的凋亡細胞數(shù)，表明JNJ-26481585還可通過促進細胞凋亡來抑制食管癌細胞的生長。

2.5JNJ-26481585抑制TE-1細胞遷移和侵襲HDAC的異常表達與腫瘤轉移密切相關，為進一步評估JNJ-26481585對食管癌細胞轉移的影響，對藥物處理前后，TE-1細胞的遷移和侵襲(腫瘤轉移中的兩個關鍵環(huán)節(jié))能力進行了檢測。如Fig 3所示，JNJ-26481585可劑量依賴性地抑制劃痕的愈合和TE-1細胞侵襲穿過基質膠，表明JNJ-26481585還具有較強的抗轉移活性。

Fig 1 JNJ-26481585 inhibited growth of TE-1 cells in n=3)

A: Structure of JNJ-26481585; B: Anti-viability assay of JNJ-26481585, DDP and 5-FU against TE-1 cells. The ordinate represents the survival rate of tumor cells; C: Long-term colony formation assay of JNJ-26481585-treated TE-1 cells; D:Edu cell proliferation assay on TE-1 cells after treatment with 1 μmol·L-1JNJ-26481585 for 24 h.**P<0.01vscontrol.

Fig 2 JNJ-26481585 induced G2/M phase arrest and apoptosis in TE-1 n=3)

A: Influence of JNJ-26481585 on cell cycle progression in TE-1 cells. The statistical analysis of cell cycle is presented on the right; B: Apoptosis detection was performed using Annexin V/PI co-staining, and the percentage of Annexin V-positive cells is quantified for apoptotic rate statistics.**P<0.01vscontrol.

2.6JNJ-26481585的抗食管癌分子機制Fig 4的Western blot結果顯示，JNJ-26481585可明顯增加HDAC底物H3K9的乙?；健Ｗ鳛榧毎芷谝种苿?，p21表達量在腫瘤細胞中受到表觀調控而降低[7]，而經(jīng)JNJ-26481585處理的TE-1細胞，p21表達水平明顯提高。此外，JNJ-26481585還可明顯抑制Akt和ERK的磷酸化，這兩個蛋白分別是PI3K/mTOR和MAPK信號通路中的關鍵蛋白，與腫瘤細胞的凋亡和增殖密切相關。

Fig 3 JNJ-26481585 inhibited migration and invasion of TE-1 cells in n=3)

A: The representative images (×20) from vehicle and 1 μmol·L-1JNJ-26481585 treated groups in wound healing assay. The number of migrated cells is used for statistics and quantified by manual counting; B: The representative images (×20) from vehicle and 1 μmol·L-1JNJ-26481585 treated groups in Transwell invasion assay. The number of invaded cells is counted for statistics.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

Fig 4 The anti-esophageal cancer molecular mechanisms of JNJ-26481585

TE-1 cells were treated with JNJ-26481585 or vehicle control for 18 h, then cells were lysed and the proteins were analyzed by immunoblot.

3 討論

越來越多的證據(jù)顯示，除了基因突變外，表觀遺傳調控也參與了腫瘤的發(fā)生和進展[8-9]。HDACs作為一類重要的表觀遺傳修飾酶，參與了多種組蛋白和非組蛋白底物的去乙酰化修飾，其異常激活與多種腫瘤的進展和預后密切相關，被認為是治療腫瘤的潛在靶點。目前，已有多種HDACs抑制劑被批準上市，用于T細胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的治療，包括伏立諾他、羅米地辛、貝林司他、西達本胺、帕比司他等[10-11]。然而，由于藥物本身的活性和藥代動力學性質等原因，大部分HDACs抑制劑在實體瘤治療中的療效并不令人滿意。本研究所使用的JNJ-26481585是一種高活性的pan-HDAC抑制劑，對I型HDAC酶均有較高的抑制活性，且具有較好的藥代動力學性質，在實體瘤治療中具有一定優(yōu)勢[12]。本文的研究結果也顯示，JNJ-26481585在較低濃度時即可明顯抑制食管癌細胞的活力和增殖，誘導細胞G2/M期阻滯和細胞凋亡，此外，還具有抑制細胞遷移和侵襲的作用，顯示了較強的抗食管癌活性。

HDACs可調控組蛋白和多種非組蛋白底物的去乙?；?，故HDACs抑制劑的抗腫瘤分子機制較復雜，不同的HDACs抑制劑在不同的腫瘤類型中抗腫瘤作用機制也有差異。大量研究顯示，HDAC1可特異性沉默細胞周期抑制劑p21[7,12]，抑制HDACs可以阻斷多種腫瘤生長相關信號通路，如Akt/mTOR、MAPK/ERK等[13-14]。因此，本研究主要檢測了JNJ-26481585對p21表達和這兩條腫瘤細胞生長依賴的信號通路的影響。結果顯示，JNJ-26481585在較低濃度即可明顯上調p21表達水平，并抑制PI3K/mTOR和MAPK通路中的關鍵蛋白Akt和ERK的磷酸化。這一結果表明JNJ-26481585的抗食管癌作用涉及到多種分子機制，上調p21，以及抑制Akt/mTOR、ERK信號在其中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究報道了一種高活性的pan-HDAC抑制劑JNJ-26481585的抗食管癌作用及其作用機制，JNJ-26481585可通過上調細胞周期抑制劑p21表達，以及抑制Akt/mTOR、ERK信號通路，進而抑制食管癌細胞的生長。