人參皂苷Rg3對糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面表皮細胞及血管新生的影響

李靜平，顧 雯，倪藝榕，柯 瑾

(1. 云南中醫(yī)藥大學中藥學院，云南 昆明 650500；2. 華南師范大學生物光子學研究院，廣東 廣州 510631)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)創(chuàng)面難愈與糖代謝障礙關系密切，是臨床常見、治療棘手的并發(fā)癥。其發(fā)病機制目前尚未完全清楚，DM是一個多因素、多環(huán)節(jié)參加的復雜病理過程，形成經(jīng)久不愈的頑固性潰瘍、易感染等一系列糖尿病皮膚病變。嚴重影響患者生活質(zhì)量，耗費大量醫(yī)療資源和資金[1]，臨床亟待低毒、高效的治療方法及藥物。

前期臨床及動物實驗中，我們發(fā)現(xiàn)以傳統(tǒng)抗腫瘤、抗疲勞、提高免疫等為主要活性的天然藥物人參皂苷Rg3，能促進DM皮損患者及糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面模型的皮損修復，且愈合良好。Rg3可有效改善創(chuàng)面炎癥細胞浸潤、促進肉芽組織形成、縮短愈合時間、提高創(chuàng)面愈合率[2]。其修復DM皮損作用是獨立于傳統(tǒng)藥效之外的額外收益，值得深入探索。本研究擬在前期初步藥效基礎上，探索Rg3對DM難愈創(chuàng)面大鼠表皮細胞(厚度及增殖周期)和創(chuàng)面血管新生的影響，為其修復DM難愈創(chuàng)面的機制研究奠定基礎。

1 材料

1.1實驗動物♂ SD大鼠，體質(zhì)量(180～200) g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-030，動物合格證號：51203500004561，購自由成都達碩實驗動物有限公司。

1.2藥物與試劑Rg3(純度98.2%)，由中國科學院昆明植物研究所植物化學研究室提供；氨基胍(aminoguanidirig，AG)，購自昆明市泉港生物科技有限公司。鏈脲佐菌素(streptozocin， STZ)、Dispase Ⅱ分散酶(貨號：4010ES60)，美國Sigma公司；蘇木精、伊紅(貨號：C0105-1)，碧云天生物公司；CD31抗體(貨號：555025)，BD公司；二抗孵育試劑盒(貨號：PV-9000)、DAB試劑盒(貨號：ZLI-9018)，中杉金橋科技；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，索萊寶公司，貨號：C1010。

1.3儀器SQ2125切片機(Leica公司)；Lab.A1光學正置顯微鏡(蔡司公司)；GHP-9050N隔水式培養(yǎng)箱(Thermo公司)；CytoFLEX流式細胞儀(Beckman Coulter公司)。

2 方法

2.1動物模型的建立及實驗分組Ⅱ型DM模型建立[3-4]：大鼠高脂飼料喂養(yǎng)4周，一次性腹腔注射低劑量STZ 40 mg·kg-1(0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液配制，pH 4.4)；正常組腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。72 h后測空腹血糖及血清中胰島素水平，并采用HOMA法計算胰島素敏感指數(shù)，胰島素敏感指數(shù)=22.5/(空腹血糖×胰島素)?？崭寡恰?6.0 mmol·L-1及胰島素敏感指數(shù)≤正常動物均值，為造模成功，有待進一步造難愈傷口模型。將上述DM大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、Rg3高、低劑量組、AG組，另設正常組。Rg3組分別灌胃Rg3 15、5 mg·kg-1；AG組灌胃10 mg·kg-1；模型組、正常組給予等劑量生理鹽水，每日1次。

AG為一種小分子親核性肼類化合物，是目前研究最多的一種糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)抑制劑。大量體外及動物實驗表明，其與葡萄糖中間體，如二羰基化合物相互作用，抑制糖基化和AGEs的生成及長期高血糖狀態(tài)下AGEs介導的組織損害[5]。因本項目擬研究Rg3改善皮膚局部AGEs蓄積，調(diào)節(jié)由AGEs直接介導的皮膚組織自身細胞或基質(zhì)功能不良，促進DM皮損修復的作用機制，故將AG作為陽性對照藥。

難愈傷口模型的建立：給藥4周后，各組動物背部皮膚全層等面積切除，造創(chuàng)面模型。戊巴比妥鈉按體質(zhì)量45 mg·kg-1腹腔注射麻醉，背部剃毛，自制無菌的直徑2 cm圓形硬紙片在脫毛處作標記，剪除全層皮膚。術后每只動物單籠喂養(yǎng)，期間各實驗組繼續(xù)給藥直至取材。

2.2檢測指標及方法

2.2.1動物處理及標本采集 傷后21 d，分別每組斷頸處死大鼠，取新鮮創(chuàng)緣皮膚組織，①HE染色，觀察皮膚組織形態(tài)學改變；②Image J圖像分析軟件測量真皮層和表皮層厚度；③消化后分離表皮與真皮，流式細胞儀檢測表皮細胞增殖周期，用Lysis軟件分析細胞周期；④以抗血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子(CD31)單克隆抗體，對皮膚樣本進行免疫組化染色，Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件計算陽性染色區(qū)域占視野面積的百分比，反映血管生成情況。

2.2.2創(chuàng)面皮膚組織HE染色觀察 取創(chuàng)緣皮膚組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察創(chuàng)面組織炎癥反應、膠原改變、壞死組織存留，以及脫落、新生上皮匍行等形態(tài)學變化。

2.2.3皮膚組織表皮層和真皮層厚度測量 HE染色后，鏡檢拍照，經(jīng)Image J圖像分析軟件數(shù)據(jù)分析，測量大鼠表皮層和真皮層厚度。

2.2.4表皮細胞增殖周期檢測 新鮮樣本離體后，剪去皮下組織，修剪成直徑0.5 cm的皮塊，經(jīng)Dispase Ⅱ消化后，分離表皮及真皮，離心取上清液，0.1 mol·L-1PBS+10% FBS終止反應，流式細胞儀檢測，Lysis軟件分析表皮細胞周期。

2.2.5CD31表達率檢測 免疫組化法檢測DM全層皮膚損傷大鼠創(chuàng)面皮膚組織CD31蛋白的表達率，反映新生血管形成情況。4%多聚甲醛固定皮膚樣本，石蠟包埋切片，抗原修復，滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，滴加鼠抗人CD31一抗(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，滴加二步法免疫組化檢測試劑的二抗(1 ∶100)，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，DAB顯色5 min，蘇木精復染，37 ℃孵育5 min，鹽酸酒精分化1～3 s，封片，免疫熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并采集圖片，用Image-Pro Plus6.0軟件分析陽性染色區(qū)域的強度并量化：每張圖片取3個高倍視野，統(tǒng)計后求平均值，平均陽性細胞率=陽性區(qū)域面積/總面積×100%。

3 結(jié)果

3.1創(chuàng)面皮膚組織形態(tài)學改變?nèi)鏔ig 1所示，正常組傷后21 d的創(chuàng)面表皮完全再生，無殘留創(chuàng)面，可見大量呈紡錘形成纖維細胞，膠原排列整齊，規(guī)則，真皮層可見大量毛細血管。與正常組比較，模型組皮膚菲薄，成纖維細胞少且無明顯增殖，表皮細胞層次少，真皮層膠原明顯水腫，皮下脂肪消失；創(chuàng)面炎性細胞較多，且浸潤緩慢而持久，壞死組織脫落及創(chuàng)面肉芽組織形成緩慢，新生血管形成較少。與模型組比較，AG組創(chuàng)面上皮組織覆蓋較多，成纖維細胞增加，細胞增殖明顯，表皮及真皮均一定程度增厚，見清晰的表皮細胞結(jié)構，膠原較多且排列較整齊，炎癥細胞減少，壞死組織脫落，出現(xiàn)創(chuàng)緣細胞匍行，新生血管數(shù)量較多，肉芽組織較厚。Rg3高、低劑量組大多創(chuàng)面上皮組織完全覆蓋，表皮增厚，表皮細胞層次清晰，真皮層增厚，成纖維細胞較多，膠原較多且排列較整齊。Rg3低劑組有一定的細胞增加和表皮增厚作用，但較高劑組不明顯。Rg3高、低劑量組創(chuàng)面炎癥細胞明顯減少，壞死組織形成脫落較早，創(chuàng)緣細胞匍行出現(xiàn)較早，真皮下毛細血管較多，肉芽組織形成較厚。

Fig 1 Wound skin tissue on 21st day after injury(HE×100)

A：Control; B：Model; C：AG; D：Rg3 low dose; E：Rg3 high dose.

3.2表皮層和真皮層厚度比較Tab 1結(jié)果顯示，模型組表皮及真皮較正常組變薄(P<0.01)，Rg3組表皮、真皮厚度較模型組明顯增厚(P<0.01)。

Tab 1 Thickness of epidermis and

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

3.3表皮細胞增殖周期變化模型組較正常組G0/G1期比例明顯升高(P<0.01)，對應的G2/M、S期比例降低(P<0.01)，提示模型組動物表皮細胞周期停滯于DNA準備期，細胞增殖減慢。AG組G0/G1期比例較模型組有所下降，S、G2/M期比例有升高趨勢(P<0.05)，表明AG可能通過抑制AGEs而促進表皮細胞增殖。Rg3高、低劑量組較模型組G0/G1期比例下降，且高劑量組下降明顯(P<0.05)，S、G2/M期比例升高(P<0.05，P<0.01)，提示Rg3可有效改善DM創(chuàng)面皮膚表皮細胞增殖異常狀況，高劑量組效果較明顯(Fig 2、Tab 2)。

GroupG0/G1SG2/MControl66.6±0.730.3±0.93.1±0.6Model85.1±0.5??12.7±0.4??2.2±0.1AG79.9±0.6#18.0±0.6#1.7±0.2Rg3 low dose82.5±2.013.6±0.4#1.6±0.1Rg3 high dose72.8±0.4##25.1±1.1##3.9±0.2#

*P<0.05,**P<0.01vscontrol,#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.4創(chuàng)面組織CD31的表達如Fig 3所示，模型組創(chuàng)面CD31蛋白表達率明顯低于正常組(P<0.01)，AG組和Rg3高劑量組CD31蛋白表達高于模型組(P<0.05)。

4 討論

DM患者最大的威脅來自并發(fā)癥，也是DM治療中尤為重要的部分。其中，DM自發(fā)性皮膚損傷(如DM潰瘍、DM性水皰等)或外源性創(chuàng)傷所致皮膚創(chuàng)面難愈，成為患者最常見、嚴重的并發(fā)癥之一。美國創(chuàng)面協(xié)會資料顯示，約70% DM皮膚難愈創(chuàng)面患者即使經(jīng)過6個月治療和護理，仍無明顯改善[6]。因此，尋求治療的新策略和新藥物既是全球性的挑戰(zhàn)，也有利于節(jié)約相關醫(yī)療資源。

Fig2Epidermalcellproliferationcycleinrats

A：Control; B：Model; C：AG; D：Rg3 low dose; E：Rg3 high dose.

Fig 3 Expression of CD31 in rat skin tissues(×100)

A：Control; B：Model; C：AG; D：Rg3 low dose; E：Rg3 high dose.**P<0.01vscontrol,#P<0.05vsmodel.

Rg3是存在于天然藥物人參或三七中的一種四環(huán)三萜皂苷，具有抗腫瘤、抗疲勞、舒張血管、提高免疫力等多種藥理活性[7]，但從未有過其在皮損修復方面的相關活性報道。前期臨床及實驗證實，Rg3對DM難愈創(chuàng)面有修復作用，能提高愈合率、縮短愈合時間[2]。本研究意在深入探討其修復DM皮損的作用機制，以期發(fā)現(xiàn)其獨立于傳統(tǒng)抗癌活性以外的新藥效。

與以往的報道一致[8]，本實驗HE染色發(fā)現(xiàn)，模型組較正常組皮膚菲薄，表皮細胞層次少，真皮層膠原水腫，伴不同程度的炎癥細胞浸潤，皮下脂肪消失。Rg3組創(chuàng)面炎癥反應帶消退，炎癥細胞明顯減少，血管增生、肉芽組織形成及膠原較多，創(chuàng)緣細胞匍行出現(xiàn)較早。用藥后大鼠真皮及表皮層厚度均增厚，提示Rg3可部分逆轉(zhuǎn)皮膚病理改變，一定程度上改善DM皮膚的易損狀態(tài)。另外，皮膚細胞保持著一定的增殖率，以維持正常新陳代謝需要和表皮結(jié)構完整[9]。檢測表皮細胞周期發(fā)現(xiàn)，模型大鼠表皮細胞停滯于G0/G1期(DNA準備期)比例升高，S期(DNA合成期)的比例及G2/M期(有絲分裂期)比例明顯低于正常組。提示在DM狀態(tài)下，皮膚表皮細胞的增殖生物學行為受擾，不能有效、有序地完成細胞增殖，從而成為皮膚菲薄的細胞生物學基礎之一。Rg3組G0/G1期比例下降，S、G2/M期比例升高，提示其能抑制表皮細胞生長停滯期，激活增殖期，進而改善創(chuàng)面皮膚異常的表皮細胞增殖，有利于創(chuàng)面愈合。

患者糖代謝障礙所致糖蛋白沉積于血管內(nèi)皮，引起血管基底膜增厚，可導致微循環(huán)障礙。血管病變加之神經(jīng)病變、免疫功能低下等多因素，促使DM皮膚創(chuàng)面易反復感染[10]。同時，創(chuàng)面愈合過程涉及炎癥反應、肉芽組織形成等方面，而肉芽組織形成是創(chuàng)面愈合的關鍵階段，其可修復創(chuàng)面組織缺損，清除壞死組織[11]。新生血管有助于氧氣和養(yǎng)料供應，促進肉芽組織形成。新生血管越多，肉芽組織生長越快，則創(chuàng)面愈合時間縮越短[12]。CD31蛋白主要表達于血管內(nèi)皮細胞中，是新生血管形成的重要標志。由CD31標記的新生微血管密度是目前公認的評價血管形成的標準。創(chuàng)面修復過程中，CD31能客觀、直接地反映創(chuàng)面血管生成及愈合程度。結(jié)果表明，Rg3高劑組創(chuàng)面CD31陽性表達率高于模型組，提示其修復糖尿病性皮損可能與促進創(chuàng)面血管生成有關。但有文獻報道，Rg3在抗腫瘤研究中，有抑制腫瘤異常血管生成的作用，以實現(xiàn)抗腫瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移目的[13]。此報道有異于本研究結(jié)果，我們研究表明Rg3可促進糖尿病皮膚損傷創(chuàng)面血管生成而修復皮損。這可能是其獨立于其傳統(tǒng)抗腫瘤藥效之外的額外收益，即“老藥新用”。不同研究提示，Rg3對血管生成方面的作用值得深入探索，可能因疾病、機體組織及狀況而異，呈現(xiàn)抑制或促進的不同活性。

本研究證實Rg3能抑制創(chuàng)面皮膚病理變化，增加皮膚表皮及真皮厚度，改善表皮細胞增殖周期異常狀況，促進創(chuàng)面血管新生，為該藥物在修復DM難愈創(chuàng)面方面的機制研究奠定了基礎。

(致謝：感謝昆明市代謝性疾病中醫(yī)藥防治研究中心、云南中醫(yī)學院劉昌孝院士工作站及動物實驗中心為本研究提供科研場所和儀器。謹向全體課題組成員及同學表示衷心感謝！同時也感謝中國科學院昆明植物研究所植化研究室提供實驗用藥及幫助。)